MANIPULASI GEN PADA TUMBUHAN
# Lab. FKM – JBUB, Desember 2015 #Seiring dengan perkembangan ilmu pengetahuan dan teknologi para ilmuwan semakin tertantang untuk memahami bagaimana gen dapat diubah dan ditransfer dari satu organisme ke organisme lain. Setelah mempelajari dan mengetahui manipulasi gen tanaman diharapkan :
1) dapat memahami perkembangan modifikasi genetik pada organisme khususnya bagaimana transfer gen pada tumbuhan dapat terjadi.
2) mengetahui potensi manfaat/keuntungan yang dapat diperoleh dengan melakukan transfer gen
Modifikasi genetik tanaman diawali dengan introduksi karakter toleran herbisida dan tahan serangan insekta. Selanjutnya sifat-sifat lain menjadi menarik untuk diintroduksikan pada skala komersial, seperti sifat tahan terhadap infeksi fungi, bakteri dan virus; toleran stress (contoh kadar garam tinggi pada tanah), perubahan pigmen bunga dan modifikasi kandungan nutrisi tanaman. Proses transformasi gen pada tanaman sangat dibantu oleh bakteri tanah yaitu Agrobacterium tumefaciens.
2.1 Penyakit crown gall : rekayasa genetik secara alami
Agrobacterium tumefaciens menyebabkan penyakit crown gall pada banyak tanaman dikotil. Infeksi umumnya terjadi pada bagian tanaman yang mengalami pelukaan. Nama penyakit ini didasarkan pada terbentuknya gall di batang, cabang atau akar yang membengkak seperti tumor. Selama proses infeksi bakteri mentransfer sebagian DNAnya ke dalam sel-sel tanaman. DNA terintegrasi ke dalam genom tanaman dan menyebabkan produksi gall serta perubahan metabolisme sel. A. tumefciens dapat dimodifikasi membawa gen asing yang akan disisipkan ke sel tanaman.
Proses infeksi alami adalah sebagai berikut:
Gambar 3. Transformasi genetik tumbuhan oleh A. tumefaciens. A. tumefaciens memiliki satu (1) tumour-inducing (Ti) plasmid, yang mengandung kedua gen virulen (vir) dan satu region (daerah) transfer-DNA (T-DNA). Bakteri menempel pada sel tumbuhan, T-DNA dan protein-protein Vir ditransfer ke tumbuhan melalui sebuah transport channel. Di dalam sel tumbuhan, protein-protein Vir mendorong terjadinya integrasi T-DNA ke dalam genom tumbuhan.
Opine adalah asam amino yang disintesis tanaman di dalam crown gall dan berperan sebagai sumber C (kadang sumber N) bagi A. tumefaciens tetapi tidak dapat dimanfatkan oleh tumbuhan itu sendiri. Dalam hal ini, bakteri menggunakan perangkat biokimia sel tumbuhan untuk menghasilkan sumber makanan yang hanya dapat dimanfaatkan sendiri oleh bakteri. Selain itu terdapat gen yang mengkode enzim katabolisme opine (Gambar 4) yang juga terdapat di Ti-plasmid tetapi di luar daerah T-DNA. Gen yang bertanggungjawab mentransfer T-DNA ke dalam tanaman inang juga berada di luar region T-DNA. Gen-gen ini terdapat pada virulence region dan mengkode protein yang memfasilitasi transfer T-DNA dan integrasinya ke dalam genom sel tanaman.
2.2 Penggunaan A. tumefaciens untuk memodifkasi sel tanaman secara genetik
Rekaya genetik menunjukkan bahwa selama proses infeksi bagian DNA dari Ti plasmid A. tumefaciens diintegrasikan ke genom tumbuhan. Ti plasmids dapat diisolasi dan bila gen asing disisipkan pada posisi yang tepat maka transfer gen baru ke dalam tanaman dapat terjadi.
Latihan (1) : Pada Gambar 4, tiga posisi pada Ti plasmid ditandai dengan huruf A, B dan C. Mana yang menjadi tempat paling baik untuk menginsersikan gen asing?
Prinsip penggunaan Ti plasmid sebagai vektor proses transformasi pada tumbuhan adalah bahwa gen apapun yang berada pada sekuen antara border kiri dan kanan (i.e. di antara daerah T-DNA, Gambar 4) akan ditransfer ke dalam sel tumbuhan yang terinfeksi. Karena ukuran Ti plasmid cukup besar maka sulit dimanipulasi. Prosedur khusus yang disebut sistem vektor biner dirancang agar dapat menggunakan Ti plasmid artifisial yang berukuran lebih kecil.
Pada Ti plasmid artifisial (Gambar 5a) daerah T-DNAnya (di antara border kanan dan kiri) mengandung dua gen, yaitu gen yang akan ditransfer dan gen penanda untuk seleksi tanaman (seperti gen resistensi terhadap antibiotik kanamisin). Kanamisin yang disisipkan membantu mendeteksi apakah sel tumbuhan sudah tersisipi gen asing.
Gambar 5. Produksi tanaman transgenik menggunakan A. tumefaciens. (a) Ti plasmid artifisial. Daerah T-DNA yang mengandung gen asing dan gen penanda seleksi tanaman akan ditransfer ke dalam sel tumbuhan. (b) Ti plasmid artifisial dibentuk dalam E. coli, dan ditransfer ke A. tumefaciens yang mengandung vektor helper. Plasmid ini mengandung daerah vir yang mengkode protein untuk memfasilitasi transfer DNA dari bakteri ke sel tanaman. (c) Potongan T-DNA dari A. tumefaciens yang sudah dimodifikasi ditransfer ke dalam genom sel tumbuhan.
Hal yang penting adalah Ti plasmid artifisial mengandung origins of replication sehingga dapat digandakan di dalam A. tumefaciens maupun E. coli. Sebagian besar manipulasi yang dibutuhkan untuk memodifikasi Ti plasmid terjadi di E. coli (Gambar 5).
Latihan (2) :Ciri-ciri apa saja yang dimiliki Ti plasmid normal (Gambar4) tetapi menjadi hilang pada Ti plasmid artifisial (Gambar 5a)?
Latihan (3) : Ciri-ciri apa saja yang esensial untuk mentransfer dan mengintegrasikan gen-gen ke daerah T-DNA ?
Bila Ti plasmid artifisial sudah tersedia, selanjutnya dibutuhkan teknik yang dapat membawa daerah virulen di A. tumefaciens. Sistem vektor biner memberikan solusi dalam menyisipkan virulence region (vir) di plasmid kedua ini yaitu dengan menggunakan disarmed Ti plasmid (Gambar 5b) karena seluruh T-region telah dihilangkan. Sistem vektor ini sering disebut helper vector. Ti plasmid artificial ditransfer dari E. coli ke A. tumefaciens yang mengandung helper vector (Gambar 5b) melalui proses conjugation – istilah ini digunkan untuk menggambarkan bahwa transfer materi genetik dari satu bakteri ke lainnya terjadi secara langsung. A. tumefaciens yang telah mengandung Ti plasmid artifisial dan helper vector kemudian digunakan untuk menginfeksi sel-sel tumbuhan target. Selama infeksi gen virulen diaktifkan dan DNA yang berada di antara border kanan – kiri Ti plasmid artifisial ditranfer ke kromosom tumbuhan (Gambar 5).
2.3 Dari sel terinfeksi ke tanaman transgenik
Berbeda denga proses infek si secara alami, dimana hanya sel-sel pada bagian crown gall saja yang dipengaruhi oleh T-DNA yang disisipkan, para ilmuwan menginginkan dapat mensisipkan gen baru ke dalam semua sel-sel tumbuhan. Hal ini didukung oleh sifat totipoten yang dimiliki sebagian besar sel-sel tumbuhan Fortunately, most plant cells are totipotent, yang artinya bahwa sel apapun dan dari bagian tumbuhan manapun mampu membelah menjadi sel-sel yang dapat membentuk jaringan tumbuhan. Hal ini berarti bahwa dengan menggunakan hormon pertumbuhan yang sesuai dan teknik kultur jaringan maka sel tunggal tumbuhan yang terinfeksi dapat diinduksi untuk membelah dan membentuk tanaman utuh baru yang fertil.
Latihan (4) : Apa tujuan penggunaan kanamisin?
Ingat, bahwa sel –sel tanaman yang dimodifikasi secara genetik mengandung gen resisten kanamisin dari gen penan da seleksi tanaman yang ditambahkan/disisipkan (Sub 2.2 Gambar 5a). Hal ini berarti bahwa sel-sel tumbuhan tersebut dapat menghasilkan enzim yang mem-breakdown senyawa2 toksik, kecuali kanamisin. Sel-sel yang tidak tertransformasi tidak menghasilkan enzim tersebut sehingga akan mati.
Jaringan baru akan berkembang pada sisi perlukaan eksplan. Tunas baru yang berkembang dari jaringan ini dipisahkan dari jaringan eksplan dan dilakukan induksi akar. Selanjutnya, planlet yang tumbuh perlu diuji terhadap fenotip yang sesuai. Jika hasilnya positif maka planlet akan berkembang menjadi tumbuhan dewasa. Tanaman hasil modifikasi yang pertama kali dihasilkan disilangkan dengan varietas yang berproduksi tinggi enggunakan metode persilangan konvensional. Anakannya disilangkan beberapa kali dengan varietas yang sudah stabil sampai tanaman yang menunjukkan karakter transgenik benar-benar diperoleh.
Jawaban Latihan (1) :
Posisi A menunjukkan bahwa walaupun gen di daerah ini memfasilitasi transfer gen tetapi gen pada posisi A itu sendiri tidak ditransfer. Posisi B tidak mungkin terlibat karena bagian plasmid ini tidak ditrasnfer selama proses infeksi. Pada posisi C hanya T-DNA yang diintegrasikan ke dalam genom tanaman, sehingga gen akan disisipkan pada suatu tempat di daerah ini.
Jawab (Latihan 2) :
Gen penghasil tumor, daerah virulen dan gen-gen pengkode sintesis opin dan katabolisme.
Jawaban Latihan (3):
Only the virulence region is necessary. The tumour-producing genes and the genes related to opine synthesis and catabolism are not required. We do not want the modified plants to produce galls, or for the transgenic plants to synthesise opines – it would utilise valuable resources.
Jawab Latihan (4) : Kanamisin digunakan secara selektif untuk membunuh sel-sel tanaman yang belum tertansformasi.
