BAB VI. ELEKTROFORESIS
A. PENDAHULUAN
Elektroforesis adalah teknik pemisahan yang didasarkan pada kemampuan analit bergerak melalui media konduktif sebagai akibat diaplikasikannya arus listrik. Media yang digunakan adalah larutan buffer. Jika tidak ada faktor lain, senyawa bermuatan positif (kation) akan bergerak ke katoda sedangkan senyawa bermuatan negatif akan bergerak ke anoda. Kecepatan gerakannya dipengaruhi oleh kondisi lingkungan di sekitar molekul yang dapat mempengaruhi muatannya (pH) dan hambatan fisik yang mempengaruhi gerakan molekul dalam medan listrik seperti ukuran pori fase diam. Elektroforesis dapat dimanfaatkan untuk pemisahan ion anorganik dan logam kation, protein, DNA, karbohidrat dan sampel-sampel biomedik lainnya.
Elektroforesis dapat dibedakan menjadi dua berdasarkan ada tidaknya bahan pendukung atau bahan penstabil media :
1. Metode bebas cairan (free solution method)
Tidak ada bahan pendukung atau penstabil media
Sampel dimasukkan dalam tabung U yang telah diisi dengan larutan bufer
Medan listrik diaplikasikan dan analit akan bergerak sesuai dengan muatan
Metode ini telah digunakan oleh Tiselius peraih hadiah Nobel tahun 1948 untuk memurnikan protein
2. Metode dengan penstabil media
Terdapat bahan pendukung seperti kertas, kolom packing atau gel
Mirip dengan metode kromatografi, hanya saja gerakan analit disebabkan oleh adanya medan listrik bukan krena fase gerak
Sejumlah metode yang termasuk dalam kategori ini adalah electrochromatography, zone electrophoresis, electromigration dan ionophoresis.
Elektroforesis Kertas
Kertas dijenuhi dengan larutan buffer dan sampel diaplikasikan pada salah satu ujungnya, Arus listrik DC dengan kekuatan arus berkisar dalam mA
atau voltage sekitar 100 - 1000 Volt diaplikasikan. Analit akan bergerak ke titik spesifik sesuai muatannya. Setelah periode waktu tertentu, kertas diambil dan dikeringkan. Jika diperlukan, kertas dapat disemprot dengan perekasi warna agar pita pemisahan dapat dilihat.
Elektroforesis kapiler
Larutan buffer ditahan dalam tabung kapiler dengan diameter dalam berkisar 25 -75 µm. dengan menggunakan tabung kapiler maka resiko panas atau interaksi dan degradasi analit dengan bahan pendukung dapat diatasi. Metode ini termasuk metode bebas cairan. Sampel dimasukkan pada salah satu ujungnya dan akan bergerak ke ujung tabung yang lainnya. Seperti halnya kromatografi, akan dihasilkan elektrophoregram yang memberikan informasi baik kualitatif maupun kuantitatif.
B. TEORI
Ada dua faktor yang menyebabkan mobilitas solut dalam elektroforesis yaitu 1. Mobilitas elektroforetik (Electrophoretic mobility) Gerakan sebagai akibat dari
medan listrik
Kation akan bergerak ke katoda, anion ke anoda dan senyawa netral tidak bergerak.
2. Aliran elektroosmotik (Electroosmotic flovf)
Migrasi solut sebagai akibat gerakan larutan buffer dalam medan listrik. Dalam kondisi normal, larutan buffer akan bergerak ke katoda. Gerakan buffer akan membawa semua species yang ada termasuk anion dan senyawa netral.
Mobilitas elektroforetik (Electrophoretic mobility)
Kecepatan elektroforetik Vep adalah besaran yang menggambarkan bagaimana kecepatan solut bermigrasi.
Vep = µep E ……….………. VI.1
µep =
………VI.2
µep = mobilitas elektroforetik solut E = kekuatan medan listrik
q = muatan solut
= viskositas pelarut buffer r = ukuran partikel solut
dengan menaikkan muatan dan menurunkan ukuran partikel solut maka harga µep semakin besar.
Mobilitas elektroosmotik (electroosmotic mobility)
Dalam kondisi normal, baik anion dan spesies netral akan bermigrasi ke arah katoda. Ini terjadi karena dinding kapiler akan bermuatan listrik sebagai akibat banyaknya gugus silanol (Si-OH). Kation akan tertarik menuju dinding dan membentuk lapisan ganda (double layer) yang terdiri dari fixed layer di bagian dalam yang terbentuk dari kation-kation yang berikatan kuat dengan dinding kapiler. Lapisan kedua yaitu mobile /ayeraplsan yang dapat bergerak dengan kekuatan ikatan ion yang lemah. Kation di bagian terluar (di luar lapisan ganda) akan bergerak ke arah katoda seperti pada skema gambar VI. 1 berikut ini. Kecepatan aliran elektroosmotik dapat dituliskan dengan persamaan di bawah ini.
Veof = Heof E ... VI.3 µeof = /4 ………... VI.4
= konstanta dielektrik larutan buffer
= zeta potensial
Gambar Vl.1
Zeta potensial adalah perubahan potensial sepanjang
zeta potensial proposional dengan muatan dinding kapiler. Bila pH dinaikkan, muatan meningkat dan zeta potensial
meningkat. Harga zeta potensial juga proporsional dengan ketebalan lapisan ganda (double layer),
akan diperoleh kation lebih banyak. Ini akan menurunkan ketebalan lapis ganda (double layer).
Mobilitas total dari solut dituliskan sebagai berikut. Vtot = Vep + V
µtot = µep + µ Pada kondisi normal, (V
sehingga kation akan terelusi pertama dan urut sesuai perbandingan muatan/ukuran ion, senyawa netral terelusi kemudian dan terakhir anion dengan urutan kebalikan dari
Waktu migrasi Vtot = L/Tm
Vtot = µtotE ... VI.8 Vtot = (µep
Tm = L/ (µ
E = V/l ... Tm = (LI) / (
Vl.1. Skema double layer dan aliran elektroosmotik Zeta potensial adalah perubahan potensial sepanjang double layer. zeta potensial proposional dengan muatan dinding kapiler. Bila pH dinaikkan, muatan meningkat dan zeta potensial meningkat. Harga neof juga akan meningkat. Harga zeta potensial juga proporsional dengan ketebalan lapisan (double layer), Bila kekuatan ionik dari larutan buffer meningkat, maka akan diperoleh kation lebih banyak. Ini akan menurunkan ketebalan lapis
(double layer).
Mobilitas total dari solut dituliskan sebagai berikut.
+ Veof ... VI.5 µeof ... VI.6 Pada kondisi normal, (Vtot) Ration > µeof; (Vtot)anion < Ueof; V
sehingga kation akan terelusi pertama dan urut sesuai perbandingan muatan/ukuran ion, senyawa netral terelusi kemudian dan terakhir anion dengan urutan kebalikan dari besarnya rasio muatan/ukuran ion.
m ...
E ... VI.8 + µeof) E ...
µep + µeof) E ... ... (LI) / (µep + µeof) V ...
Skema double layer dan aliran elektroosmotik
double layer. Harga zeta potensial proposional dengan muatan dinding kapiler. Bila pH dinaikkan, meningkat. Harga neof juga akan meningkat. Harga zeta potensial juga proporsional dengan ketebalan lapisan Bila kekuatan ionik dari larutan buffer meningkat, maka akan diperoleh kation lebih banyak. Ini akan menurunkan ketebalan lapisan
... VI.5 VI.6
)anion < Ueof; Vtot)netral = µeof, sehingga kation akan terelusi pertama dan urut sesuai perbandingan muatan/ukuran ion, senyawa netral terelusi kemudian dan terakhir anion dengan
... VI.7 E ... VI.8 ... VI.9 ) E ... VI.10 ... VI.11 ) V ... VI.12
Keterangan :
Vtot : kecepatan migrasi total
L : jarak antara tempat injeksi dan detektor Tm : waktu migrasi
V : voltage I : jarak tabung
Waktu elusi dapat diperpendek dengan menaikkan voltage atau menggunakan tabung yang lebih pendek.
Jumlah lempeng teoritik
N = (µep + µeof) V / 2D ... VI.13 D : koefisien difusi solut
Solut dengan harga µep yang besar akan memiliki efisiensi pemisahan yang besar. Efisiensi tidak tergantung pada panjang kolom. Harga N yang dapat diterima untuk analisis adalah 100.000 - 200.000.
Selektivitas
Selektivitas merupakan perbandingan antara faktor kapasitas dari dua solut, dirumuskan dengan
α = µep1 / µep2 ... VI. 14 harga α dapat diubah-ubah dengan mengubah pH buffer.
Resolusi
RS =
. /
/ ! ………. VI.15
harga Rs dapat ditingkatkan dengan menaikkan voltage dan menurunkan µeof. Tetapi dengan menurunkan µeof akan membawa konsekuensi waktu analisis menjadi lebih lama dan efisiensinya menurun.
C. INSTRUMENTASI ELEKTROFORESIS KAPILER
Alat elektroforesis terdiri dari sumber listrik, anoda dan katoda masing-masing ditempatkan dalam larutan buffer, tabung kapiler, detektor dan tempat sampel seperti pada gambar VI. 2 berikut ini.
Gambar VI.2. Skema alat elektroforesis kapiler
Tabung kapiler Diameter dalam 25
-timbul efek panas selama analisis, maka dapat digunakan diameter dalam yang kecil dengan tebal lapisan silika yang tipis.
Tempat memasukkan sampel
Tabung kapiler sebelumnya diisi dengan larutan buffer, sampel dimasukkan dengan jalan mencelupkan salah satu ujung tabung ke dalam larutan sampel. Dengan bantuan tekanan atau memberikan
terdorong masuk ke dalam tabung. Pengaturan voltage
Migrasi solut dapat terjadi bila diberikan medan listrik. Seberapa besar medan listrik yang diberikan tergantung pada :
Waktu analisis yang dikehendaki
Menmberikan
Memperbaiki faktor resolusi
Bila digunakan tabung kapiler yang berdiameter sempit, maka voltage bisa sarnpai 40.000, dengan kekuatan arus berkisar mikroamper.
Detektor
Ada banyak jenis detektor yang dapat digunakan seperti tabel berik ambar VI.2. Skema alat elektroforesis kapiler
- 75 µm, panjang bervariasi sekitar 20-50 meter. Agar tidak timbul efek panas selama analisis, maka dapat digunakan diameter dalam yang kecil dengan tebal lapisan silika yang tipis.
Tempat memasukkan sampel
Tabung kapiler sebelumnya diisi dengan larutan buffer, sampel dimasukkan jalan mencelupkan salah satu ujung tabung ke dalam larutan sampel. bantuan tekanan atau memberikan beda potensial maka sampel dapat
masuk ke dalam tabung. Pengaturan voltage
Migrasi solut dapat terjadi bila diberikan medan listrik. Seberapa besar medan yang diberikan tergantung pada :
Waktu analisis yang dikehendaki Menmberikan pemisahan yang bagus Memperbaiki faktor resolusi
Bila digunakan tabung kapiler yang berdiameter sempit, maka voltage bisa sarnpai 40.000, dengan kekuatan arus berkisar mikroamper.
Ada banyak jenis detektor yang dapat digunakan seperti tabel berik ambar VI.2. Skema alat elektroforesis kapiler
50 meter. Agar tidak timbul efek panas selama analisis, maka dapat digunakan diameter dalam yang
Tabung kapiler sebelumnya diisi dengan larutan buffer, sampel dimasukkan jalan mencelupkan salah satu ujung tabung ke dalam larutan sampel. beda potensial maka sampel dapat
Migrasi solut dapat terjadi bila diberikan medan listrik. Seberapa besar medan
Bila digunakan tabung kapiler yang berdiameter sempit, maka voltage bisa
Tabel VI. 1. Jenis detektor yang dapat digunakan dalam elektrofbresis
Jenis detektor Spesifikasi
Spektrofotometer serapan ultraviolet-visibel
Solut dengan gugus kromofor
Fluorometer Solut harus berfluoresensi Laser fluorometer Solut harus berfluoresensi
Radiometer Solut harus mengandung radioaktif Spektrofotometer massa Umum
Amperemeter Solut harus tereduksi atau teroksidasi
