MULTI INFEKSI PADA UDANG Litopenaeus vannamei :
DIAGNOSIS DENGAN POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)
DAN REVERSE TRANSCRIPTASE- POLYMERASE CHAIN REACTION
(RT- PCR)
I st i Koeshar yani, Lila Gar d enia, d an H am b ali Sup r iyad i
Pusat Penelit ian dan Pengem bangan Perik anan Budidaya Jl. Ragunan 20, Pasar Minggu, Jakart a Selat an 12540 E- m ail: isti@cria.indosat.net.id; istisugama@yahoo.com (Naskah diterima: 19 April 2011; Disetujui publikasi: 15 Februari 2012)
ABST RAK
Penelit ian ini dilakukan karena adanya m asalah yang dihadapi sepert i pert um buhan udang yang tidak seragam (ukuran bervariasi), penam pakan klinis yang abnorm al dan o r g an yan g t i d ak sem p u r n a. Gej al a t er seb u t ak i b at d ar i i n f ek si p en yak i t yan g disebabkan oleh virus. Untuk m engetahui jenis virus yang m enyerang udang tersebut, m aka dilakukan analisis Polymerase Chain Reaction (PCR) dan Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT- PCR) m enggunakan berbagai jenis spesifik prim er WSSV, IHHNV, MBV, TSV, IMNV, dan PvNV. Sam pel udang yang secara visual norm al dan abnorm al diam bil lalu disim pan dalam larut an pengawet 90% Et hanol dan RNAlat er kem udian dianalisis di laboratorium dengan m etode yang sudah dikem bangkan oleh Pusat Penelitian dan Pengem bangan Perikanan Budidaya. Hasilnya m enunjukkan bahwa udang yang tum buh lam bat dan m em punyai rostrum bengkok dan warna otot daging m em utih ternyata tidak hanya diserang oleh satu virus nam un dua virus IHHNV dan IMNV. Hasil penelitian ini juga m engindikasikan bahwa udang yang terserang IHHNV akan tum buh lam bat walaupun tidak m em atikan, sedangkan udang yang diserang IMNV otot daging di tubuh m em utih terutam a pada bagian punggung dan dapat m enim bulkan kem at ian.
KATA KUNCI: m ult i inf ek si Lit openaeus vannam ei, IHHNV, IM NV, WSSV, PCR, RT- PCR
ABST RACT : M ult i inf ect ion of Litopenaeus vannamei shr im p: det ect ion by using Polymerase Chain Reaction (PCR) and Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT- PCR) method. By: Isti Koesharyani, Li l a Gar d en i a, an d H am b al i Su p r i yad i
that IHHNV infected shrimp will grow slowly, although there are not mortality. While the shrimp are IMNV infected by shown muscle white body, especially on the back and can cause mortality
KEYWORD S: m ult i inf ect ion Litopenaeus vannamei, IHHNV, IM NV, WSSV,PCR, RT- PCR
PENDAHULUAN
Budidaya udang t elah diket ahui sangat menguntungkan, bila produksi tidak mengalami k eg ag al an b ai k d al am p r o d u k si l ar va d i h at ch er i m au p u n p ad a saat p r o ses p er -tumbuhan di tambak. Namun, kenyataan yang ada di lapangan seringkali t erjadi berbagai masalah, kasus tersebut adalah adanya infeksi patogen baik bakteri, jamur, maupun patogen lain yaitu virus. Patogen yang disebabkan oleh virus disinyalir m erupakan kasus yang sering ditemukan dan menyebabkan kerugian karena tingkat kematian dapat mencapai 100% seperti pada kasus infeksi white spot syndrome virus (WSSV) pada budidaya udang P. monodon. Virus t ersebut m em punyai inang yang sangat luas, dapat m enyerang berbagai jenis udang penaeid, di antaranya P. monodon, P. japonicus, P. chinensis, P. Indicus, P. marguensis, dan L. vannamei (Kaso r n ch an d r a et al. , 1 9 9 8 , Koesharyani et al., 2001; Flegel. 1999 ; Kimura et al., 1996; Inouye et al., 1994; Rodriguez et al., 2003).
Beberapa k asus k em at ian m assal yang disebabkan oleh penyakit pada udang vaname pernah dilaporkan terjadi di beberapa tambak baik di Jawa maupun di luar Jawa. Adapun gejala-g ej al an ya yan gejala-g p er n ah d i l ap or k an sesu ai dengan jenis penyakit yang disebabkan oleh patogen virus. Menurut OIE (Aquaculture Asia Pacific, 2010), ada beberapa jenis penyakit vi r u s yan g m en yer an g u d an g d an p er l u diwaspadai diantaranya (ada 9 jenis penyakit), yai t u White Spot Syndrome Virus (WSSV), Infectious Hypodermal dan Haematopoetic Necrosis (IHHNV), Penaeus monodon-type baculovirus (MBV), Taura syndrome virus (TSV), Yellow head virus (YHV), Infectious myonecrosis virus (IMNV), Hepatopancreatic parvovirus (HPV), Gill associated virus (GAV), d an Macrobrachium rosenbergii noda virus (MrNV). Di m ana dari kesem bilan jenis virus t ersebut enam jenis virus (WSSV, IHHNV, MBV, YHV, IMNV, dan TSV) sudah m enginf ek si secara definitif pada budidaya udang P. monodon dan L. vannamei d i In d o n esi a. Nam u n t i d ak t ert ut up kem ungkinan akan adanya inf eksi
penyak it baru yang ak an m enginf ek si bila pencegahan dengan cara diagnosis rutin tidak d i l ak u k an . Sem en t ar a i n f ek si j en i s vi r u s tersebut diketahui sangat mematikan sehingga dapat m enim bulkan kerugian ekonom i yang tidak sedikit.
Infeksi WSSV sangat ganas dan mematikan p ad a b ud id aya ud ang wind u P. monodon, sedangk an pada udang L. vannamei yang berasal dari Amerika ternyata rentan terhadap serangan penyakit Taura Syndrome Virus (TSV) infeksi. Penyakit ini diketahui sejak tahun 1992 di Ecuador (Poulos et al., 1999). Penyakit lain yang dapat m enyerang udang L. vannamei adalah Infectious Myonecrosis Virus (IMNV) dan diket ahui sejak t ahun 2004 di Brazil. Kasus IMNV pert am a di Indonesia dilaporkan t elah m enginf ek si budidaya udang L. vannamei pada t ahun 2006 di Sit ubondo Jawa Tim ur (Senapin et al., 2007) dan inf eksi t ersebut sam pai saat ini m asih sering dit em ukan pada t am bak yang berm asalah. Penyakit lain yang dianggap t erbaru yang sudah dik et ahui di Belize pada tahun 2004 juga menyerang udang p u t i h i n i ad al ah Penaeus vannamei Noda Virus (PvNV), serangan virus ini dapat m eng-akibat kan nekrosia pada daging at au m uscle n ecr o si s, g ej al a i n i h am p i r sam a sep er t i serangan IMNV (Tang et al., 2007b). Umumnya u d an g L. vannamei i n i r en t an t er h ad ap inf eksi golongan RNA virus (TSV, IMNV, dan PvNV) d an b eb er ap a g ol ong an DNA vi r us sepert i WSSV dan IHHNV (OIE, 2006). Unt uk virus lain seperti YHV dan MBV masing- masing pernah dit em ukan, t et api int ensit as inf eksi t idak sepert i pada virus lainnya. Pada t ahun 2009 kasus infeksi MBV masih ditemukan pada b u d i d aya u d an g P. monodon o r g an i k d i Sidoarjo, Jawa Timur (Koesharyani et al., 2009 unpublish).
Den g an b an yak n ya k ej ad i an i n f ek si penyakit di lapangan khususnya virus, m aka perlu dilakukan pem ant auan dan diagnosis guna mencegah masuknya patogen baru yang akan m em perparah kondisi perudangan di Indonesia. Oleh karena itu, untuk m engetahui adanya patogen maka perlu dilakukan analisis
det eksi rut in m enggunakan PCR dan RT- PCR m en g g u n ak an b er b ag ai m acam sp esi f i k primer. Diharapkan hasil yang diperoleh dapat m en en t u k an st at u s p en yak i t seh u b u n g an dengan pengem bangan udang int roduksi L. vannamei.
BAHAN DAN METODE
Sampel Udang L. vannamei
Sam pel udang L. vannamei norm al dan abnormal yang berumur ± 2 bulan berasal dari lok asi budidaya udang di Sit ubondo, Jawa Tim ur. Sam pel udang diam bil dengan gejala sepert i ukuran yang t idak seragam walaupun berum ur sam a, abnorm alit as bent uk rost rum (m em endek dan bengkok) sert a warna t ubuh yang m em ut ih. Sam pel selanjut nya disim pan dalam dua larut an pengawet yang berbeda yaitu pada 90% Ethanol untuk digunakan dalam pengujian DNA virus dengan metode PCR, dan RNAlater® (Qiagen), unt uk digunakan dalam analisis RNA virus dengan m et ode RT- PCR. Pada set iap individu sam pel udang kem udian diekstrak DNA dan RNA nya. (Ektraksi DNA dan RNA dilakukan pada set iap individu sam pel udang).
Ekstraksi DNA
Persiapan lysate: Masing- masing sampel udang uji diam bil jaringan insang/ pleopod seberat 10 m g, dim asuk k an dalam (2 m L) mikrotube Precellys Ceramic ditambahkan 250 µL Lysis buffer (Mole product). Jaringan udang d i h an cu r k an d en g an al at Ho m o g en i z er PeqLab dengan kecepatan 5000 rpm selama 3 m enit dengan penghent ian kecepat an t iap 1 menit sebanyak 3 kali. Selanjutnya homogenat diink ubasi pada suhu 37oC selam a 1 j am . Sebanyak 10 µL Rnase A (Dnase & Prot ease Free) 10m g/ m L dit am bahkan unt uk m eng-h i l an g k an RN A d an p r o t ei n s eb ag ai p en g h am b at am p l i f i k asi d an i n k u b asi k an kem bali pada suhu 37oC selam a kurang lebih 45 menit kemudian ditambahkan 10 µL Protein-ase- K (10 m g/ m L) dan diinkubasi pada suhu 55oC sat u m alam , selanj ut nya lysat e yang diperoleh akan digunakan pada proses isolasi genom DNA.
Isolasi genom DNA: Isolasi genom DNA dilakukan dengan Gen Mole StripTM DNA Tisue secara Robot ik, yait u dengan m em indahkan sebanyak ± 200 µL Lysat e (supernat an) yang telah diperoleh dari ektraksi ke dalam tabung St rip Mole dan dit em pat kan sedem ikian rupa
d al am r ak p ad a m esi n r ob ot i k k em u d i an diprogram dan dioperasikan selama 45 menit. Hasi l ak h i r b er u p a 1 0 0 µ L g en o m DNA, selanjut nya dipindahkan ke dalam m ikrot ube st er il (DNAse & Rnase Free). Genom DNA digunakan untuk am plifikasi DNA virus target d en g an m en g g u n ak an PCR d an sp esi f i k primer.
Ekstraksi RNA
Per si ap an l ysat e: Sam p el u d an g u j i diam bil jaringan insang/ pleopod seberat 25 m g, dim asuk k an dalam (2 m L) m ik r ot ube Precellys Ceram ic dit am bahkan 600 µL Lysis Buffer (Mole product). Jar ingan ud ang d i-hancurkan dengan alat Hom ogenizer PeqLab dengan kecepat an 5000 rpm selam a 3 m enit sebanyak 2 kali, hom ogenat diinkubasikan p ad a su h u r u an g sel am a 1 0 - 1 5 m en i t , kem udian di- sent rif ugasi dengan kecepat an 14 000 rpm selam a 1 m enit. Sebanyak 600 µL supernatan diambil dan ditempatkan ke dalam mikrotube baru dan ditambahkan 600 µL Etha-nol 80%.
Isolasi Genom RNA: Isolasi genom RNA dilakukan dengan m enggunakan SurePrepTM True Tot alTM RNA purif icat ion Kit (Fisher Bio Reagent), p r o s es aw al i s o l as i ad al ah pengikatan genom RNA dengan m em asukkan 2 x 600 µL lysat e dalam spin colum n dan d i sen t r i f u g asi m asi n g - m asi n g d en g an kecepatan 14 000 rpm selama 1 menit, setelah RNA t erik at pada spin column selanj ut nya dilakukan proses pencucian RNA.
Pencucian (w ashing), k e d al am spin column dit am bahkan 400 µL wash solutian kem udian disent rif ugasi dengan kecepat an 14000 rpm selam a 1 m enit . Proses t ersebut dilakukan sebanyak t iga kali pada pencucian yang ketiga, lama sentrifugasi menjadi 2 menit. Column d ib iar k an seb ent ar hingga k er ing kem udian dilanjut kan dengan proses pen-cairan RNA.
Konsentrasi DNA/ RNA: DNA diukur kwalitas dan kuant it asnya dengan m enggunakan alat pengukur DNA “nanodrop”. Kem urnian DNA diukur pada panjang gelombang 260 dan 280 nm (OD260/ 280= 1.6- 1.8). DNA dan RNA yang baik dalam jum lah dan kem urniannya selanjut nya digunakan pada proses am plif ikasi dengan PCR.
Amplifikasi DNA
Am plif ikasi PCR unt uk jenis inf eksi dari virus DNA dilakukan dengan menggunakan 5x Green GoTaq Flexi Reaction Buffer (Prom ega). Am plif ikasi dilakukan dengan t ot al reaksi 10 µL. Sebanyak 1 µL DNA (10 ng) dit am bahkan mastermix dengan konsentrasi 3,5 mM MgCl2, 0,3 m M dNTP m ix , 0,5 pM m asing- m asing Reverse dan Forward prim er, 0,5 U GoTaq Polymerase (Prom ega) dan 1 x Green GoTag Reaction Buffer (Prom ega). Proses am plifikasi m en g g u n ak an m esi n PCR SpeedyCycler (Tretiakov & Saluz US Patent 6.556.940). Profil amplifikasi untuk masing- masing virus IHHNV
dan MBV dapat dilihat pada Tabel 2, sedangkan unt uk WSSV dapat dilihat pada Tabel 3.
Amplifikasi c- DNA dengan RT- PCR
Amplifikasi untuk virus- virus RNA dilakukan dengan m enggunakan AccssQuickTM RT- PCR System Promega. Amplifikasi dilakukan dengan t ot al reaksi sebanyak 10 µL: 2 µL DNA (10 ng) ditam bahkan mastermix dengan konsentrasi, 0,5 pM m asing- m asing Reverse dan Forward prim er, dan 0,2 x AccssQuickTM Mast er m ix (Prom ega). Unt uk m endiagnosa at au m eng-am plifikasi c- DNA virus m enggunakan m esin PCR SpeedyCycler (Tretiakov & Saluz US Patent 6.556.940) prof il am plif ikasi unt uk m asing-masing virus IMNV, TSV, dan PvNV dapat dilihat pada Tabel 4.
Elek t rof oresis
Hasil am plif ikasi selanjut nya dielekt ro-phoresis pada 2% agarose gel, dengan larutan SB Bu f f er (1 0 x 1 0 0 m M NaOH yan g d i -Tabel 1. Prim er spesifik yang digunakan dalam m endet eksi beberapa jenis virus yang
m enginfeksi udang L. vannamei
Table 1. The specific primers used to detect of several types of viruses infected on L. vannamei shrimp
Ukuran amp liko n
Am plicon size
(bp)
WSSV R: 5’- AgA Tag CgA AAC AAC ATC CAA C-3’ 113 F: 5’- ATg gTA CAT TTT CCg ggC g -3’ Gen Bank U50923.1
IHHNV R: 5’ - ggC CAA gAC CAA AAT ACg AA -3’ 389
F: 5’ - Cgg AAC ACA ACC CGA CTT TA -3’ Tang et al. (2007) (a) Gen Bank.AF218266
R: 5’ - Tgg CAT gCA CTC CCT gAg AT -3 526 F: 5’ - CAT ATC ggC CgA ATA gTg gTC -3’ Jena Germany
TSV R: 5’- AAg TAg ACA gCC gCg CTT gC-3’ 231 F: 5’- TCA ATg AgA gCT Tgg TCC-3’ Nunan et al. (1998)
Gen Bank AF277675 Nt.6910-7140
IMNV R: 5’- TgA AAA, ATA AGC TgT gCC CCA TgT T-3’ 600
F: 5’- ggC AAT TTC AAC CTA ATT CTA AAA C-3’ Senapin et al. (2007) Gen Bank EF061744
R: 5’- CCg TTT gAA TTT CAg CAA CA -3’ 339
F: 5’- CTg TCT CAC Agg CTg gTT CA-3’ Tang et al. (2007) (b) MBV
Pv NV
Sekuen p rimer 5’ ~ 3’
Pr im er s seq uen ces 5’ ~ 3’
Jenis virus
T ype of vir us
Tabel 4. Profil suhu amplifikasi untuk mendeteksi IMNV, TSV, dan PvNV dengan PCR Table 4. Temperature profile amplification for IMNV, TSV, and PvNV detection by PCR
Ko nd i si T e mp e rat ur Wa k t u ( d e t i k ) Si k l us Con d it i on T em per a t ur e (oC) T i m e (secon d ) Cycle
Tran skrip si t e rb alik 4 8 1 20
Reverse transcriptation 9 5 20
De n at u rasi aw al 9 5 10
Pre-denaturation
Pe n e mp e lan 5 8 (IMNV & TSV)
Annealing 5 5 (Pv NV)
Pe man jan g an 7 2 20
Ex t ension
Pe man jan g an akh ir 7 2 1 20 1
Final elongation
1
10 4 0
Tabel 3. Profil suhu amplifikasi untuk mendeteksi WSSV dengan PCR Table 3. Temperature profile amplification for WSSV detection by PCR
Ko nd i si T e mp e r a t ur Wa k t u ( d e t i k ) Si k lus Con d i t i on T em per a t ur e (oC) T i m e (secon d ) Cycl e
De n at u rasi aw al 9 5 1 2 0 1
Pre-denaturation
De n at u rasi 9 5 5
Denaturation
Pe n e mp e lan / Pe man jan g an 6 0 2 0 Annealing/Ex tension
Pe man jan g an akh ir 7 2 1 2 0 1
Final elongation
4 5 Tabel 2. Profil suhu amplifikasi untuk mendeteksi IHHNV dan MBV dengan PCR Table 2. Temperature profile amplification for IHHNV and MBV detection by PCR
Ko nd i si T e mp e ra t ur Wa kt u ( d et i k) Si k l us Con d it ion T em per a t ur e (oC) T im e (secon d ) Cycle
Den atu rasi aw al 95 1 20 1
Pre-denaturation
Den atu rasi 95 10 4 5 (IHHNV)
Denaturation
Pe n emp e lan 58 10
Annealing
Pe manjan g an 72 20 35 (MBV)
Ex tension
Pe manjan g an akh ir 72 1 20 1
t am b ahk an H3BO3 at au Bor ic Acid sam p ai p H 8 ). Hasi l el ek t r o f o r esi s sel an j u t n ya didokum entasikan m enggunakan Geldoc. HASIL DAN BAHASAN
Sam pel udang yang diperoleh pada bulan Juli 2009 dengan lam a pem eliharaan sekitar 2 bulan berasal dari tambak dengan dasar beton, m enggunakan sist em sirkulasi dan t andon. Benih ud ang L. vannamei yang dit ebar di t am bak sekit ar PL 10- 12, berasal dari induk Spesifik Pathogen Free (SPF) dengan kepadatan berkisar 80- 100 ekor/ m2.
Gej ala udang sak it yang dit em uk an di lapangan adalah adanya nekrosa pada ot ot bagian at as perut dan ek or disert ai warna
putih pada bagian otot punggung ke arah ekor juga nekrosia di ujung- ujung ekor (Gambar 1). Hasi l p en g am at an j u g a d i p er ol eh ad an ya pertum buhan udang yang tidak seragam atau ukuran yang bervariasi dan disert ai bent uk rostrum yang abnormal atau bengkok (Gambar 2). Kondisi udang di lapangan ham pir sem ua menampakkan gejala yang sama, seperti telah dij elask an di at as. Oleh k arena it u, unt uk penguj ian dalam penelit ian hanya diam bil beberapa cont oh (8 ekor udang) yang dapat m ewak i l i k on d i si at au k ead aan u d an g d i lapangan.
Berdasarkan sam pel yang diperoleh baik yang sehat secara visual m aupun yang sakit , set elah dilakukan diagnosa beberapa jenis virus (WSSV, IHHNV, MBV, TSV, IMNV, dan PvNV)
Gambar 1. Sam pel udang L. vannamei dengan gejala warna udang put ih (opaque) dan kerdil (A) disertai necrosia pada ekor (B)
Figure 1. Samples of L. vannamei shrimp with symptoms of white shrimp color (opaque) and stunted (A), necrosia accompanied on the tail and (B)
Gambar 2. Sam pel udang L. vannamei yang digunakan (A) norm al, abnorm al dan ukuran udang yang tidak seragam, (B) rostrum yang bengkok
Figure 2. Samples of L. vannamei shrimp were used testing (A) healthy, normal, abnor-mal and the size of shrimp that are not uniform, (B) and a bend rostrum
7 8
A B
menggunakan teknik PCR dan RT- PCR dengan spesifik prim er (Tabel 1) t ernyat a m enunjuk-k an ad an ya i n f eenunjuk-k si . Hasi l yan g d i p er ol eh m enunjukkan bahwa 75% sam pel t erinf eksi oleh IMNV dan 100% sampel terinfeksi IHHNV. Dar i p er hit ungan d iagnosa t er nyat a t id ak sedikit (75%) udang uji t erinf eksi oleh kedua jenis virus secara bersamaan IHHNV dan IMNV (Tabel 5). Kasus natural multi infeksi ini sering dit em ukan pada udang penaeid, walaupun variasi jenis virus berbeda pada set iap kasus. Hal ini dit unjukkan sepert i pada kasus m ult i inf eksi WSSV dan MBV yang dit em ukan pada budidaya udang P. monodon di Philippine (Nat ividad et al., 2006). Bahkan dit em ukan kasus ‘triple infection’, 3 jenis virus MBV, HPV, dan WSSV pada P. monodon di India walaupun MBV dan HPV dif init if posit if dengan pem e-riksaan histopatologi dan WSSV positif dengan single step PCR (Manivannan et al., 2002).
Infeksi IMNV pada budidaya tambak udang L. vannamei sam pai saat ini m asih sering t erjadi dengan int ensit as yang cukup t inggi terjadi ham pir setiap tahun baik di Jawa m au-pun di luar Jawa. Monitoring yang dilakukan p ad a aw al t ah u n 2 0 1 0 d i p er o l eh k asu s kem at ian dengan gejala TSV dan IMNV pada tambak L. vannamei di Banyuwangi, Jawa Timur (Laporan monitoring 2010 unpublish). Infeksi IMNV pada budidaya udang L. vannamei yang t erident if ikasi pada t ahun 2004 juga m eru-pakan kasus inf eksi yang cukup m erugikan. Keb er ad aan p enyak i t t er seb ut ak an t er us berada selam a dalam pert um buhan udang di t am bak, dan secara kum ulat if akibat inf eksi
IMNV ini dapat m em at ikan udang budidaya sampai dengan 70% (Nunes et al. dalam Poulos et al., 2006; Poulos & Light ner, 2006). Hasil pengujian infeksi buatan terhadap infeksi IMNV menunjukkan bahwa IMNV dapat menginfeksi p ad a k et i g a j en i s u d an g L. vannamei, L. stylirostris, d an P. monodon w al au p u n m em punyai ef ek yang berbeda (Tang et al., 2005) dan kem ungkinan dapat m enyerang udang penaid lainnya. Dalam nom enklat ur virus, IMNV ini t erm asuk ke dalam RNA virus double-stranded, family Totaviridae, yang t idak beram plop (non-enveloped), berbent uk icosahedral dengan diam et er virion 40 nm (Senapin et al., 2007).
Akurasi det eksi virus agar m endapat kan hasil yang m aksim al dengan m enggunakan t ek nik PCR/ RT- PCR, yang dit ent uk an oleh beberapa faktor, seperti penyimpanan sampel pada larut an yang t epat dan ket epat an jenis primer yang digunakan. Penyimpanan jaringan unt uk pem eriksaan virus dari gol RNA sepert i TSV, IMNV, dan PvNV dan lain- lain dalam larutan ethanol 90% bisa mengalami kerusakan sehingga tidak dapat dideteksi kembali adanya p at o g en vi r u s. Seb ai k n ya sam p el u n t u k golongan RNA virus disim pan dalam larut an RNAl at er , d ar i h asi l p er co b aan t er n yat a RNAlat er dapat m enjaga kest abilan RNA dan dari hasil pengamatan preservasi penggunaan sampel jaringan yang disimpan selama 1 tahun d alam lar ut an RNAlat er p ad a suhu - 2 0oC k eadaan RNA m asih t et ap baik dan st abil dibandingkan dengan penyim panan jaringan dalam larutan Ethanol 90% (Novita et al., 2009).
Tabel 5. Hasil diagnosa enam jenis virus WSSV, MBV, IHHNV, TSV, IMNV, dan PvNV pada udang L. vannamei
Table 5. Diagnostic results of six types of viruses WSSV, MBV, IHHNV, TSV, IMNV, and PvNV on L. vannamei shrimp
WSSV M BV IH H NV T SV IM NV PvNV
Normal - - + - +
-Abnormal (Dwarf) - - + - -
-Normal - - + - +
-Abnormal (Whitish) - - + - +
-Normal - - + - +
-Abnormal (Whitish) - - + - +
-Abnormal c urv ed-rostrum - - + - -
-Abnormal (Whitish) - - + - +
-D iag no st ik virus (Vir uses d et ect ion) Samp el ud ang vaname
Pem i l i h an d an k et ep at an p r i m er j u g a san g at m en en t u k an h asi l d i ag n o sa. Ad a beberapa jenis prim er yang dapat digunakan dalam m endiagnosa IMNV. Dalam percobaan ini, primer IMNV yang digunakan adalah primer yang didesain oleh (Senapin et al., 2 0 0 7 ) dengan t arget berat m olekul 600 bp. Prim er t ersebut m em punyai sensit ivit as yang lebih baik dibandingkan primer lain yang pernah ada (Poulos & Light ner, 2006). Pada penelit ian ini penggunaan spesif ik prim er dengan t arget berat molekul 600 bp. merupakan hasil sekuen dari udang L. vannamei yang t erinf eksi IMNV di Indonesia sehingga k eberhasilan dalam m endet eksi adanya IMNV akan lebih spesif ik dan tidak menghasilkan false negative (negatif p al su ). Sek u en su su n an n u k l eo t i d a yan g berasal dari IMNV Indonesia ini sudah di-m asu k k an k e d al adi-m Gen Bank d en g an accession no. EF061744 (Senapin et al., 2007). Hasi l an al i si s sam p el u j i d en g an RT- PCR menggunakan primer IMNV dapat dilihat pada Gambar 3.
Kasus lain yang ditemukan pada penelitian ini yait u adanya inf eksi IHHNV. Dari sam pel yang diperoleh dari lapangan baik it u udang yang t erlihat sehat m aupun sakit , t ernyat a sam p el uj i t er seb ut t er inf ek si 1 0 0 % (8 / 8 ) oleh IHHNV. Diket ahui bahwa IHHNV dapat
m em at ik an d an sang at p at og en t er had ap udang jenis L. stylirostris (Lightner & Redman, 1998). Virus t ersebut dik et ahui t idak m e-m at ikan bila e-m enginf eksi udang L. vannae-mei at au P. monodon, n am u n IHHNV h an ya m enyebabkan pertum buhan yang lam bat dan p er t u m b u h an r o s t r u m y an g ab n o r m al (bengkok) (Tang et al., 2007a; Bonnichon et al., 2006; Flegel et al., 2004; Tang et al., 2003; Kalagayan et al., 1991). Hal t ersebut sam a seperti kasus yang diperoleh dalam penelitian ini, udang menampakkan gejala pertumbuhan yang t idak norm al dengan beragam ukuran disert ai bent uk rost rum yang abnorm al at au bengkok (Gambar 2). Walaupun infeksi IHHNV t idak m em at ik an pada udang t et api dapat m enim bulkan kerugian ekonom i oleh karena t erj adi peningk at an Feed Conversion Ratio (FCR) p ak an . Ber d asar k an k ar ak t er i st i k m orf ologi dan biokim ia, IHHNV t erm asuk ke dalam golongan Parvoviridae dengan bent uk icosahedral DNA non- enveloped yang ber-diameter 22 nm (Bonami et al., 1990). Dari hasil penelit ian m enyat ak an bahwa penyebar an virus IHHNV dapat dit urunkan secara vert ikal m elalui induk bet ina, yait u pada ovari udang b et i n a yan g t er i n f ek si . Sem en t ar a d ar i sperma udang jantan yang positif IHHNV tidak menurunkan IHHNV. Dengan demikian IHHNV ini dit urunkan dari induk bet ina yang posit if
Gambar 3. Profil am plifikasi PCR sam pel udang L. vannamei yang terinfeksi IMNV pada t arget berat m olekul 600 bp. 1: Norm al; 2: Abnorm al/dwarf; 3: Norm al; 4: Abnorm al/whitish; 5: Norm al; 6: Abnorm al/whitish; 7: Abnorm al/ curved rostrum; 8: Abnormal/whitish, N: Negative Control, M: Marker Low Range Figure 3. Profile of PCR amplification of shrimps samples L. vannamei infected IMNV
on the target molecular weight of 600 bp. 1: Normal; 2: Abnormal/ dwarfs; 3: Normal; 4: Abnormal/whitish; 5: Normal; 6: Abnormal/whitish; 7: Abnor-mal/curved rostrum; 8: Abnormal/whitish, N : Negative Control, M: Marker Low Range
8 0
1500
600
850
400
200
t erinf eksi IHHNV (Mot t e et al., 2003). Oleh karena itu, dalam persiapan perbenihan udang, pemeriksaan induk yang akan digunakan untuk produksi larva dalam hat cheri harus benar-benar diperhatikan terutama dalam mendeteksi ada- t idaknya inf eksi khususnya IHHNV pada induk bet ina yang ak an digunak an dalam pembenihan.
Ada beberapa jenis prim er yang dapat digunakan dalam deteksi secara rutin terhadap IHHNV (OIE, 2006; Tang et al., 2003; Tang et al., 2007a) dan t eknik det ek si lain sepert i Ramification Amplification Assay (RAM) yang bisa digunakan dalam alternatif deteksi (Teng et al., 2006). Dalam penelit ian diagnost ik IHHNV, digunakan spesifik primer yang sangat sensit if dan t ercat at dalam Gen Bank dengan Asseccion No AF 218266 dengan t arget berat m olekul 389 bp. Prim er ini bisa digunakan unt uk m endiagnosa sem ua jenis IHHNV dari lokasi berbagai negara serta dapat digunakan untuk deteksi rutin (Tang et al., 2007a). Telah dijelaskan di at as bahwa sam pel udang yang kelihat an sehat (norm al) dan abnorm al pada penelitian ini ternyata positif terinfeksi IHHNV. Hasi l d i ag n o st i k d ap at d i l i h at d ar i h asi l amplifikasi dengan PCR (Gambar 4).
Infeksi IHHNV yang ditemukan bersamaan dengan infeksi IMNV pada sampel L. vannamei ini, tidak menyebabkan kematian yang berarti. Fenom ena ini kem ungkinan disebabkan oleh
ad an ya k o m p et i si at au p er b ed aan p o l a replikasi virion pada kedua virus t ersebut di dalam seluler t ubuh udang. Kasus sepert i ini pernah terjadi pada percobaan infeksi buatan WSSV pada L. vannamei yang posit if IHHNV, dimana tingkat kematian adanya infeksi WSSV dapat diham bat k arena k em ungk inan t er-ganggunya WSSV dalam m ereplikasi didalam t ubuh udang dibandingkan dengan inf ekesi WSSV ke L. vannamei yang negat if t erinf eksi IHHNV. (Bonnichon et al., 2006; Melena et al., 2006). Kondisi ini sam a dengan apa yang ditemukan pada kasus yang terjadi pada udang sampel yang dianalisis pada tulisan ini. Di mana kem at ian yang t erjadi t idak t erlalu banyak, k em ungk inan k asus ini ad anya f enom ena t ersebut di at as. Ak ibat nya adalah uk uran udang yang sangat bervariasi karena adanya inf eksi IHHNV dan penam pilan udang yang t idak begit u cerah akibat inf eksi IMNV. Oleh karena itu, kualitas penggunaan induk sangat perlu diperhat ikan didalam m elakukan pem -benihan udang vannam e. Pencegahan adalah t indakan yang harus dilakukan dengan cara m elakukan det eksi dan monitoring adanya pat ogen penyakit .
Un t u k p en ceg ah an d ap at d i l ak u k an dengan cara m endet ek si dengan baik dan b en ar . Saat i n i t el ah b er k em b an g t ek n i k det eksi at au diagnosa dengan Real-Time PCR atau Quantitatif PCR (Q- PCR). Teknik tersebut
Gambar 4. Profil amplifikasi PCR sampel udang L. vannamei yang terinfeksi IHHNV pada target berat molekul 389 bp. 1: normal; 2: abnormal/dwarf; 3: Normal; 4: abnormal/whitish; 5: normal; 6: abnormal/whitish; 7: abnormal/ curved rostrum; 8: abnormal/whitish, M: marker low range, (- ): negative control, (+ ): positive control
Figure 4. Profile PCR amplification samples of shrimps IHHNV-infected L. vannamei on the target molecular weight of 389 bp. 1: normal; 2: abnormal/dwarfs; 3: normal; 4: abnormal/whitish; 5: normal; 6: abnormal/whitish; 7: abnormal/curved rostrum; 8: abnormal/whitish, M: marker low range, (-): negative control, (+):positive control
389 389
m em p u n y ai k eu n g g u l an y ai t u t i n g k at sen s i t i v i t as y an g s an g at t i n g g i s el ai n m en d et ek si secar a k wal i t at i f j u g a d ap at mengetahui kwantitas virion di dalam individu yang terinfeksi oleh suatu virus. Pada individu dengan serangan awal suat u inf ek si virus, m aka dengan m udah dapat diket ahui adanya inf eksi walaupun dalam jum lah virion sangat sed i k i t / k eci l . Tek n i k t er seb u t d ap at d i -aplikasikan pada ikan at au hewan lain yang ber sif at carrier. Tek nik Real-Time PCR ini sudah banyak dit erapkan di ant aranya dalam m endiagnosa virus IHHNV dan WSSV pada udang (Dhar et al., 2001), sedangkan pada ikan tawar Koi digunakan dalam mendeteksi infeksi KHV (Gilad et al., 2004).
Selain it u m enurut Tang et al. (2007b), m engat ak an bahwa t erdapat k asus inf ek si b ar u yan g d ap at m en yer an g u d an g yan g dinam akan P. vannamei Nodavirus atau PvNV. Walaupun sam pai saat ini di Indonesia kasus i n f ek si PvNV t er seb u t b el u m p er n ah d i -tem ukan, nam un tidak tertutup kem ungkinan ak an ad anya p enyeb ar an, sehingga d ap at berakibat merugikan dalam budidaya udang L. vannamei. Den g an k et er sed i aan i n d u k L. vannamei yan g su d ah d i d om est i k asi d an t ersert if ikasi bebas virus (WSSV, IHHNV, TSV, IMNV, dan PvNV), diharapkan dapat menghin-dari int roduksi penyakit virus di Indonesia. KESIMPULAN
1. Hasil diagnosa yang diperoleh m em per-l i h at k an b ah wa 7 5 % sampper-le t er i n f ek si IMNV, 1 0 0 % t er inf ek si IHHNV dan 7 5 % kasus m ult i infeksi IHHNV dan IMNV pada budidaya udang L. vannamei.
2. Kasus m ult i infeksi IHHNV dan IMNV t idak menimbulkan kematian massal pada udang L. vannamei.
3. Penggunaan sam pel dengan preservasi yang t ep at d an p r im er sp esif ik , d ap at meningkatkan validitas diagnosa
SARAN
1. Dalam kebijakan kedepan harus diupaya-kan st andarisasi diagnosa unt uk seluruh laboratorium yang ada di Indonesia. 2. Perlu adanya pem ant auan rut in dengan
standar diagnosa akan adanya infeksi virus pada udang introduksi L. Vannamei. 3. Perlu adanya kont rol yang ket at t erut am a
im port udang j enis L. vannamei unt uk mencegah introduksi penyakit baru.
UCAPAN TERIMA KASIH
Diucap k an t er im a k asih k ep ad a lab o-ratorium beserta staf Hans- Knoll Institute (HKI) Jen a Ger m an y yan g su d ah m em b er i k an kesempatan dalam melakukan diagnosis dalam penelit ian t ersebut di at as.
DAFTAR ACUAN
Aquaculture Asia Pacific March/ April. 2010. Real- time PCR shrimp virus detection, 6(2): 46.
Bonnichon, V., Light ner, D.V., & Bonam i, J.R. 2006. Viral int erference bet ween infec-t ious hypoderm al and hem ainfec-t opoieinfec-t ic ne-crosis virus and whit e spot syndrom e vi-rus in Litopenaeus vannamei. Dis. Aquat. Org., 72: 179- 184.
Bonami, J.R., Trumper, B., Mari, J., Brehelin, M., & Ligtner, D.V. 1990. Purification and charac-terization of the infectious hypodermal and hem at opoiet ic necrosis virus of penaeid shrimps. J. Gen Virol., 71: 2,657- 2,664. Dhar, A.K., Roux , M.M., & Klim pel, K.R. 2001.
Detection and quantification of infectious hypoderm al and haem at opoiet ic necrosis virus and white spot virus in shrim p using real- time quantitative PCR and SYBR green chemistry. Journal of Clinical Microbiology, p. 2,835- 2,845.
Flegel, T.W., Nielsen, L., Thamavit, V., Kongtim, S., & Pasharawipas, T. 2004. Presence of m ult iple viruses in non- diseased, cult i-vated shrimp at harvest. Aquaculture, 240. 55- 68.
Fl eg el , T.V. 1 9 9 9 . An over vi ew of p r awn viral disease work in Thailand: PCR f or shrimp disease diagnosis. Moleculer diag-nostic for shrim p viruses in The Asian Re-gion. ACIAR- Mahidol Univ. Thailand, L3- 1– L3- 11.
Gi l ad , O., Yu n , S., Zag m u t t - ver g ar a, F.J., Leu t en eg g er , C. M. , Ber co vi er , H. , & Hedrick, R.P. 2004. Concentration of a koi herpesvirus (KHV) in tissue of ex perim en-t ally infecen-t ed Cyprinus carpio koi as as-sessed by real- time TagMan PCR. Diseases of Aquatic Organism, 60:179- 187. Inouye, K., Miwa, S., Oseko, N., Nakano, H.,
Kim ura, T., Mom oyam a, K., & Hiraoka, M. 1994. Mass m ortalities of culured kurum a shrimp Penaeus japonicus in Japan in 1993: El ek t r on m i cr oscop i c evi d en ce of t h e causative virus. Fish Patologhy, 29(2): 149-158.
Kasornchandra, J., Boonyaratpalin, S., & Itam i, T. 1998. Detection of white- spot syndrome in cult ured penaeid in Asia. Microscopic observat ion and polym erase chain reac-tion. Aquaculture, 164: 243- 251.
Kalagayan, H., Godin, D., Kana, R., Hagino, G., Sweeney, J., Wyben, J., & Brook, J. 1991. IHHNV virus as an etiological factor in runt-d ef or m i t y syn runt-d r om e (RDS) of j u ven i l e Penaeus vanname cultured in Hawaii. Jour-nal World Aquaculture Society, 22: 235- 243. Kimura, T., Yamano, K., Nakano, H., Momoyama, K., Hiraoka, M., & Inouye, K. 1996. Detec-t ion of Panaeid Rod- shaped DNA Virus (PRDV) by PCR. Fish Pathology, 31(2): 93-98.
Koesharyani, I., Supriyadi, H., Gardenia, L., Mufidah, T., &. Aryati, Y. 2009. Aplikasi dan valid asi m et od e d iag nost ik DNA vir us udang IHHNV, MBV dan WSSV secara pararel dan m ult iplek. Laporan Penelit ian APBN 2009 unpublish.
Koesharyani, I., Roza, D., Mahardika, K., Johnny, F., Zafran, & Yuasa, K. 2001. Manual for fish disease diagnosis- II (Marine fish and Crus-t acean diseases in Indonesia. Gondol Re-search Inst it ut e for Maricult ure and Japan International Cooperation Agency, 49 pp. Lightner, D.V. & Redman, R.M. 1998. Shrimp dis-eases and cur r ent d iagnost ic m et hod . Aquaculture, 164: 201- 220.
Manivannan, S., Ot t a, S.K., Karusanagar, I., & Karusanagar, I. 2002. Multiple viral infec-tion in Penaeus monodon shrimp postlarvae in an Indian hatchery. Dis. Aquat. Org., 48: 233- 236.
Mot e, E., Yugcha, E., Luzardo, J., Cast ro, F., Leclercg, G., Miranda, P., Borja, O., Serrano, J., Terreros, M., Montalvo, K., Narvaez, A., Tenorio, N., Cedeno, V., Mialhe, E., & Boulo, V. 2 0 0 3 . Pr event ion of IHHNV ver t ical transmision in the white shrimp Litopenaeus vannamei. Aquaculture, 219: 57- 70. Melena, J., Bayot, B., Betancourt, I., Amano, Y.,
Panchana, F., Alday, V., Calderon, J., Stern, S., Roch, Ph., & Bonami, J.R. 2006. Pre ex -posure t o infect ious hypoderm al and he-m at opoiet ic necrosis virus or t o inact i-vat ed whit e spot syndrom e virus (WSSV) co n f er s p r o t ect i o n ag ai n st WSSV i n Penaeus vanname (Boone) post- larve. Jour-nal of Fish Diseases, 29: 589- 600.
Natividad, K.D.L., Migo, M.V.P., Albaladejo, J.D., Magbanua, J.P.V., Nomura, N., Matsumura, M. 2006. Sim ult aneous PCR det ect ion of
t wo shrim p virus (WSSV and MBV) in post larvae of Penaeus monodon in t he Philip-pines. Aquaculture, 257: 142- 149. Novita, H., Mufidah, T., & Koesharyani, I. 2009.
Per b an d i n g an p en g g u n aan b er b ag ai preservasi RNA jaringan dengan RNAlater, alkohol dan alkohol- gliserol untuk deteksi IMNV dengan PCR. J. Ris. Akuakultur, 4(3): 377- 383.
OIE. 2006. Mannual of Diagnost ic Test f or Aquatic Animal, World Organisation for Ani-mal Health, 414 pp.
Poulos, B.T., Kibler, R., Bradley, D., Dunlop, Mohney, L.L., & Liggtener, D.V. 1999. Pro-duct ion and use of ant ibiodies for det ec-t ion of Taura syndrom e virus in penaid shrimp. Dis. Aquat. Org., 37: 99- 106. Poulos, B.T., Tang, K.F.J., Pantoja, C.R., Bonami,
J.R., & Lightner, D.V. 2006. Purification and characterization of infectious myonecrosis virus of penaeid shrimp. Journal of General Virology, 87: 987- 996.
Poulos, B.T. & Light ner, D.V. 2006. Det ect ion infect ion wit h infect ious m yonecrosis vi-rus (IMNV) of penaeid shrim p by Reverse-Transcript ase Polym erase Chain React ion (RT- PCR). Dis. Aquat. Org., 73: 69- 72. Rodriguez, J., Bayot, B., Am ano, Y., Panchana,
F., I de Blas, Alday, V., & Caledron, J. 2003. White spot syndrome virus infection in cul-t ured Penaeus vanname (Boone) in Ecua-dor wit h em phasis on hst opat hology and ult rasuct ure. Journal of Fish Diseases, 26: 439- 450.
Senapin, S., Phewsaiya, K., Briggs, M., & Flegel, T. W. 2 0 0 7 . Ou t b r eak s o f i n f ect i o u s myonecrosis virus (IMNV) in Indonesia con-firm ed by genom e sequencing and use of an alt ernat ive RT- PCR det ect ion m et hod. Aquaculture, 266: 32- 38.
Teng, P.H., Lee, P.Y., Lee, F.C., Chien, H.W., Chen, M.S., Sung, P.F., Su, C., & Ou, B.R. 2006. Detection 0h infectious hypodermal and hem atopoietic necrosis virus (IHHNV) in Litopenaeus vanname by ram ificat ion am plificat ion assay. Dis. Aquat. Org., 73: 103- 111.
Tang, K.F.J., Navarro, S.A., & Lightner, D.V. 2007a. PCR assay for discrim enit at ing bet ween infectious hypoderm al and hem atopoeitic necrosis virus (IHHNV) and virus - relat ed seq u en ces i n t h e g en om e of Penaeus monodon. Dis. Aquat. Org., 74: 165- 170. Tang, K.F.J., Pant oja, C.R., Redm an, R.M., &
situ hybridization and RT- PCR assay for the detectionof a nodavirus (PvNV) that causes muscle necrosis in Penaeus vanname. Dis. Aquat. Org., 75: 183- 190.
Tang, K.F.J., Pantoja, C.R., Poulos, B.T., Redman, R.M., & Lightner, D.V. 2005. In situ hybrid-izat ion dem onst r at es t hat Litopenaeus vanname, L stylirostris, an d Penaeus monodon are suscept ible t o ex perim ent al infect ion wit h infect ious m yonecrosis vi-rus (IMNV). Dis. Aquat. Org., 63: 261- 265.
Tang, K.F.J., Poulos, B.T., Wang, J., Redman, R.M., Shih, H.H., & Light ner, D.V. 2003. Geo-graphic variation am ong infectious hypo-derm al and hem at opoeit ic necrosis virus (IHHNV) isolates and characteristics of their infection. Dis. Aquat. Org., 53: 91- 99. Tretiakov, A. & Saluz, H.P. US Patent 6,556,940).
SpeedyCycler PCR Machine.
