BAB III
METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Metode Penelitian 1. Jenis Penelitian
Penelitian yang dilakukan adalah jenis penelitian dasar. Penelitian dasar adalah penelitian yang dikerjakan tanpa memikirkan ujung praktis atau titik terapan (Nazir, 2003).
2. Metode Penelitian
Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode deskriptif. Penelitian ini dilakukan dengan cara observasi tanpa adanya manipulasi terhadap objek penelitian serta tanpa adanya kontrol (Nazir, 2003).
B. Pelaksanaan dan Lokasi Penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Struktur Tumbuhan Jurusan Pendidikan Biologi FPMIPA UPI. Pengambilan sampel dilakukan di Kebun Raya Bogor, Jawa Barat.
C. Populasi dan Sampel 1. Populasi
Populasi dalam penelitian ini adalah genus Mangifera yang terdapat di Indonesia.
2. Sampel
Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah 13 sampel anggota genus Mangifera sebagai ingroup dan 1 sampel outgroup dari genus Bouea di Kebun Raya Bogor. Spesies yang digunakan sebagai sampel penelitian dapat dilihat pada Tabel 3.1.
Tabel 3.1. Spesies yang Digunakan
No Genus Spesies Nama Daerah
1 Bouea Bouea oppositifolia (Roxb.) Meiss
2
Mangifera
Mangifera altissima Blanco var bingloe
Embacang (Ind) 3 Mangifera applanata Kosterm.
4 Mangifera foetida Lour. Bacang (Ind); Limus (Sunda);)
5 Mangifera gedebe Miq. Kedepir (Jawa); Gedepir
(Sumatera); Repik; Repeh
6 Mangifera indica L. var
compressa
Mangga
7 Mangifera laurina Bl. Mangga pari (Sunda); Pelem kecik (Jawa)
8 Mangifera macrocarpa Bl. Ki pari (Sunda); Haju (Sumatera) 9 Mangifera odorata Griff. Kuweni; Kaweni; Kweni (Jawa
dan Sunda)
10 Mangifera rufocostata
Kosterm.
Asam Kiat
11 Mangifera similis Auct. Tajas; Asam rawa (Indonesia) 12 Mangifera caesia Jack ex Wall Binjai (Ind); Binglu (Sunda);
Wani (Bali) 13 Mangifera caesia Jack ex Wall
var wanyi Kosterm.
D. Alat dan Bahan 1. Alat
Alat yang digunakan pada penelitian ini dapat dilihat pada Tabel 3.2. Tabel 3.2 Spesifikasi Alat yang Digunakan
2. Bahan
Bahan yang digunakan pada penelitian ini dapat dilihat pada Tabel 3.3. Tabel 3.3 Bahan yang Digunakan
No Nama Bahan Kegunaan
1 Asam asetat glacial Pembuatan larutan FAA
2 Formalin Pembuatan larutan FAA
3 Alkohol Pembuatan larutan alkohol seri (30%, 50%, 70%, 95%, 100%) 4 Minyak paraffin Infiltrasi
5 Paraffin lunak dan keras Infiltrasi dan Embedding
6 Xilol Pembeningan
7 TBA Dehidrasi dan infiltrasi
8 Perekat Haupt Penempelan sayatan 9 Pewarna Fast green Pewarnaan
10 Cat kuku transparan Pembuatan preparat
11 Entelan Penutupan
No Nama Alat Spesifikasi Jumlah
1 Kaca objek Sail Brand 25.4 X 76.2 mm 2 pak @72 buah 2 Kaca penutup Menzel-Glaser 24X24 mm 3 pak @50 buah
3 Botol vial 10 ml 28 buah
4 Pipet Bahan kaca 3 buah
5 Silet Gillette Goal 1 pak @ 6 buah
6 Gelas ukur @ 1 buah
7 Gelas kimia @ 1 buah
8 Vaccum diafragh pump Ulvac sinko kiko DA-20D 1 set
9 Baki pita Bahan karton duplex 4 buah
10 Desicator Duran 1 buah
11 Oven SIBATA SPF-450 1 buah
12 Hot plate ERMA F-1 1 buah
13 Mikrotom Model Yamato KHKI PR-50 1 buah
14 Staining jar Bahan kaca 18 buah
15 Kuas No 3 2 buah
16 Mikroskop Shimadzu 1 buah
E. Cara Kerja
1. Pengambilan Sampel di Lapangan
Sampel tumbuhan diambil dari Kebun Raya Bogor, Jawa Barat, Indonesia. Daun yang digunakan sebagai sampel adalah daun yang dianggap cukup tua (daun ke-8 atau ke-9 dari pucuk dan berwarna hijau tua). Sampel daun yang telah diambil langsung difiksasi menggunakan FAA untuk mencegah perubahan pada jaringan maupun keadaan sel pada daun.
2. Pembuatan Preparat Anatomi Sayatan Segar
Bentuk sel epidermis, tipe stomata, letak stomata, frekuensi stomata dan bentuk trikoma pada sampel daun diamati dengan membuat preparat anatomi sayatan segar pada tiga daerah daun yaitu daerah basal, tengah dan ujung daun. Pembuatan preparat anatomi sayatan segar dilakukan dengan dua cara. Untuk mengamati letak stomata, frekuensi stomata dan bentuk trikoma, dibuat preparat menggunakan cat kuku transparan yang dioleskan pada permukaan daun. Cat kuku dibiarkan mengering kemudian dilepas hati-hati dan ditempelkan pada kaca objek yang telah diberi setetes air. Sementara untuk mengamati bentuk sel epidermis dan tipe stomata dibuat preparat dengan menyayat permukaan daun secara paradermal menggunakan silet tajam. Sayatan ini kemudian diletakkan pada kaca objek yang telah diberi setetes air.
3. Pembuatan Preparat Anatomi Dengan Metode Paraffin
Untuk mengamati letak rigi pada stomata dibuat preparat dengan metode paraffin (Sass, 1958). Sampel daun yang akan diamati dipotong dengan ukuran kira-kira 1x2 cm, sampel kemudian difiksasi menggunakan FAA selama 1x24 jam. Sampel selanjutnya diaspirasi menggunakan aspirator untuk menghilangkan udara sampai bahan tenggelam atau tidak terlihat lagi gelembung udara yang keluar dari jaringan.
Sampel selanjutnya didehidrasi menggunakan seri larutan alkohol-TBA (tertier butil alkohol) atau disebut juga larutan Johansen. Komposisi larutan Johansen dapat dilihat pada Lampiran I. Dehidrasi bertujuan untuk menarik air agar jaringan dapat lebih mudah bercampur dengan paraffin saat proses infiltrasi.
Sampel selanjutnya diinfiltrasi dalam TBA-minyak paraffin 1:1 selama 1,5 jam, kemudian proses infiltrasi dilanjutkan menggunakan paraffin lunak 48oC selama 3x2 jam dan paraffin keras 58oC selama 2x2 jam. Sampel kemudian disayat menggunakan mikrotom putar model Yamato KHKI PR-50 dengan ketebalan 10µm.
Sayatan yang terlihat baik kemudian ditempelkan pada kaca objek yang telah dilapisi dengan perekat “Haupt” (Lampiran I) dan diberi setetes air. Sayatan dibiarkan mengering diatas papan pemanas dengan suhu 42oC. Langkah pembuatan preparat anatomi dengan metode paraffin ini dapat dilihat pada lampiran II. Sayatan diwarnai dengan pewarna fast green menggunakan metode pewarnaan fast green yang telah dikemukakan oleh Sass (1958). Tahapan
pewarnaan fast green dapat dilihat pada lampiran III. Sayatan yang telah diwarnai dibubuhi entelan dan ditutup dengan kaca penutup.
4. Pengamatan Anatomi
a. Pengamatan Permukaan Epidermis Daun
Pengamatan permukaan epidermis daun meliputi bentuk sel epidermis, tipe stomata, letak stomata, frekuensi stomata dan bentuk trikoma. Pengamatan dilakukan dengan menggunakan preparat anatomi sayatan segar. Masing-masing preparat diamati sebanyak 10 kali lapang pandang menggunakan mikroskop elektrik Shimadzu.
b. Menentukan Frekuensi Stomata
Stomata dihitung secara acak sebanyak 10 kali lapang pandang pada tiap preparat anatomi sayatan segar. Nilai stomata per mm2 didapat dari hasil kali jumlah stomata rata-rata dengan nilai faktor permukaan (surface factor) pada perbesaran 400x (F = 11,6977). Nilai faktor permukaan didapat menggunakan metode standar yaitu, nilai pada mikrometer lensa objektif dikali dengan sepuluh kemudian dibagi dengan nilai pada mikrometer lensa okuler (Sabo et al., 2007).
c. Birai pada Stomata
Pengamatan birai atau rigi pada stomata dilakukan pada setiap preparat sayatan melintang daun yang telah dibuat menggunakan metode paraffin dan diwarnai menggunakan fast green. Seluruh hasil pengamatan kemudian didokumentasikan menggunakan kamera digital Samsung tipe S860.
5. Analisis Filogenetika a. Skoring
Dari 13 spesies pada genus Mangifera dan satu spesies dari genus Bouea telah dibedakan berdasarkan karakter anatomi epidermis daunnya. Enam karakter yang diamati kemudian dilakukan skoring. Skoring karakter yang dilakukan adalah sebagai berikut :
1. Bentuk sel epidermis : 0 = tepi bergelombang 1 = bersudut
2 = membulat 2. Tipe stomata : 0 = anomositik
1 = bukan anomositik 3. Frekuensi stomata : 0 = 839.89/mm2
1 = f < 839.89/mm2 2 = f > 839.89/mm2 4. Letak stomata : 0 = hipostomatik
1 = amfistomatik
5. Trikoma : 0 = tidak berbentuk sisik 1 = berbentuk sisik
6. Birai : 0 = ada
1= tidak ada
b. Analisis Data
Analisis filogenetika dilakukan menggunakan software PAUP (Phylogenetics Analysis Using Parsimony) versi 4.0b10. Data hasil skoring setiap karakter diberi bobot sama dan dianalisis menggunakan heuristic search method dan tree bisection-reconnection (TBR) branch swapping. Semua pohon filogenetik disimpan kemudian dilakukan evaluasi pohon menggunakan analisis bootstrap. Jumlah langkah, indeks retensi (RI) dan indeks konsistensi (CI) dihitung untuk pohon konsensus.
Gambar 3.1. Alur Penelitian Metode sayatan segar
Seminar proposal Studi literatur Pembuatan proposal Pengambilan sampel Pembuatan preparat Metode paraffin Kesimpulan Pengamatan Analisis data
