BAB III
METODOLOGI PENELITIAN
A. Metode Penelitian
Metode yang digunakan dalam penelitian ini merupakan metode eksperimen secara laboratorium. Pekerjaan yang dilakukan yaitu pengembangan dan validasi metode pengujian multi-residu pestisida pada biji kakao berdasarkan metode EN 15662:2008 dan analisis dengan LC-MS/MS. Parameter validasi yang ditentukan pada penelitian ini adalah linearitas, batas kuantisasi (LOQ), spesifisitas, akurasi, dan presisi (RSDr).
B. Tempat dan Waktu penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Residu Pestisida, Balai Pengujian Mutu Barang (BPMB), Kementerian Perdagangan pada bulan Januari hingga Maret 2014.
C. Alat dan Bahan
1. Alat-alat yang digunakan Peralatan yang digunakan pada penelitian ini antara lain :
a. LC-MS/MS System : Applied Biosystem Sciex 3200 QTRAP Triple Quadrupole Mass Spectrometry dengan Shimadzu Binary Ultra Fast Liquid Chromatography (UFLC).
b. Neraca (Sartorius CPA224S), c. Flask Shaker (Gallenkamp SGL700), d. Refrigerated centrifuge (Tomy MX-207), e. Syringe,
f. PTFE (Poli Tetra Fluor Etilen) - syringe filters 0,45 µm, g. Tabung centrifuge,
2. Bahan-bahan yang digunakan a. Reagen
Semua reagen yang digunakan dalam penelitian ini mempunyai derajat kemurnian Analytical Grade :
1) Asetonitril (99,8%, Merck), 2) Asam Asetat (98%, Merck), 3) Asam Format (96%, Merck),
4) Air bebas ion yang diperoleh menggunakan Milli Q (Millipore, USA) water purification system.
5) QuEChERS extract pouch : 4 g MgSO4; 1 g NaCl; 1 g Na3C6H5O7.2H2O; 0.5 g
Na2C6H6O7.1,5H2O.
6) QuEChERS Fatty-dispersive SPE : PSA 150 mg, MgSO4 900 mg, C18EC 150
mg.
b. Standar pestisida yang digunakan antara lain:
1) Insektisida golongan organofosfat : Diazinon (99%, Chem Service), Dichlorvos (99%, Chem Service), Dimethoate (99%, Chem Service), Ethion (99%, Chem Service), Fenthion (99%, Chem Service), Chlorpyrifos (99%, Chem Service), Malathion (99%, Chem Service), Metidation (99%, Chem Service), Profenofos (99%, Chem Service).
2) Insektisida golongan karbamat : Carbaryl (99%, Chem Service), Carbofuran (99%, Chem Service), dan Propoxur (99%, Chem Service).
3) Insektisida golongan nikotinoid : Imidachlorpid (99%, Chem Service). 4) Insektisida golongan pyrazol : Fipronil (99%, Sigma - Aldrich).
5) Herbisida : Ametryn (98%, Chem Service), Diuron (99%, Chem Service), 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (99%, Chem Service).
6) Fungisida : Propiconazol (99%, Sigma - Aldrich).
c. Internal standar yang digunakan adalah triphenyl phosphate (TPP) (Agilent). d. Contoh biji kakao, berasal dari eksportir di Provinsi Bali. Contoh diambil oleh
petugas pengambil contoh (PPC) di Balai Pengujian Mutu Barang (BPMB) sesuai dengan pedoman pengambilan contoh padatan SNI 19-0428-1998.
D. Prosedur Penelitian
1. Pembuatan larutan standar
Larutan stok standar masing-masing pestisida dibuat dengan menimbang sebanyak 5 ± 0.01 mg masing-masing standar analisis pestisida ke dalam labu takar 5 ml dan kemudian dilarutkan dan ditempatkan hingga tanda batas menggunakan asetonitril. Larutan stok standar dari masing-masing pestisida kemudian disimpan dalam refrigerator pada suhu -4oC. Larutan stok standar kemudian diencerkan menggunakan asetonitril untuk memperoleh standar kerja 10 mg/l. Larutan standar kerja ini digunakan untuk proses spike (fortifikasi) contoh. Selain itu, larutan standar kerja 10 mg/l digunakan untuk pembuatan larutan standar campuran 1 mg/l, yang dibuat dengan melarutkan dan mencampur larutan standar kerja 10 mg/l dari masing-masing pestisida menggunakan asetonitril. Larutan standar ini kemudian digunakan untuk membuat deret standar.
Deret standar dibuat dalam dua kondisi yang berbeda yaitu deret standar dalam solvent dan matrix-matched calibration standard, keduanya dibuat pada rentang 1-100 µg/l sebanyak 8 titik (1; 2,5; 5; 10; 20; 40; 80; 1-100 µg/l). Khusus untuk pestisida diazinon deret standar dibuat sebanyak 10 titik pada rentang 0,1-100 µg/l (0,1; 0,5; 1; 2,5; 5; 10; 20; 40; 80; 100 µg/l). Deret standar dalam solvent dibuat dengan melarutkan larutan standar campuran 1 mg/l menggunakan asetonitril, sedangkan untuk matrix-matched calibration standard dibuat dengan melarutkan larutan standar 1 mg/l menggunakan matriks contoh biji kakao.
2. Preparasi Sampel a. Ekstraksi
Sebanyak 1 kg contoh biji kakao dihaluskan dan disaring menggunakan saringan dengan ukuran 150 mesh dan ditambahkan air dingin dengan perbandingan 1:2 (b/b) sampai terbentuk bubur. Kemudian ditimbang sebanyak 10 g bubur contoh biji kakao ke dalam tabung centrifuge 50 ml.
Penentuan nilai recovery, dilakukan dengan proses spike pada 3 titik konsentrasi. Proses spike dilakukan dengan menambahkan larutan standar kerja ke
dalam contoh biji kakao yang telah di preparasi terhadap masing-masing pestisida dengan besar konsentrasi 15 g/kg, 25 g/kg , dan 50 g/kg.
Kemudian ditambahkan 10 ml 0,1% asam asetat dalam asetonitril, dan ceramic homogenizer yang berfungsi untuk meratakan pencampuran, dikocok selama 1 menit. Setelah itu, ditambahkan campuran garam QuEChERS (4 g MgSO4; 1 g NaCl; 1 g Na3C6H5O7.2H2O; 0.5 g Na2C6H6O7.1,5H2O). Kemudian dikocok
selama 5 menit menggunakan shaker. Setelah itu dilakukan sentrifugasi selama 10 menit pada 5000 rpm dan suhu 14oC. Ekstrak contoh kemudian didekantasi ke dalam tabung centrifuge 10 ml dan simpan di dalam refrigerator selama semalaman.
b. d-SPE Clean-up
Sebanyak 4 ml ekstrak contoh yang sebelumnya telah didiamkan semalam dimasukkan ke dalam tabung Fatty-Dispersive SPE yang telah berisi PSA 150 mg, MgSO4 900 mg, C18EC 150 mg, kemudian dikocok selama 5 menit menggunakan
shaker. Setelah itu disentrifugasi selama 10 menit pada 5000 rpm dan suhu 14oC. Kemudian diambil sebanyak 1 ml larutan contoh menggunakan syringe dan disaring dengan PTFE syringe filters dengan ukuran 0,45 µm. Setelah itu dipindahkan ke dalam vial 1,5 ml untuk selanjutnya dilakukan pengukuran menggunakan LC-MS/MS.
3. Instrumentasi LC-MS/MS
a. Kondisi LC-MS/MS pada penelitian ini adalah sebagai berikut :
1) LC-MS System : Shimadzu Binary Ultra Fast Liquid Chromatography (UFLC).
2) Detektor : Spektrofotometer massa 3200 Qtrap (Applied Biosystem Sciex 3200 QTRAP Triple Quadropole Mass Spectrometry). (ESI) source yang dioperasikan pada mode ion negatif untuk 2,4-dichlorophenoxyacetic acid dan fipronil serta mode ion positif untuk pestisida lainnya. Data diperoleh dengan menggunakan mode Multiple Reaction Monitoring (MRM).
3) Kolom : Kolom fasa terbalik C18 dengan panjang kolom 50 mm, diameter dalam kolom 4,6 mm (Agilent).
4) Laju alir : 0,4 ml/menit. 5) Volum inject : 20 µl.
6) Fasa gerak : Fasa gerak A adalah air yang mengandung 0,1% asam formiat, dan Fase gerak B adalah asetonitril yang mengandung 0,1% asam formiat.
7) Kondisi optimum spektroskopi massa pada penelitian ini dilakukan dengan mode Multiple Reaction Monitoring (MRM) pada polaritas negatif ESI(-) untuk fipronil dan 2,4-dichlorophenoxyacetic acid, dan polaritas positif ESI(+) pada 16 pestisida lainnya. Adapun hasil optimasi parameter untuk kuantifikasi dan konfirmasi sebagai berikut :
Tabel.1 Parameter-parameter untuk kuantifikasi dan konfirmasi LC-ESI-MS/MS Analit Q1 Mass (amu) Q3 Mass (amu) DP (volt) EP CEP CE CXP Imidachlorpid 256,1 175 15 5 17,314 25 4 208,9 15 5 17,314 21 4 Metidation 302,9 145,1 15 5 18,624 15 4 85,1 15 5 18,624 27 4 Ametryn 208,1 116 11 2 15,97 11 4 88,9 11 2 15,97 20 3,5 Carbaryl 202,1 145,1 31 10 15,802 16 4 127,1 31 10 15,802 39 4 Carbofuran 222,1 165,2 30 10 16,362 17 3 123 30 10 16,362 29 3 Propoxur 210,1 111 21 10 16,026 19 4 168,1 21 10 16,026 11 4 Diuron 233,05 72 46 4,5 16,668 35 5 46,1 46 4,5 16,668 31 6 Diazinon 305 169 41 12 18,683 31 4,5 153 41 12 18,683 27 4,5 Dichlorvos 220,9 108,9 41 5,5 16,331 25 5 127,1 42 5,5 16,331 27 5 Dimethoate 230 198,8 21 9,5 16,583 13 4 125 21 9,5 16,583 29 5 Fenthion 279,1 169,1 36 9,5 17,952 25 4 247,1 36 9,5 17,952 19 3 Malathion 331 127 26 10 19,411 19 4 99 26 10 19,411 31 4 Profenofos 372,9 302,9 30 10 20,584 25 5,5 97 30 10 20,584 43 5 Chlorpyrifos-Methyl 321,9 125,1 30 10 19,156 27 5 289,9 30 10 19,156 25 5 Propiconazol 342,1 69,1 30 10 19,722 33 5 159 30 10 19,722 37 5 Ethion 385 199,1 30 10 20,923 17 4 171 30 10 20,923 23 4 2,4-D 218,9 161 -25 -10 -19,755 -20 -14 163 -25 -10 -19,829 -20 -14 Fipronil 434,9 329,7 -25 -10 -27,747 -18 -14 249,9 -25 -10 -27,747 -36 -14
b. Preparasi Fasa Gerak
Preparasi fasa gerak A dilakukan dengan mencampurkan 5 ml asam formiat ke dalam 500 ml air bebas ion yang diperoleh dengan menggunakan Milli Q (Millipore, USA) water purification system. Campuran tersebut kemudian disaring dengan pompa vakum dan dilakukan degassing selama kurang lebih 30 menit untuk menghilangkan gas-gas terlarut.
Fasa gerak B disiapkan dengan mencampurkan 5 ml asam formiat ke dalam asetonitril kemudian disaring dengan pompa vakum untuk menghilangkan pengotor lain yang dapat mempengaruhi kolom LC. Selanjutnya dilakukan degassing selama 30 menit untuk menghilangkan gas-gas terlarut.
c. Persiapan Instrumen LC-MS/MS
Instrumen LC dipersiapkan dengan melakukan purging terhadap kolom LC untuk menghilangkan sisa-sisa eluen yang masih terdapat pada kolom. Setelah itu dilanjutkan dengan pumping terhadap eluen atau fasa gerak selama kurang lebih 5 menit dan dilakukan equilibrate selama 3 menit. Hal ini bertujuan menstabilkan kolom sehingga sistem LC siap digunakan untuk analisis.
d. Optimasi Kondisi Spektrofotometer Massa
Kondisi spektrofotometer massa diatur sedemikian rupa dengan cara memvariasikan beberapa parameter guna mendapatkan kondisi optimum pada quadrupole 1 (Q1) dan quadrupole 3 (Q3) sehingga mampu memilih prekusor ion serta produk ion yang tepat untuk senyawa-senyawa pestisida yang akan dianalisis. Adapun parameter-parameter tersebut antara lain adalah Declustering Potential (DP), Collision Energy (CE), Entrance Potential (EP), dan Collision cell Exit Potential (CXP).
e. Optimasi Sumber Ion
Kondisi sumber ion diatur sedemikian rupa sehingga di dapatkan kondisi optimum dari senyawa untuk mengion dan memisahkan molekul analit dari pelarutnya. Adapun parameter-parameter yang di optimasi antara lain adalah : curtain gas (CUR), collision gas (CAD), ion spray voltage (IS), suhu (TEM), nebulizer gas 1 (GS1), dan nebulizer gas 2 (GS2).
f. Optimasi Kondisi Kromatografi
Kondisi kromatografi diatur sedemikian rupa dengan cara memvariasikan parameter-parameter tertentu untuk mendapatkan kondisi optimum pemisahan dari senyawa-senyawa pestisida. Adapun parameter-parameter yang dimaksud adalah komposisi serta laju alir fasa gerak yang digunakan.
4. Analisa Data
Analisa data dari validasi metode yang telah dilakukan mengacu pada dokumen SANCO 12495/2011 dengan menentukan parameter berikut.
a. Linearitas
Linearitas ditentukan dengan membuat deret standar campuran dari senyawa-senyawa pestisida. Hasil analisis deret standar berupa luas area analit kemudian digunakan untuk menghitung nilai residual. Dokumen SANCO 12495/2011 mempersyaratkan nilai residual sebesar < ±20%. Nilai residual dihitung menggunakan persamaan berikut:
Residual = Yobserved - Yestimate
Keterangan :
Yobserved : Luas area puncak analit berbanding luas area internal standar dari hasil
analisis menggunakan LC-MS/MS.
Yestimate : Luas area puncak yang diperoleh dari persamaan regresi linear antara
hasil plot konsentrasi deret standar dengan Yobserved.
b. Efek matriks
Adanya efek matriks dapat menyebabkan signal enhancement atau suppression sehingga hasil analisis berada di atas atau di bawah estimasi nilai benar. Penentuan efek matriks dimaksudkan untuk mengetahui besar %efek matriks pada pengukuran dengan LC-MS/MS. Besar %efek matriks dapat dihitung dengan membuat deret standar dalam matriks dan deret standar dalam pelarut. Kemudian hasil pengukuran LC-MS/MS luas area analit untuk keduanya dibuat regresi linear terhadap konsentrasi dari deret standar. Slope hasil regresi
linear tersebut kemudian digunakan untuk mencari besar %efek matriks menggunakan persamaan :
c. Batas kuantisasi (LOQ)
Batas kuantisasi atau LOQ ditentukan sebagai konsentrasi terendah dari spike yang sesuai dengan kinerja metode terhadap nilai akurasi dan presisi. Dokumen SANCO 12495/2011 menyebutkan nilai LOQ dapat lebih kecil atau sama dengan Batas Maksimum Residu pesitisida yang ditentukan pada regulasi.
d. Spesifisitas.
Spesifisitas merupakan respon dari blank reagent dan blank sampel, kriteria spesifisitas yaitu kurang dari 30% RL (Reporting Limit). RL yaitu konsentrasi terendah yang dapat dideteksi, nilainya bisa sama dengan atau lebih tinggi dari LOQ. Spesifisitas ditentukan dengan melihat kromatogram hasil pengukuran blank pelarut (Asetonitril) dan blank matriks (kakao) terhadap masing-masing senyawa pestisida.
e. Akurasi (bias)
Akurasi dihitung sebagai nilai perolehan kembali (recovery), dengan persyaratan recovery sebesar 70-120%. Nilai akurasi pada penelitian ini ditentukan dengan melakukan proses spike contoh biji kakao pada 3 titik konsentrasi yaitu 15 g/kg, 25 g/kg, dan 50 g/kg masing-masing sebanyak 6 kali pengulangan. Nilai perolehan kembali (recovery) dapat dihitung melalui persamaan :
Keterangan :
Cs : Hasil akhir spike citr) Cc
S
f. Presisi (RSDr)
Presisi atau keseksamaan diukur sebagai Relative Standar Deviation - repeatibility (RSDr) dari uji spike. Pada penelitian ini, proses spike contoh biji kakao dilakukan pada 3 titik konsentrasi yaitu 15 g/kg, 25 g/kg, dan 50 g/kg, masing-masing sebanyak 6 kali pengulangan. Persyaratan nilai RSDr yaitu
20%.
RSDr dapat dihitung dengan cara sebagai berikut :
Simpangan baku :
Simpangan baku relatif (RSDr):
Keterangan :
SD = Standar Deviasi
xi = recovery masing-masing pengulangan
= rata-rata recovery n = Jumlah data
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
Metode penetapan multi-residu pestisida telah dikembangkan melalui modifikasi metode QuEChERS pada metode EN 15662:2008 untuk mendapatkan prosedur ekstraksi dan clean-up yang sesuai dengan contoh yang mengandung kadar lemak tinggi yaitu kakao. Metode QuEChERS EN 15662:2008 pada penelitian ini dikembangkan untuk menganalisis multi-residu pestisida pada biji kakao. Hasil penelitian ini diharapkan dapat memenuhi syarat keberterimaan negara tujuan ekspor yaitu Uni Eropa. Penelitian ini dilaksanakan dalam beberapa tahapan sebagai berikut :
A. Optimasi Kondisi LC-MS/MS
Sebelum melakukan analisis, perlu dilakukan optimasi LC-MS/MS terlebih dahulu. Tujuan dari dilakukannya optimasi LC-MS/MS ini adalah untuk mendapatkan kondisi terbaik alat dalam menganalisis sampel. Kondisi optimum dari masing-masing bagian instrument akan berpengaruh terhadap hasil analisis. Oleh karena itu optimasi dilakukan dalam tiga tahap, yaitu optimasi kondisi spektroskopi massa, optimasi sumber ion, dan optimasi kormatografi cair.
1. Optimasi Kondisi Spektroskopi Massa
Optimasi kondisi spektroskopi massa dilakukan untuk mendapatkan kondisi optimum molekul dapat terprotonasi [M+H]+ untuk polaritas positif dan terdeprotonasi [M-H]- untuk polaritas negatif. Keadaan tersebut disebut sebagai ion prekusor yang akan digunakan untuk pengukuran menggunakan Multiple Reaction Monitoring (MRM). Hasil dari optimasi pada mode MRM ditunjukkan tabel 1 pada bab metodologi penelitian. Pembentukan ion prekusor atau molekul pestisida yang tertambah 1 massa molekul H atau berkurang 1 massa molekul H bertujuan agar molekul pestisida target menjadi tidak stabil sehingga dapat terpecah menjadi anakan atau ion produk.
Sistem triple quadrupole mengandung tiga quadrupole. Q1 dan Q3 berkerja sebagai filter massa sedangkan Q2 bertindak sebagai collision cell. Quadrupole pertama (Q1) memisahkan data ion prekusor masing-masing pestisida, selanjutnya
pada Q2 ion prekusor terpecah menjadi anakan m/z (fragmentasi), hasil fragmentasi
ini kemudian mengalami pemisahan kembali di Q3 menghasilkan nilai intensitas dari
ion produk. Hasil fragmentasi ion dapat dilihat pada tabel 2. Intensitas ion produk dipilih yang memiliki intensitas tertinggi (yang paling berlimpah), dibutuhkan minimal dua ion produk dengan intensitas yang berada pada waktu retensi yang sama, satu ion digunakan untuk kuantifikasi sedangkan yang lainnya digunakan untuk konfirmasi.
Tabel 2. Fragmentasi senyawa-senyawa pestisida
Senyawa Pestisida Fragmentasi berdasarkan m/z hasil analisis menggunakan mode MRM Fenthion (Organofosfat) Ethion (Organofosfat) Chlorpyrifos-methyl (Organofosfat)
Diazinon (Organofosfat) Dichlorvos (Organofosfat) Dimethoate (Organofosfat) Malathion (Organofosfat) Metidation (Organofosfat)
Profenofos (Organofosfat) Propoxur (Karbamat) Carbaryl (Karbamat) Carbofuran (Karbamat)
Fipronil (Pyrazol)
2,4-dichloro phenoxy acetic acid.
(Asam fenoksi alifatik) Ametryn (Triazine) Diuron (Urea) Imidachlorpid (Nikotinoid)
Propiconazol (Triazol)
Organofosfat yang terklorinasi dapat dikarakterisasi dengan adanya distribusi isotop dalam ion fragment dari 37Cl dan 34S atau 16O. Fragmentasi dari organofosfat terklorinasi dapat terlihat dari terlepasnya ikatan dengan Cl dari spektra massa dan membentuk ion (CH3O)2-P=O pada m/z 109 atau (CH3O)2-P=S m/z 125. Fragmentasi
senyawa organofosfat pada umumnya terjadi melalui mekanisme reaksi berikut (Hong, 2000) :
a. Pada dimethyl phosphate atau phosphorothioate :
Pada senyawa karbamat jarang ditemukan disosiasi pada ikatan C-N, disosiasi atau pemutusan ikatan paling banyak ditemukan pada ikatan C-O. Seperti yang terlihat pada tabel 2 diatas, fragmentasi yang terjadi yaitu pemutusan terhadap ikatan C-O. Sedangkan untuk senyawa pestisida yang termasuk turunan amida seperti diuron dan imidachlorpid, fragmentasi yang terjadi yaitu pembentukan amina bebas dan ion akil. Pada diuron fragmentasi terjadi dengan pelepasan ikatan C-N dan menyisakan muatan pada gugus karbonil, dan pada imidaklorpid muatan yang terlokalosasi pada ikatan O-N=O menyebabkan pelepasan ikatan antara N-N. Pada senyawa pestisida yang termasuk turunan amina seperti ametrin, fragmentasi yang terjadi yaitu dengan pemutusan ikatan karbon dengan nitrogen membentuk amina bebas dan ion deaminasi (Weissberg, 2011).
2. Optimasi Sumber Ion
Optimasi sumber ion dilakukan guna mendapatkan kondisi terbaik untuk senyawa-senyawa pestisida mampu terion-kan dan terpisah dari ion pelarutnya. Kondisi optimum sumber ion (ion source) pada penelitian ini sebagai berikut :
Tabel 3. Kondisi optimum sumber ion
Parameter Nilai Optimum
CUR 20 psi CAD 5 IS 5000 V TEM 500 oC GS1 40 psi GS2 50 psi
3. Optimasi Kromatografi Cair
Keadaan optimum kromatografi cair pada penelitian ini yaitu pada elusi sistem gradient, fasa terbalik dengan kolom analitik C18 150 x 4,6 mm dengan ukuran partikel 5µm. Fasa gerak A merupakan air yang telah dimurnikan yang mengandung 0,1% asam formiat, Fase gerak B merupakan asetonitril yang
mengandung 0,1% asam formiat. Kondisi optimum kromatografi cair ditunjukkan oleh tabel gradien eluen sebagai berikut :
Tabel 4. Gradien Eluen B (0% - 90%)
Waktu (menit) B% 0,01 Start 1,50 0% 7 90% 10 90% 10,50 0% 12 Stop
Hasil dari optimasi tersebut kemudian akan digunakan sebagai keadaan instrument selama melakukan analisis pestisida dalam sampel kakao.
B. Validasi Metode
Metode pada penelitian ini divalidasi berdasarkan dokumen SANCO/12495/2011 dengan parameter validasi yang dikerjakan antara lain :
1. Efek Matriks
Efek matriks pada penelitian ini dihitung besarnya sebagai evaluasi pengaruh efek matriks terhadap masing-masing senyawa pestisida. Efek matriks dikenal sebagai masalah dalam analisis residu pestisida menggunakan LC-MS/MS dan GC-MS. Efek matriks dapat mempengaruhi sensitivitas melalui penurunan intensitas signal, repeatibility intensitas signal, rasio ion, linearity, recovery, dan kuantifikasi menyebabkan pentingnya evaluasi terhadap efek matriks selama proses pengembangan metode atau validasi. Hasil evaluasi terhadap efek matriks metode QuEChERS EN 15662:2008 dapat ditampilkan pada tabel 5 sebagai berikut :
Tabel 5. Hasil perhitungan efek matriks
Golongan Pestisida Nama Senyawa Pestisida Besar % efek matriks
Organofosfat Metidation -79.365 Diazinon -14.474 Dichlorvos -16.310 Dimethoate -47.187 Fenthion -74.766 Malathion -57.192 Profenofos 30.435 Chlorpyrifos-Methyl -50.909 Ethion -41.134 Karbamat Carbaryl -85.611 Carbofuran 3.747 Propoxur -92.123 Herbisida Diuron -14.321 Ametryn 27.689 Fungisida Propiconazol 65.154 Nikotinoid Imidachlorpid -69.797
Presentase antara -20% dan 20% dinyatakan sebagai tidak ada efek matriks, karena variasi ini dekat dengan nilai repeatibility. Efek matriks medium terjadi ketika nilainya berada diantara -50% dan -20% atau 20% dan 50%, dan efek matriks kuat apabila nilainya di atas 50% dan di bawah -50%. Efek matriks bergantung pada beberapa faktor yaitu sifat dari pestisida, jenis matriks, dan rasio pest isida terhadap matriks. Terlihat dari hasil evaluasi di atas diketahui empat senyawa memiliki efek matriks medium, dan 8 senyawa memiliki efek matriks kuat, senyawa-senyawa ini memiliki sifat hidrofilik, terlihat dari hasil fragmentasi yang dapat berikatan hidrogen. Kandungan lemak yang dimiliki kakao berkisar antara 10-12%, menyebabkan dalam sampel kakao masih ditemukan residu senyawa yang bersifat hidrofilik dan lipofilk. Sedangkan 4 senyawa lainnya termasuk ke dalam efek matriks
lemah atau dapat dikatakan tidak ada efek matriks. Cara terbaik sebagai kompensasi terhadap efek matriks adalah penggunaan isotop internal standard, namun pada banyak pestisida senyawa tersebut tidak tersedia sehingga pendekatan yang terbaik adalah dengan menggunakan matrix-matched calibration.
2. Linearitas
Pengukuran linearitas dilakukan menggunakan matrix-matched calibration terhadap luas area analit dari larutan standar pestisida pada rentang konsentrasi 1 µg/kg 100 µg/kg terhadap masing-masing senyawa pestisida, khusus pada diazinon rentang kosentrasi pada rentang 0,1 µg/kg 100 µg/kg dikarenakan respon alat yang tinggi terhadap diazinon. Linearitas ditentukan melalui koefisien korelasi. Regresi linear dibuat antara konsentrasi deret standar di dalam matriks sebagai sumbu x dengan luas puncak area analit sebagai sumbu y. Koefisien korelasi dari 18 senyawa pestisida baik pada ESI (-) maupun ESI (+) yang diujikan pada penelitian ini juga memenuhi syarat keberterimaan linearitas, yaitu r > 0,99. Besar harga koefisien korelasi untuk masing-masing pestisida selengkapnya dapat dilihat pada tabel 6.
Linearitas menunjukkan hubungan antara konsentrasi analit dengan respon detektor. Respon detektor dari pestisida dalam ekstrak harus berada pada kisaran konsentrasi pada kurva kalibrasi. Hubungan yang linear antara konsentrasi analit dengan respon alat dinyatakan dalam koefisien korelasi (r), pada semua senyawa pestisida harga r mendekati angka satu, yang menunjukkan adanya hubungan yang proposional antara respon analitik dengan konsentrasi yang diukur. Respon detektor terhadap sebagian besar senyawa pestisida ESI (+) juga telah menunjukkan hubungan yang linear. Hasil ini menunjukkan efek matriks lemak pada sampel kakao dengan analisis menggunakan metode QuEChERS EN 15662:2008 tidak mengganggu kinerja detektor, atau dapat dikatakan detektor tidak mengalami kejenuhan selama analisis.
3. Batas Kuantisasi (LOQ)
Menurut dokumen SANCO, batas kuantisasi ialah nilai terendah dari konsentrasi yang dapat dideteksi oleh metode, nilainya dapat sama dengan atau lebih kecil dari batas maksimum residu (BMR) pestisida. BMR pestisida yang ditentukan regulasi eropa terhadap sampel kakao ialah 0,01 mg/kg - 0,05 mg/kg. Batas kuantisasi didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima pada kondisi operasional metode yang digunakan. LOQ pada penelitian ini ditentukan sebesar 0,01 mg/kg, dikarenakan pada konsentrasi tersebut senyawa pestisida masih dapat dideteksi selama analisis oleh metode.
4. Spesifisitas
Spesifisitas merupakan kemampuan suatu metode untuk mengukur analit yang dituju secara tepat dan spesifik dengan adanya komponen-komponen matriks. Spesifisitas ditentukan dengan melihat kromatogram hasil pengukuran blank matriks (kakao) terhadap masing-masing senyawa pestisida. Kriteria spesifisitas yaitu kurang dari 30% RL (Reporting Limit). RL yaitu konsentrasi terendah yang dapat dideteksi, nilainya bisa sama dengan atau lebih tinggi dari LOQ. Berikut kromatogram hasil blank matriks dengan kromatogram hasil spike pada konsentrasi 25 µg/kg :
Gambar 26. Kromatogram blanko sampel kakao pada pestisida ESI (+)
Gambar 27. Kromatogram spike pada konsentrasi 25 µg/kg pada pestisida ESI (+) Pada gambar 26 dan gambar 27 di atas terlihat kedua transisi dari masing-masing senyawa pestisida pada ESI (+) dapat ditinjau. Kromatogram dari 16 senyawa pestisida ESI (+) pada blanko yang dapat dilihat pada gambar 26 menunjukkan tidak adanya interferensi dari impurities yang dapat menganggu pengukuran analit. Kromatogram pada spike 25 µg/kg yang ditunjukkan pada gambar 27, menunjukkan bahwa metode dapat mengukur senyawa pestisida target dengan spesifik tanpa gangguan dari efek matriks.
Gambar 28. Kromatogram blanko sampel kakao pada pestisida ESI (-)
Gambar 29. Kromatogram spike pada konsentrasi 25 µg/kg pada pestisida ESI (-) Sedangkan kromatogram dari senyawa pestisida ESI (-) pada blanko yang dapat dilihat pada gambar 28 menunjukkan adanya interferensi dari impurities yang dapat menganggu pengukuran analit. Meskipun begitu metode dapat mengukur senyawa pestisida target dengan spesifik, hal ini dapat dilihat kromatogram spike 25 µg/kg pada gambar 27 yang menunjukkan waktu rentesi untuk fipronil pada 8,72 dan
Dapat disimpulkan Metode QuEChERS EN 15662:2008 dengan fatty-dispersive clean-up merupakan metode yang spesifik digunakan untuk analit target walaupun dengan matriks lemak yang sulit untuk dihilangkan.
5. Akurasi
Besar recovery dihitung menggunakan uji spike pada 3 konsentrasi yaitu 15, 25 ppb dan 50 µg/kg dengan 6 kali pengulangan. Hasil penentuan nilai recovery menunjukkan 15 dari 18 senyawa pestisida yang diujikan telah memenuhi syarat keberterimaan %recovery yaitu berada pada range 70%-120%. Hasil tersebut menunjukkan kesesuaian hasil analisis dengan nilai benar analit, hal ini mengindikasikan bahwa efisiensi proses preparasi hingga analisis sudah baik, serta komponen matriks lemak yang berada pada kakao berhasil diminimalisir sehingga tidak menganggu dan mempengaruhi hasil analisis senyawa pestisida target.
Adapun senyawa yang belum memenuhi keberterimaan merupakan senyawa pestisida yang memiliki keasaman tinggi, hal ini dapat dilihat dari hasil fragmentasi ketiga senyawa (propoxur, carbaryl, dan 2,4-dichlorophenoxy acetic acid) yang menghasilkan senyawa bersifat asam. Senyawa anakan berupa fenol untuk 2,4- dichlorophenoxy acetic acid) dan carbaryl serta triazine untuk propoxur. Ketiga anakan tersebut merupakan senyawa yang labil dan bersifat asam. Dari hasil ini, dapat diindikasikan metode QuEChERS EN 15662:2008 dengan menggunakan campuraan buffer disodium dan trisodium dengan range pH 5-5,5 belum mampu mempertahankan keasaman dari ketiga senyawa tersebut. Sehingga pada prosesnya ketiga senyawa tersebut masih bersifat labil selama proses. Selain itu kesalahan selama preparasi, dapat juga menjadi penyebab belum terpenuhinya syarat keberterimaan recovery pada ketiga senyawa ini.
6. Presisi (RSDr)
Presisi menyatakan kesesuaian hasil uji individual, yang diukur melalui persebaran uji individual dari rata-rata. Syarat suatu metode dikatakan memiliki
digunakan pada penelitian ini telah memiliki presisi yang baik, atau keterulangan antara hasil uji indivual sudah baik.
Hasil perhitungan akurasi (recovery) dan presisi (RSDr) dengan proses spike pada konsentrasi 15, 25, dan 50 µg/kg dapat dilihat pada tabel 6 di bawah ini :
Tabel 6. Akurasi (rata-rata recovery), Presisi (RSDr), Linearitas, & LOQ
Analyte Spike (µg/kg) Linearitas LOQ (µg/kg) 15 25 50 r Rec (%) RSDr (%) Rec (%) RSDr (%) Rec (%) RSDr (%) Diazinon 82,82 12,546 85,58 5,17 70,32 9,02 0,997 10 Dichlorvos 83,0126 17,37 78,75 3,27 71,64 10,43 0,99 10 Chlorpyrifos -Methyl 95,01 15,838 90,12 12,36 64,80 8,76 0,992 10 Dimethoate 117,209 5,61 101,99 10,59 81,37 7,861 0,997 10 Ethion 97,296 14,01 95,87 16,67 76,58 8,74 0,993 10 Fenthion 94,62 16,33 105,99 15,05 76,39 13,135 0,994 10 Malathion 120,309 3,18 1191,63 4,99 79,57 10,72 0,996 10 Methidathion 102,823 13,37 128,259 3,918 116,18 8,478 0,997 10 Profenofos 85,642 15,26 92,56 10,56 71,92 8,51 0.991 10 Carbaryl 455,246 18,61 489,0099 4,475 363,83 17,11 0,992 10 Carbofuran 83,329 6,44 85,287 6,014 77,77 8,19 0,985 10 Propoxur 1010,998 21,025 541,79 9,628 268,95 34,135 0,998 10 2,4-D 45,245 11,136 35,644 10,928 32,25 2,848 0,999 10 Ametryn 77,298 6,31 75,234 4,149 65,07 8,38 0,997 10 Diuron 97,358 7,55 98,78 11,27 84,17 10,71 0,998 10 Propiconazol 71,9 6,06 83,72 4,29 75,94 9,345 0,997 10 Fipronil 85,177 3,98 80,98 2,48 85,753 4,386 0,999 10 Imidachlorpid 77,042 10,74 78,788 5,805 69,06 6,95 0,999 10
