LAPORAN PRAKTIKUM
SITOHISTOTEKNOLOGI
FIKSASI JARINGAN
Disusun Oleh : Khofifah Inayatun Nuzul
1804034082
6A
Dosen Pengampu : Dra. Hayati, M.Farm
TEKNIK LABORATORIUM MEDIK
FAKULTAS FARMASI DAN SAINS
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH PROF DR.HAMKA
JAKARTA
BAB I PENDAHULUAN
A. Definisi Fiksasi
Fiksasi jaringan adalah proses mengawetkan jaringan agar awet dan kondisinya sama seperti hidup. Dilakukan dengan merendam jaringan ke lartutan fiksasi (volume min 10x besar jar) selama 24 jam (Mikel, 2004).
Pengawetan (fiksasi) adalah stabilitasi unsur penting pada jarimgan sehingga unsur tersebut tidak terlarut, berpindah, atau terdistorsi selama prosedur selanjutnya. Fiksasi yang benar adalah dasar dari semua preparat yang baik. Efek fiksasi terhadap jaringan yang diproses adalah menghambat proses pembusukan dan autolysis, pengawetan jaringan, pengerasan jaringan, pemadatan koloid, diferesiansi optic, dan berpengaruh terhadap pewarnaan. Sejumlah factor akan mempengaruhi proses pengawetan yaitu dapar, penetrasi, volume pengawet, konsentrasi, interval waktu, suhu, dan jenis larutan pengawet (Sipahutar, 2009).
Definisi fiksasi mengubah komposisi kimia dan fisik asli dari jaringan. Selain mengubah sifat kimia sel dan jaringan yang digunakan, fiksasi dapat juga menyebabkan perubahan fisik pada komponen seluler dan ekstraselular.
Mekanisme kerja dari fiksasi pada dasarnya adalah mengawetkan bentuk sel dan organel sehingga mendekati bentuk ketika masih utuh. Dengan pemberian cairan fiksasi, maka akan mengubah komposisi jaringan secara kimiawi ataupun secara fisik. Fiksasi dapat dianggap sebagai “serangkaian kejadian kimiawi yang kompleks”. Pada sel atau jaringan yang akan difiksasi tersusun atas sel dan komponen akstraseluler. Sel dan komponen ekstraseluler terdiri dari elemen peptida dan protein, lipid, dan fosfolipid (membran), karbohidrat dan kompleks karbohidrat, berbagai jenis RNA dan DNA dan sebagainya.
Elemen-elemen ini akan bereaksi selama proses fiksasi dan akan tergantung pada jenis fiksasi yang digunakan, baik itu akan bereaksi secara kimia dengan fiksatif, distabilisasi oleh mekanisme “cross-linking” sehingga dapat. Adapula elemen yang tidak terpengaruh oleh larutan fiksasi namun “terjebak” dalam sel atau jaringan akibat terbentuknya elemen baru.
B. Tujuan Fiksasi
Fiksasi terhadap jaringan harus dilakukan secepat mungkin, segera setelah jaringan hewan atau manusia diambil dari tubuhnya dengan tujuan (Mikel, 2004) : a. Mencegah terjadinya proses autolisis yaitu larutnya sel yang diakibatkan oleh proses – proses yang dipengaruhi enzim dari dalam sel itu sendiri.
b. Mencegah proses pembusukan yaitu proses penghancuran jaringan yang diakibatkan oleh aktifitas bakteri dan biasanya disertai dengan pembentukan gas. c. Memadatkan dan mengeraskan agar mudah untuk dipotong. Untuk jaringan yang lunak seperti jaringan otak akan sulit dipotong jika tanpa dilakukan oleh cairan fiksasi.
d.Memadatkan cairan koloid, mengubah konsistensi dari bahan seperti cairan yang terdapat didalam jaringan menjadi konsistensi lebih padat.
e. Mencegah keruskan struktur jaringan. Dengan proses masuknya cairan fiksasi kedalam sel lewat membran sel yang bersifat semipermeabel secara osmosis atau penyerapan.
Tahapan fiksasi mempunyaibeberapa tujuan sebagai berikut 1. Menjaga struktur dan komponen kimiawi .
2. Pencegahan kerusakan dan kematian. 3. Mengeraskan sel dan jaringan. 4. Pemadatan.
5. Opticaldiferensiasi. 6. Efek pewarnaan. 7. Menempelkan sel
Tujuan umum dari fiksasi jaringan adalah menjaga komponen sel dan
jaringan seperti ketika sel itu masih dalam kondisi hidup. Dalam proses fiksasi dan langkah–langkah selanjutnya dalam pembuatan sediaan jaringan tentu ada perubahan sibstansi pada komposisi dan tampilan komponen sel dan jaringan.
Secara teknis fiksasi bertujuan untuk mencegah atau menahan proses degeneratif yang dimulai segera setelah jaringan lepas dari kontrol tubuh dan kehilangan pasokan darahnya. Proses degeneratif ini kadangkala disebut dengan proses penurunan metabolisme atau penghentian metabolisme yang berujung terhadap kematian sel dan penghancuran sel. Selain dari proses degeneratif, kehilangan dan difusi zat terlarut didalam sel harus dihindari semaksimal mungkin dengan
mekanisme pengendapan atau koagulasi komponen ini dengan mekanisme “cross linked”.
C. Prinsip Fiksasi 1. Koagulasi
Koagulasi adalah proses pengumpulan partikel koloid didalam sel karena adanya penambahan bahan kimia atau pemberian perlakuan fisik sehingga
partikel-partikel tersebut bersifat netral dan membentuk endapan. Koagulasi pada proses fiksasi dapat terjadi pada protein yang ada didalam sel atau kandungan lainnya yang dianggap perlu dipertahankan akibat defrasi yang terus berlangsung. Secara kimiawi, protein didalam sel diubah secara fungsional maupun structural. Pengubahan tersebut dapat dilakukan dengan cara koagulasi dan atau membentuk senyawa adiktif lain. Pada penggunaan metode koagulasi untuk melakukan teknik fiksasi tidak semua zat dapat atau harus dikoagulasikan, contohnya penggunaan asam asetat sebagai komponen utama larutan fiksasi. Asam asetat dapat mengkoagulasikan kromatin namun tidak untuk protein. Metode ini memberi keuntungan ketika
digunakan dalam pembuatan sediaan metode parafinisasi dan pemeriksaan antibodi. Dengan metode ini dapat meningkatkan sensitifitas pengukuran akibat banyaknya paparan sel terhadap antigen. Namun ketika metode koagulasi dikombinasikan maka efek dari fiksasi akan memberikan efek lainya pada sel seperti pengintrolan tekanan osmotik sel, mengontrol kadar keasaman, dan mengembalikan kembali volume sel yang membesar ataupun menyusut akibat pemberian zat lain.
2. Presipitas
Secara umum pengertian dari presipitas adalah endapan yang terjadi akibat koagulasi yang terjadi sebelumnya. Presipitas yang diharapkan ketika proses fiksasi adalah presipitasi protein, yang mana protein inilah yang menjadi salah satu faktor utama pembusukan.
Presipitasi protein adalah pengendapan yang terjadi secara intersel akibat penggumpalan yang parsial. Presipitas ini disebabkan oleh berkurangnya tingkat kelarutan protein yang terjadi akibat adanya penambahan senyawa kimia yang berdampak terhadap perubahan senyawa kimia baru.
D. Larutan Fiksasi
1. Formalin 2. Larutan Bouin
BAB II CARA KERJA
A. Fiksasi Sediaan Histologik
spesimen yang masuk ke dalam laboratorium Patologi Anatomi pada umumnya terbagi menjadi dua yaitu spesimen jaringan dan spesimen sel.
adapun prosedur untuk fiksasi jaringan adalah sbb:
1. Dipotong spesimen jaringan / organ dengan ukuran kurang lebih 4mm
2. Di rendam dengan larutan fiksasi sesuai dengan tujuan pewarnaan atau komponen target
3. Ditunggu hingga tahao fiksasi selesai sempurna
4. Dicuci dengan air mengalir atau aquades (jika diperlukan) 5. Dilakukan tahan selanjutnya.
I. NBF
1. Larutan fiksatif yang paling umum digunakan untuk histopatplohi adalah larutan 4% formaldehid yang biasa disebut dengan formalin 10%.
2. untuk memastikan bahwa penggunaan formalin mencapai pH yang netral maka dilakukan dengan menambahkan garam sehingga disebut dengan netral buffered formalin, atau NBF.
3. Larutan NBF melakukan kerjanya sebagai agen infeksi bukan dengan koagulasi, tetapi dengan menambahkan ke sel-rantai dasar asam amino, terutama lisin, dan ikatan peptida dari atom amida nitrogen.
4. Untuk ukur jaringan yang kecil (10x10x3mm) ketika difiksasi menggunakan NBF selama 12-24 jam pada umumnya akan menunjukkan kondisi sitoplasma dan inti yang baik dan rinci.
5. Penggunaan formaldehida sebagian besar akan sempurna terfiksasi dalam waktu 24 jam, tetpi reaksi silang ini akan terus berlanjut selama hingga kurang lebih dua minggu.
6. Untuk spesimen yang lunak seperti otak manusia secara keseluruhan
membutuhkan waktu 2-6 minggu ketika difiksasi di NBF hingga menjadi cukup kuat untuk dipotong-potong.
7. Aspek yang perlu dipertimbangkan adalah suhu, ukuran wadah penyimpanan, rasio volume, konsentrasi garam buffer, pH, dan waktu inkubasi.
8. Fiksasi formalin biasanya dilakukan pada suhu kamar, menggunakan wadah spesimen rendah dan lebar untuk memunggkinkan penetrasi yang optimal dan kemudahan dalam pengambilan spesimen oleh teknisi.
9. Pilihan terbaik untuk rasio volume adalah 1:20 dan dimensi jaringan sebesar 3-4mm. Untuk mencegah pembekakan atau penyusunan dari sel-sel maka larutan dibuat isotonik dengan pH 7,2-7,4 dianjurkan dan juga untuk mempertahankan ultrastruktur sel serta meminimalkan distorse sel.
II. Larutan Bouin
• Larutan bouin sendiri berisi 10% formaldehida (25% formalin), asam asetat 0,9 M dan 0,04 M asam pirukat yang dilarutkan didalam air.
• Asam pikrat menembus jaringan agak lambat, mengentalkan protein dan dapat menyebabkan beberapa penyusutan.
• Selain penggunaan asam pikrat akan menyebabkan jaringan menjadi berwarnan kuning. pH larutan bouin berkisar 1,5-2
• penetrasaian menggunakan larutan bouin ini lebih cepat dari pada penggunaan NBF.
• Efek komplementer dari ketiga komponen penyusun larutan bouin ini bekerja baik untuk mempertahankan morfologi sel, specimen biasanya direndem dalam larutan bouin selama 24 jam.namun ketika penyimpanan terlalu lama didalam campurana ini dapat menyebabkan hidroklisis dan hilangnya DNA dan RNA. • Penggunaan larutan bouin ini sangat cocok ketika sediaan hendak dilakukan
pewarnaan menggunakana pewarnaan trichrome.
• Pewarnaan trichrome menggunakan kombinasi tiga pewarna dengan tambahan asamphospotungstic atau phosphomolibdic sebagai bagian dari peningkatan warna sitoplasma, serta kolagen dan komponen lainnya dari jaringan.
III. Ratio antara jaringan dgn volume larutan fiksasi
• Rasio yang tinggi antara larutan fiksatif dengan jaringan akan memastikan proses fiksasi yang baik. Rasio optimal volume larutan fiksasi dengan jaringan adalah 20:1.
• Dalam praktek sehari-hari masih didapatkan rasio yang lebih rendah dari ini. Dalam hal ini, yang terbaik adalah untuk mengganti cairan fiksatif secara periodik beberapa kali selama proses fiksasi.
• Pilihan terbaik untuk rasio volume adalah 1:20 dan dimensi jaringan sebesar 3-4mm.
DAFTAR PUSTAKA
1. Morgan,J,P. Y. K. Liu, and J. A. Smith. 2010. Semi-Microtechnique for the Biochemical Characterization of Anaerobic Bacteria. University of Toronto, Canada.315-318
2. Schichnes, Denis, Nemson, Jeffrey A, and Ruzin, Teven A. 2007. Microwave protocols for plant and animal paraffin microteqnique. The University Of California at Barkeley, CNR Biologycal Imaging Facility, 51-53
3. Mikel UV. 2004. Advanced laboratory methods in histologi and pathology. Washington, DC: Armed Forces Institute of Pathology American Registry of Pathology. Chapter 1,Immunohistochemistry; p 1-40.
Jawab Pertanyaan berikut
1. Jika saudara membeli formalin PA 40%, jika saudara mengambil 100 mL formalin PA ini, lalu ditambahkan aquades sampai 1000 mL. Maka berapa persen konsentrasi formalin yang saudara buat?
2. A. Berapa gr asam pikrat yang saudara butuhkan, jika saudara ingin membuat asam pikrat jenuh dengan penambahan etanol 95 % sebanyak 500 mL
B. Jika saudara mempunyai asam pikrat jenuh sebanyak 500 mL, berapa mL larutan Bouin yang saudara peroleh?
Jawab : 1. 𝑉1. 𝐾1 = 𝑉2.𝐾2 100 x 40 = 1000 x 𝐾2 4000 = 1000 x 𝐾2 𝐾2 = 4000/1000 𝐾2 = 4% 2. A. 95 % / 100 % x 500 ml = 475 gr
B. As. Pikrat : formalin : as. Asetat glasial 75 : 25 : 5 15 : 5 : 1 Diketahui as. Pikrat = 500 ml 500/ 15 = 33,33 Formalin? 33,33 x 5 = 166,67 As. Asetat glasial ? 33,33x 1 = 33,33
