Penilaian terhadap kesan sejuk beku semen ayam kampung ( Gallus Gallus) menggunakan Etilena Glikol dan Guserol sebagai Pengawetan-Krio

PENILAIANTERHADAP KESANSEJUKBEKUSEMENAYAMKAMPUNG (Gallusgallus) MENGGUNAKAN ETILENAGLIKOLDANGLISEROL SEBAGAIPENGAWETAN-KRIO. NURULNASUHABINTI MD FAUZAN. PERPUSTAKAAN SABAN MALAYSIA IINIYERSITI. DISERTASIINI DIKEMUKAKAN SEBAGAIMEMENUHISEBAHAGIAN SYARATPENGANUGERAHAN IJAZAHSARJANAMUDASAINS PERTANIANDENGANKEPUJIAN. PROGRAM PENGELUARAN TERNAKAN FAKULTIPERTANIAN LESTARI UNIVERSITIMALAYSIASABAH 2018.

PUMS 99: 1. UNIVERSITIMALAYSIA SABAH BORANGPENGESAHANTESIS JUDUI: PENILATnº4 TERIIIWºaP KESAN (GQNvS qq1k1S MEN(*uNRKw. SEM- 6Ekv FTILENR. SEmEN AYRm 1<s++t+nPuNG GLIKOL. DAN. GUSEaoL.SE6RGRi. ýENäRwrSpN-KIý-10. PCtýGý{. ugRgN UAZAH: SFIPJANA muoA CDEN4AN ý,EPW1Rti1) SRINS QEDýANiR1-1(", 36) -rimr4Akrlr4 SAYA: Nu"I--. NASONn. 8lN11 OW ýAuzAN. SESIPENGAJIAN:. 101y. -1-0I4. (HURUF BESAR) Mengaku membenarkan tesis `(LPSM/Sarjana/Doktor Falsafah) ini disimpan di Perpustakaan Universiti Malaysia Sabahdengan syarat-syarat kegunaan seperti berikut: 1. Tesis adalah hak milik Universiti Malaysia Sabah. 2. Perpustakaan Universiti Malaysia Sabah dibenarkan membuat salinan untuk tujuan pengajian sahaja. 3. Perpustakaan dibenarkan membuat salinan tesis ini sebagai bahan pertukaran antara institusi pengajian tinggi. 4. Sila tandakan (/). 0. i. SULZT. (Mengandungi makiumat yang berdarjah keselamatan atau kepentingan Malaysia seperti yang termaktub di AKTA RAHSIARASMI 1972). TERHAD. (Mengandungi makiumat TERHADyang telah ditentukan oleh organisasi/badan di mana penyelidikan dijalankan). TIDAK TERHAD Dj4%n. oleW. i. NIYRULAINBINTI ISMAIL PUSTAKAWANKANAN (TANDATANGANPENULIS) AlamatTetap: POS 63 , Ir-4 SIkP-ºNNG ßupy(i , 836Qy SEMýCtqy BF3TV QA11Rr , jOItoR. TARIKH:. 18. ' ""®. l0. A14 (TdM'fMTdWAVAY%WäA. (I. SITi MAYAN SIDIK PENSYARAH PERTANIAN LESTARI FAKl1LTI UNPi61MVAW% SABAH TARIKH: -*4-. Catatan: "Potong yang tidak berkenaan. "Jika tesis ini SUUTdan TERHAD,sila lampirkan surat daripada pihak berkuasa/organisasi berkenaan dengan menyatakan sekali sebab dan tempoh tesis ini perlu dikelaskan sebagai SULITdan TERHAD. "Tesis dimaksudkan sebagai tesis bagi Ijazah Doktor Falsafah dan Sarjana Secara Penyelidikan atau disertal bagi pengajian secara kerja kursus dan Laporan Projek SarJ'anaMuda (LPSM)..

PENGAKUAN. Saya akui karya ini adalah hasil kerja saya sendiri kecualinukilan dan ringkasanyang tiap-tiap satunyatelah sayajelaskansumbernya.Sayajuga mengakuibahawadisertasi ini tidak pernah atau sedang dihantar untuk perolehi ijazah dari universiti ini atau manauniversitiyang lain.. NURULNASUHABINTI MD FAUZAN BR14110066 29 NOVEMBER2017. 11.

DIPERAKUKAN OLEH 1.. sný. SITZAISYAH SIDIK PENSYARAH. Cik Siti Aisyahbinti Sidik PENYELIA. SASAH UNIVERSRI MALAYSIA 2.. Prof. Dr. Abdul Rashidbin Baba PENYELIA BERSAMA. III.

PENGHARGAAN. Setinggi puji dan syukur saya hamparkan ke hadrat ilahi kerana limpah kurnia dan keizinanNya,makadapatlahsaya menyiapkantugasanprojek akhir tahun ini mengikut tempoh yang ditetapkan.Dalamusahaini sayabenyakterhutang budi kepadapelbagai pihak. Pertamasekali, setinggi-tinggi ucapanterima kasih yang tidak terhingga saya tujukan kepada penyeliasaya, Cik Siti Aisyah binti Sidik dan penolong penyelia saya iaitu Prof. Dr. Abdul Rashid bin Baba yang memberi peluang kepada saya untuk pengalamanberharga dan pengetahuandalam menjalankanprojek tahun akhir saya. Saya amat berterima kasih kepada penyelia dan penyelia bersama saya kerana kesabaranmereka memberi bimbingan, pengetahuanyang meluas, pengawasandan galakandi keseluruhanmenyiapkanprojek tahun akhir. Selain itu saya ingin ingin berterima kasih kepada kedua ibu bapa saya Md Fauzanbin Mohd Yusofdan Aminahbinti Kassimyang banyakmemberidorongandan nasihat kepadasaya untuk menyiapkanpojek ini. Sayajuga ingin mengambilpeluang ini mengucapkan terima kasih kepada staf-staf Fakulti Pertanian Lestari kerana menyediakanperalatandi makmal, menyadiakanbahan-bahankimia yang diperlukan dalamkajian ini. Seterusnya,saya ingin mengambilkesempatanini untuk mengucapkanterima kasih kepadarakan-rakanseperjuangansaya iaitu Sebastianabin, Mohd Faizbin Abdul Rauf, EvelynKoay Shin Rou, Norhaseenabinti Mohd Salleh,Nursyafikahbinti Othman clanjuga rakan-rakanyang lain keranaturut membantusaya dalamkajian ini. Akhir sekali, saya berterima kasih kepada semua pihak yang terlibat secara langsung clan tidak langsung dalam penyediaan projek ini yang telah memberi kerjasamayang amat. SemogaAllah membalassegalajasa yang telah diberikan.. iv.

ABSTRAK. Objektif kajian ini adalah untuk menilai kesan sejuk beku terhadap semen ayam Kampung(Gallusgallus) dengan mengunakankepekatanberlainan bagi Etilenaglikol dan Gliserol sebagai Pengawetan-krio.Kajian ini telah dijalankan di rumah ayam separuh intensif,Fakulti Pertanian Lestari (FPL, Universiti Malaysia Sabah untuk pengumpulan semen dan makmal Anatomi Fakulti Pertanian Lestari(FPL) untuk penilaian semen. Tempoh kajian ini adalah dari Oktober sehingga November 2017. Dalam kajian ini empat ekor ayam kampung telah dipilih, secara rawak di mana air mani segar tersebut telah dikumpulkandalam tiub appendorf. Kajian ini telah diulang sebanyakempat kali replikatsi dengan mengunakanreka bentuk rawak lengkap. Air mani segar telah dikumpulkandan dinilai berdasarkanbeberapaciri-ciri iaitu isipadu semen, kepekatan,warna dan kosistensi,motility (MMOT)dan molititi individu. Dalam kajian ini purata jumlah air mani yang dikumpulkanialah 0.22±0.02 ml denganwarna kosistensiyang dicatatkanialah 2.25±0.50 dan purata kepekatanialah 1.08±0.02x109 sperma/ml, bagi purata MMOT pula ialah 4.75±0.50, pergerakan individu ialah 94.75±3.40. Setelah penilaian semen segar dilakukan, 350p1 semen dilarutkan ke dalam 5 ml campuran Ringersdan rawatan yang berlainan kepekataniaitu 5%, 8% dan 10% bagi Etilenaglikol (ETG)dan Gliserol(G). Kemudian300N1campurantersebut (semen+rawatan) diletakkan kedalam 1.5m1 tiub micro. Seterusnya tiub mirco diletakkankedalambekasyang direka khasyang berisi alkohol methanol95%. Setelah itu penilaian semen untuk had 0 dilakukan, suhu dicatatkan kemudian bekas diletakkan kedalam peti sejuk beku pada suhu 2°C dan suhu dicatatkan setiap setengahjam daripada23°C hingga 5°C. Penilaiansperma seturusnyadilakukanpada had ketiga dan keenam penyimpanansejuk beku. Keputusan daripada hasil kajian mendapatiterdapat perbezaansignifikanbagi daya maju sperma pada had ke 3 (10% G) dan ke 6 (5% ETG,8% ETGdan 10% ETG)bagi had 0, pada had ke 3 dan ke 6 terdapat penurunan tren. Seterunyauntuk kadar hidup sperma terdapat perbezaan signifikan bagi kesemuarawatan (p<0.05). Padahad ke enam rawatan 5% G adalah rawatanyang mempunyaipurata yang tinggi (29.69±2.33). dan 10% G menunjukkan purata terendah (19.81±1.11). Terdapat penurunan tren bagi kadar hidup sperma merentasihad ke-6. Kemudiankadar mati Spermayang tertinggi bagi had ke-6 ialah 10%G (80.19±1.11) dan purata min terendah ialah 5% G (70.31±2.33). terdapat perbezaan ketara bagi kesemua rawatan (p<0.05) dan tren purata min adalah meningkat.Akhir sekali ialah abnormalitisperma, trem bagi purata abnormality ialah meningkat merentasihad ke-6. Terdapat pebezaanketara bagi rawatan ETGdan G. Purata min tertinggi ialah 10%G (97.15±6.40) dan yang terendah ialah 8% ETG (32.89±5.23b).Kesimpulannyarawatan 5% dan 8% ETGadalahrawatan yang sesuai untuk kaedahsejuk beku. pengawetan-krio.. V.

ASSESSMENT OF THE EFFECT OF FREEZING FOR KAMPUNG CHICKEN SEMEN USING ETHYLENE GL YCOLAND GLYCEROL AS CRYOPRESERVATION. ABSTRACT The objective of this study was to evaluate the effect of freezing on Kampung chicken (Gallus gallus) cement by using different concentration of Ethylene glycol and Glycerol as cryopreservation. The study was conducted in semi-intensive chicken house, Faculty of Sustainable Agriculture (FPL), Universiti Malaysia Sabah for semen collection and laboratory of Anatomy of the Faculty of Sustainable Agriculture (FPL) for semen assessment. The study was conducted from October until November 2017. In this study, semen was collected from four kampung chicken in the microcentrifuge tube. There were four replicates using a Complete Randomized Design (CRD). In this study, the average amount of semen collected was 0.22 ± 0.02 ml with the colour of the consistency recorded at 2.25 ± 0.50 and the mean concentration was 1.08 ± 0.02 x 109 sperm / ml, for MMOT average is 4.75 ± 0.50, individual movement is 94.75 ± 3.40 after evaluation. Fresh cement is made, 350p1of cement is dissolved into 5 ml of Ringers mixture and different treatments of 5%, 8% and 10% of Ethylene glycol (ETG) and Glycerol (G). Then 300pI of the mixture (cement + treatment) was placed into 1.5m1of micro tube. Next the mirco tube is placed into a specially designed container containing 95% methanol alcohol. The sperm test results were recorded on the third and sixth days of frozen storage. Results showed that there was a significant difference in the viability of sperm on day 3 (10% G) and to 6 (5% ETG, 8% ETG and 10% ETG) for day 0, on day 3 and 6. The survivor for sperm survival rate was significantly different for all treatments (p <0.05). On the sixth day of treatment 5% G was the treatment with a high average (29.69 ± 2.33). and 10% G showed the lowest average (19.81 ± 1.11). There was a decrease in trend for sperm survival rate across day 6. The highest sperm-dead rate for the 6th day was 10% G (80.19 ± 1.11) and the lowest average mean was 5% G (70.31 ± 2.33). there was a significant difference in all treatments (p <0.05) and mean average trends were increased. Finally, sperm abnormality, the trend for average abnormality is increase across day 6. There was a significant difference in the treatment of ETG and G. The highest average mean was 10% G (97.15 ± 6.40) and the lowest was 8% ETG (32.89 ± 5.23). In conclusion, 5% and 8% ETG treatments suggested as the best treatments for frozen methods.. VI.

ISI KANDUNGAN Muka surat ii iii. Kandungan Pengakuan Perakuan Penghargaan Abstrak Abstract Isi Kandungan SenaraiJadual SenaraiRajah SenaraiSimbol,Unit dan Singkatan SenaraiFormula. IV V VI VII. IX X. XI XII. 1 1 2 3 3. BAB1 PENGENALAN 1.1 Bab Pengenalan 1.2Justifikasi 1.3 Objektif 1.4 Hipotesis. BAB 2 ULASANKEPUSTAKAAN 2.1 Pengawetan-krio 2.2 KepentinganPengawetan-krio 2.3 Teknik-teknikPengawetan-krio 2.4 ]enis-jenis Perlindungan-krio 2.4.1 Gliserol 2.4.1.1 KesanSel dan Molekulbagi Gliserol 2.4.2 EtilenaGlikol 2.5 AplikasiPengawetan-krio 2.5.1 Ocositdan Embrio 2.5.2 Semen,Spermadan TisuTestikular 2.5.3 Sel Stem 2.6 PengenalanInduk AyamTempatan 2.7 Anatomidan Fisiologibagi Pembiakanbagi Ayam Kampung. 4 4 6 6 7 8 8 9 9 9 9 10 10 12. BAB 3 KAEDAH KA)IAN 3.1 Lokasi Kajian. 13 13 13 14 14 14 15 15 16 17 17 18 18. 3.2 Ayam KampungJantandan PengurusanAyam 3.3 PengumpulanSemenAyam KampungJantan 3.4 PenyediaanLarutan 3.4.1 PenyediaanLarutanRingers 3.4.2 LarutanEtilenaglikol dan juga Gliserol 3.4.3 Penyediaanlarutan Eosin-Nigrosin 3.5 PenyediaanSampel 3.6 PenilaianSemenAyam 3.6.1 Warna Spermadan Konsistensi 3.6.2 KadarIsipaduSperma 3.6.3 KadarPergerakanJisim Motilili SemenSegar(MMOT) VII.

3.6.4 KadarKepekatanSperma 3.6.5 KadarHidupdan Mati Sperma 3.6.5.1 MorfologiSperma 3.7 RekabentukEksperiman 3.8 AnalisisStatistik. 19 19 20 21 21. BAB 4 KEPUTUSAN. 22 22 23 23 24 25 26. 4.1 KualitiSemenSegardan Ciri-cirinya 4.2 KualitiSemenbagi RawatanKawalanpadaSuhu Bilik 4.3 DayaMaju Sperma 4.4 KadarHidup Sperma 4.5 KadarMati Sperma 4.6 KadarAbnormalitiSperma BAB 5 PERBINCANGAN 5.1 Kualiti Semen Segar 5.2 Daya Maju Sperma. 5.3 SpermaHidup dan Mati 5.4 KadarAbnormalitiSperma. 28 28 29 32 33. BAB 6 KESIMPULAN. 35. RUJUKAN LAMPIRAN. 36 40. viii.

SENARAI7ADUAL Jadual 3.1. Muka surat. 3.2. Formularingers Campuranlarutanetilena glikol dan gliserolbersamaringers. 15. 3.3. berdasarkanformula PersediaanEosin-Nigrosin. 15. 3.4. Julat wama spermadan kosistensi. 17. 3.5. Indeks motiliti bagisemenayam (MMOT). 18. 3.6. Rekabentukeksperimenrawatandan kawalan Min isipadu (ml), jisim motility (MMOT),kepekatansperma. 21. 4.1. 14. 24. (ml), dan warna semensegarayam kampung 4.2. Peratusanpurata daya maju, hidup, mati dan abnormaliti. 23. 4.3. sperma(%) bagi rawatankawalanpadasuhu bilik Peratusanpurata bagi pergerakandaya maju semen untuk. 24. kepekatan yang berbeza bagi Etilena glikol dan Gliserol 4.4. pada hari 0,3 dan 6 padasuhu -14.5°C Peratusanpurata bagi kadar hidup spermauntuk kepekatan. 25. yang berbezabagi Etilenaglikol (ETG)dan Gliserol(G) pada hari 0,3 dan 6 padasuhu -14.5°C 4.5. 4.6. Peratusanpurata bagi kadar mati sperma untuk kepekatan yang berbeza bagi Etilena glikol (ETG) dan Gliserol (G) untuk had 0,3 dan 6 padasuhu -14.5°C Peratusan perata bagi kadar abnormaliti sperma untuk kepekatan yang berbeza bagi Ethylene Glycol (ETG) dan Glycerol(G) untuk hari 0,3 dan 6 padasuhu -14.5°C. ix. 26. 27.

SENARAI RAJAH Rajah. Muka surat. 2.1. Pembiakaanbagi Ayam jantan. Sumber daripada Jacob et al., 2011. 12. 3.1. Tempatpenyimpananyang direka untuk pemuliharaan. 17. 3.2. ContohHemasitometeryang digunakanuntuk kepekatan sperma. 19. 3.3. Perbezaanantara sperma(a) mati dan (b) hidup. 20. 3.4. Ciri-ciri abnormaliti sperma pada x400 magnifikasi merentasi hari ke 6 (a) ekor bergulung, (b) kepala bengkok,(c) kepalabergulung,(d) leher bengkok. 20. X.

SENARAI SIMBOL, UNIT DAN SINGKATAN % oC. ANOVA CRD FPL. 9 mL ETG G ml SE MMOT DMSO Nacl pH. CaCI22H2O C6H1206. NaHCO3. Peratusan Darjah Selsius Jumlah Analisisvarians Rekabentuk RawakLengkap FakultiPertanianLestari Gram Mikroliter Etilenaglikol Gliserol Milliter Ralatpiawai KadarPergerakanJisim Motilili SemenSegar Dimetilsukfosida SodiumKlorida Potentialof hydogen Kalsiumkiorida dehydrate Glukosa Natrium bikarbonat. XI.

SENARAI FORMULA Formula 3.1. Muka surat Kepekatanspermaper isipadu(ml) = purata nilai sel x faktor larutan x 104. xi i. 19.

BAB 1 PENDAHULUAN. 1.1. Bab Pengenalan. Malaysiamerupakansalah satu negara yang mempunyaibaka ayam kampung (Red Jungle Fowý. Ayam kampung kebiasaannyaditemui di negara Selatan Asia seperti Thailand, Malaysia,Myanmar, Singapura, India Utara, Pakistandan lain-lain. Ayam kampungini selalunyadipeliharadi kampung-kampungdan dibiarkanlepasdi kawasan kebun dan sebagainya.Populasiayam kampung telah mendapatperhatian oleh IUCN (International Union for Conservationof Nature) di mana populasiayam kampung ini semakinmenurundi dalamhabitat asli mereka(BirdlifeInternational, 2012). Penurunan populasiayam kampungini disebabkanoleh beberapafaktor seperti kawasanhabitat yang terancam, pengumpulanataupun pengutipan telur ayam yang tidak terkawal, pemangsaandan penghibridangenetik denganayam tempatan (Subhaniet al., 2010). Pengawetan-kriosperma dalam bidang ternakan terutamanya dalam burung tempatanseperti ayam, puyuhdan banyaklagi telah lama diperkenalkansejak awal 50 tahun yang lalu (Blesbios et al., 2007).Penggunaankaedah pengawetan-kriosperma adalahsalahsatu kaedahyang digunakanuntuk memanjangkanhayat sperma.Kaedah ini juga dapat memperkembangkanlagi teknik pembiakaan,seperti permanianberadas (AI) dan juga pensenyawaansecarain-vitro (Medeirosetal., 2002) dengansemensejuk beku adalahpentingdalampembiakaandan pilihanbaka bertujuanuntuk meningkatkan lagi pengeluaranspesisbaka yang bermutu secaradomestik. Prosespenyejuk bekuan semen ini beselarasandenganteknologi pembiakbakaanyang dapat memeliharaspesis yang terancamataupun untuk menyelesaikanmasalahkesuburanbagi lelaki (Andrabi dan Maxwell,2007)..

Sel spermamerupakanspermayang sensitifterhadap perubahansekeiiiing,dan mempunyaijangka hayat yang singkat. Selspermaberbentukhaploiddan hampirtidak mempunyaisitopiasma,ianyadibentukoieh nukleusbesardan padatdengankromosom, nukleusini membolehkanianyaberhubungdenganoosit semasapensenyawaanberiaku. Sel spermamempunyaiaktiviti biosintetikyang sedikit dan ia sangat bergantungpada fungsi katabolikuntuk mengekalkankehidupannya(Barbasdan Mascarenhas,2009). Kaedahpenggunaanperlindungan-krioseperti gliserol, dimetil acemide,etilena glikol dikenalisebagaibahanperlindungan-kriobagi spermatozoa,namunia mempunyai had yang tersendiri (Hammerstedtdan Grahman,1992). Kajian mendapatipenurunan dalam daya maju spermatozoa unggas hutan India menggunakanprosedur rutin berdasarkangliserol sebagaiperlindungan-krio(Rakhaet al., 2016). Etilenaglikol juga digunakansebagaiperlndungan-kriobagisperma(Gilmoreet al., 2000). Oleh itu kajian ini adalah bertujuan untuk melihat keberkesananataupun perbezaanpengawetan-krio bagi gliserol dan juga etilena glikol dengan kepekatan yang berbeza apabila menggunakanalcohol methanol 95% sebagai simpanansejuk beku secara perlahan selama6 hari. 1.2. ]ustifikasi. Melaluikajian ini dapat di justifikasikanbahawapenggunaanperbezaankepekatanbagi perlindungan-krio (cryoprotectantj dapat dilihat sebagai salah satu cara untuk memelihara sperma untuk kegunaan dan penyimpanan dalam jangka masa yang panjangdan dapatmemeliharafizikalsperma,hal ini keranaspermamerupakansel yang sensitif terhadapt berubahanpersekitaran.Ia juga boleh digunakanuntuk melindungi baka-bakatertentuyang kian pupusterutama sekalihidupanliar. Selainitu pengawetankrio ini dapat meningkatkantahap pengeiuaranbaka domestikseperti bidang ruminan dan bukanruminan, bidangternakantenusu, dan juga bidangternakanayam kampung dan sebagainya.Hal ini keranapengawetan-kriomerupakansalah satu kaedah untuk meneruskan aktiviti permanian berradas yang kian membangun dalam sektor pentemakan.. 2.

Tambahanpula, kajian ini dapat dijustifikasikan bahawa penggunaanalkohol sebagaigantian untuk penggunaancecair nitrogen. Penggunaanalkohol adalah lebih mudah dan dapat menjimatkankos perbelanjaandi mana, kos bagi cacair nitrogen adalah mahal dan memerlukanpenelitian apabila mengendalikannya.Hal ini kerana cecairnitrogen mudahtersejat kepadapersekitaransekiranyatidak dikendalikandengan baik. Selain itu penggunaanalkohol dapat memudahkanpenyimpananbagi ahli-ahli saintisapabilamelakukanaktiviti diluar makmal. 1.3. Objektif. Untuk menilaikesansejuk bekuterhadap semenayam kampung(Gallusgallus)dengan mengunakankepekatanberlainanbagi Etilenaglikol dan Gliserolsebagaipengawetankrio. 1.4. Hipotesis. Ho:Tiada perbezaansignifikan bagi bahan kimia perlindungan-krioEtilena glikol dan Gliserolterhadap daya maju spermaberbandingdengantiada perlindungan-krio. Hn:Terdapatperbezaansignifikanbagi bahan kimia perlindungan-krioEtilenaglikol dan Gliseroltehadapdaya maju spermaberbandingdengantiada perlindungan-krio.. 3.

BAB 2 ULASAN KEPUSTAKAAN. 2.1. Pengawetan-krio. Pada awal 1600an kaedah pengawetan-krio masih lagi ketinggalan sehinggalah terdapatnya perkembanganpermanian beradas (Artificial Insemination) pada awal 1960an,apabilaIndustri lembutenusumemerlukankaedahpenyimpananuntuk sperma pejantan, dan setelah itu pengawetan-kriosperma menjadi popular di dalam kajian saintis. Polge et al. (1949) menemukankegunaangliserol sebagai perlindungan-krio (cryoprotectantjyang boleh melindungisel terutama sekalisel spermapadasuhu yang rendah. Perkembanganprotokol pengawetan-kriountuk lembu pejantan adalah untuk tujuan permanianberhadas,bagi memperkenalkan percubaanuntuk pembekuanSperma jantan sehingga suhu -79°C dan di simpan di dalam ais kering. Kajian mendapati percubaanitu masih lagi dapat mengekalkantahap kesuburansperma (Bratton et al., 1955). Dalam pembangunanteknologi yang semakin pesat kini, bidang pembiakan haiwantemakanjuga tidak ketinggalan.Ia bertujuan untuk meningkatkanpengeluaran hasilternakan di negara Malaysia. Penggunaanteknologi seperti pemuliharaansemen ini telah lama dipraktikkan clan pelbagai cara telah dijalankan untuk meningkatkan keberkesanannya..

Namunbegitu kajian sebelumini menyatakanterdapat ketidakseragaman yang signifikan dalam hasil penyelidikansebelumnyamengenaiprotokol perlindungan-krio (cryoprotectantj yang optimum dan protokol pengawetan-krioitu sendiri, di sini ia menjelaskanterdapat beberapafaktor yang membawakepadaketidaksuaianini, seperti baka temakanyang digunakan,komposisiyang berbezadari pencairsemen(diluents), kepekatanagen perlindungan-krio,kaedah penyejukbekuanataupun penyahbekudan kadar penyejukkan(Abouelezzet at., 2015). Kaedahpembungkusansperma di dalam straw, dan bilangansel spermayang digunakanuntuk pembiakan(Blesboisetal., 2006). Pengawetan-krioini telah digunakandidalampelbagaispesishaiwantermasuklah kambing(Sanchez-Partidaet al., 1992), lembu (Goffaux, 1991), unggas (Rakhaet al., 2016), dan banyak lagi. Pengawetan-kriosperma digabungkan dengan permanian beradasyang telah diktiraf keranamempunyainilai yang tinggi dalam pemuliharaanexsitu bagi spesis terancam (Blanco et al., 2000). Keberkesananteknik ini adalah berdasarkankualiti prosessejukbekuclanjuga prosespenyahbekuyang betul. Teknik pengawetan-kriodan juga protokol pensenyawaanin-vitro adalah penting di dalam kajian genetikdan juga penghasilanhaiwantransgenik. Keberhasilanpengawetan-kriobagi sperma spesies unggas ini tidak begitu berjayaseperti mamaliayang lain, hal ini disebabkanbeberapafaktor khususnyabentuk fizikal pembiakaan,kepelbagaianspesisdan baka yang membawakepadatidak balas spermayang berbezaapabiladibekukan(Blesboiset al., 2006). Terdapat kajian yang menyatakankebolehansesuatuspermadanjuga tindak balasnyadalampengekalsemen terhadap suhu rendah,semasanyah beku, sejuk beku, fasa ini adalahberbezadengan antara spesisdenganspesisyang lain (Han et al, 2005). Kadar sejuk beku dan penyahbeku boleh mempengaruhi kemandirian-krio (cryosuivivaý sperma, penggunaankadar penyejukan yang optimum adalah untuk mengurangkankecederaan-krio(cryo-injuries)spermaiaitu gangguanmembranplasma sperma dan struktur DNA,yang disebabkanoleh pembentukanais intrasel yang luas sertaperubahandalampH intraseldan komposisiion (Mazur etal., 1970).Kebiasaannya semendicairkandi dalampengekalyang mengandungiperlindungan-krioyangberfungsi untuk mengurangkanpenghabluranintraselular.. 5.

2.2. Kepentingan Pengawetan-krio. Pengawetan-kriomerupakan salah satu cara untuk memulihara germplasmayang digunakan di dalam pertanian,perikanan,bioteknologi,dan pemuliharaanbagi spesis terancam. Di dalam pertanianpengawetangermplasmaini adalahuntuk meningkatkan genetik bagi spesis haiwan domestik, untuk memeliharabaka yang jarang ditemui, meningkatkanketahananterhadapperubahanpersekitarandan pertukarangermplasma di peringkatantarabangsabertujuanuntuk memuliharabaka. Selainitu, pengawetan-krioini juga penting bagispesisyang terancam,program pengurusangenetik dan juga boleh dilakukanuntuk sumber simpanangenetik untuk kegunaanmasa akan datang. IN telah dinyatakanapabila kajian mendapati bahawa semen kambing biri-biri jantan yang disejuk bekukanboleh bertahanselama27 tahun tanpa memberi kesan kepada kesuburan sperma, sumber genetik dapat dipelihara (Salamondan Maxwell,2000). Kaedahpengawetan-krioini bolehdilakukanuntuk memeliharahaiwanterancam dan juga bakayang terancam.Untuk memaksimumkankepelbagaiangenetik dan juga untuk haiwan yang jarang diemui daripada keluarga Bovideadi mana 1000 sperma dikumpulkandaripada25 jantan yang berlainan(Camizzolietal., 2000) 2.3. Teknik-teknik Pengawetan-krio. Pengawetan-krio adalah teknik yang menggunakan suhu yang rendah untuk memeliharasel-seldan tisu untuk jangka masayang panjang. IN berdasarkankepada jenis sel ataupunsel bagisesuatuspesismamalia,di manaterdapatnyaperbagairespon biologi-krio dan juga kemandirian-krioapabila disejuk bekukan dan kemudiannyadi nyahbeku. Pengawetan-krioini boleh dikelaskanmengikut jenis pengawetan-krioitu sendiri, ianya termasukiah penyejuk bekuan perlahan dan vitrifikasi yang melibatkan pemejalan daripada persekitaranair atau tisu kepada fasa non-kristal (noncrystalline gaissy phase), proses penyimpanantanpa had (subzero non-freezingstorage) dan pemeliharaandaiam keadaankering (drystate).. 6.

Kaedahpengawetan-krioboleh dilakukandenganmengabungkankerlindungankrio dengan sel ataupun tisu sebelumdisejukkan,kemudiansel disejukkanpada suhu yang rendah dan ditetapkan, seterusnyaialah proses nyah bekuan tisu ataupun sel. Terakhir sekali penyingkiranperlindungan-kriosetelah nyahbekuandilakukan (Gao et a/., 2016). Di dalam sejukbekudan nyahbekuanselain pembekuan,fasa pemanasanjuga penting untuk kemandiriansperma(Fisher eta/., 1987). Semasapenyahbekuan,semen beku akan melalui tahap suhu kritikal iaitu antara -15 dan -60°C. Kadar pancairan bergantung kepada kadar penyejukkan sama ada tinggi yang mendorong kepada pembentukanintraselataupun rendahyang menghasilkandihidrasisel. Spermamerupakansel yang sensitif-kriopada suhu 37°C ke bawah yang boleh membawakepadakecederaan-krio(kryoinjury). Kecederaankrio ini adalahdisebabkan oleh kerosakansel apabila melaluifasa perubahanair pada persekitaranekstraseldan intraselpadasuhuyang rendah.Penyejukandan nyahbekuspermabolehmempengaruhi fizikal kimia dan tindakbalasbiofizikal sperma itu, yang boleh memberi kesan kepada kelangsunganhidup sperma(Gao etal., 2016). Mekanismakecederaan-kriomelibatkan pecahanosmotik yang disebabkanoleh kepekatanlarutanintraselataupun luar sel, dan pembentukanais di dalam intersel (McGannet al., 1988). Selain itu, had daya maju spermajuga ditentukan dari segi ketahananmembranplasmayang berfungsi sebagai sifat separatelap. 2.4. ]enis-jenis Perlindungan-krio. Kebiasaannyaperlindungan-krio adalah berbentuk cecair yang berperanan untuk mengurangkankerosakan sperma semasa proses penyejukbekuanyang merupakan salahsatu prosesdi dalamkaedahpengawetan-krio.Perlindungan-krioharuslahmudah menembusisel spermadan kurangkepekatantoksik, bagi mengelakkandari perubahan fizikal sperma. Kepekatan perlindungan-kriopenting yang optimum penting bagi mendapatkanspermayang tahan lasakdan ianyabergantungkepadajenis sel danjuga tisu. Perlindungan-krioboleh dibahagikankepada dua ketogori iaitu perlindungan-krio sel teiap membran(cellmembranepermeatingcryoprotectants)sepertidimetil sukfosida (DMSO),gliserol,etiienaglikol dan lain. Keduaialah perlindungan-kriosel membrantidak. 7.

telap seperti 2-metil-2,4-pentanedioldan polimer seperti polivinil pinolidon, kanji hidroksietil,dan pelbagaigula. 2.4.1 Gliserol Gliseroldigunakan sebagai perlindungan-krioterhadap sperma unggas untuk kaedah pengawetan-krio.Penyingkirangliserol secara perlahanpenting untuk mengurangkan kesan kerosakansperma yang mungkin berkaitan dengan ketidakseimbanganproses osmotik yang merentasisel membran. Ketidakseimbangan prosesosmosisdisebabkan oleh penyahbeku gliserol dengan media yang tidak mengunakan dlysrol sebelum permanianberadas dilakukan (Hammerstedtdan Graham 1992). Polge et at. (1949) menjumpaikesanperiindungan-kriobagi gliserol. Sebatianini merupakansebatianyang paling berkesandari segi aditif sehinggakesanperlindunganDMSO(Dimethy/su/foxide) ditemukan oleh Lovelockdan Bishop(1959). Gliserolyang tidak mempunyaielektrolit, bertindak mengurangkankepekataneletrolit dalam larutan sisa yang tidak beku pada intersel dan disekitar luar sel pada sebahagiansuhu tertentu. Gliserol ini digunakan secarameluasdalam prosespenyimpananbakteriadan juga spermahaiwan. 2.4.1.1. Kesan Sel dan Molekul bag! Gliserol. Kajian mendapatiterdapat kerosakanpada sperma ayam jantan sebelum pemanian beradas dilakukan yang berpunca daripada ketidakseimbanganosmotik merentasi membranspermasetelahdilarutkanke dalamgliserolbebasiaitu tanpa larutan pengekal semen. Sel menjadi kecut dan fizikal sperma berubah. Penggunaangliserol selalunya digunakan pada kadar kepekatan 6 hingga 8%. Kepekatanyang berlebihan akan menyebabkankerosakansel spermadan ini akan merendahkantahap ketahananhidup sewaktu proses nyahbekuan. Kajian mendapati 4-6% kepekatan gliserol adalah kepekatanyang sesuaidan sejuk beku pada 10-100°C/minit(Byrne etal., 2000; Anel et al., 2003).. 8.

2.4.2 Etilena Glikol Etilenaglikol merupakansebatianorganik denganformula (CH2OH)2. Kegunaanetilena glikol adalahbahan mentah untuk fiber poliester dan juga bahan utama untuk formula anti pembekuan.Ia bersifat tidak berbau,tidak berwarna,dan merupakancecair likat. ApabilaEtilenaglikol dilarutkandi dalamair ia akanmenggangguikatan hidrogen.Cecair ini akan beku pada suhu -12°C, tetapi apabiladicampurkandengan air, campuran ini tidak mudah bertukar kepada kristal. Oleh itu pembekuan tidak mudah beriaku. Khususnyabagi campuran60% etilena glikol dan juga 40% air membekupada -45°C. Keupayaanantibekuanetilena glikol telah menjadikannyasebagaikomponencampuran vitrifikasi untuk pemeliharaanbiologi sesuatutisu dan organ pada suhu yang rendah (Rebsdatdan Meyer,1980). 2.5. Aplikasi Pengawetan-krio. 2.5.1 Oosit dan Embrio Teknik pengawetan-krio bagi oosit matang terbukti dapat mengekalkan kapasiti pembiakan.Hasildaripadakajian tentang retrospektifmengenai11,768embrio manusia yang dikekalkanuntuk menjalanisatu kitaran penyahbekudari tahun 1986 hingga2007 menunjukkanbahawatiada kesanyang signifikanterhadap tempoh tersebut terhadap penyimpanan,kehamilan,keguguran,implantasiataupun kadar kelahiranhidup sama ada mengunakanpensenyawaanin-vitro ataupun kitaran sumbanganoosit (Riggs et a/., 2010). 9.

2.5.2 Semen, Sperma dan Tisu Testis Pengawetan-kriodapat diaplikasikandi dalam pengawetan-kriosperma bagi pelbagai jenis spesis.Kajianterhadap pemuliharaanspermaayam belandauntuk melihat kesan pembiakbakaan,sejuk beku dan penyahbekuterhadap kualiti semen, pensenyawaan dan juga penetasantelur. Kajianini menggunakangliseroldan DMA(dimetilacetamide) sebagai perlindungan-kriodan mendapati sperma ayam belanda yang dibekukan menggunakangliserol mempamerkanintegriti membranyang lebih tinggi berbanding kualiti membran apabila dicairkan daripada sperma ayam belanda yang dibekukan denganDMA.Walaupuntiada perbezaanmotiliti, dan hanyaterdapat perbezaanminima dalamgerakanprogresif,dikesandi dalam rawatanpemuliharaanini. 2.5.3 SeI Stem Sel stem dewasadapat dibezakandenganpelbagaijenis sel tertentu dan boleh di dapati daripada pelbagaijenis lokasi seperti tulang sumsum,tisu lemak, poriosteum,cecair amnion dan darah daripada tali pusat (Miyagi-Shiohiraet a/., 2015). Bidang tisu kejuruteraan,terapi gen, ubat regeneratif,dan transplantasisel sebahagianbesamya bergantung kepada keupayaanuntuk memelihara,menyimpan dan mengangkut sel stem ini tanpa pengubahsuaiankandungangenetikatau sel (Jang et al., 2016) 2.6. Pengenalan Induk Ayam Tempatan. Bakaayam tempatan iaitu ayam kampungmerah (Gallusgallus) adalahterdiri daripada keluarga Phasianidea.Ia dianggapsebagaibaka terawal bagi ayam domestik(Gautier, 2002). Ayam kampungmerah ini mempunyaibeberapajenis spesisiaitu G. g. bank/va, G. g. jaboullli, G. g. spadiceus,G. g. gallus and Gallusgallus murghi di mana ianya terbahagimengikutasalusulyang tertumpu kepadanegarabarat dayasepertiMyanmar, Thailand, SemenanjungMalaysia,Singapura,SumateraUtara, Himalayautara- barat, utara India clanjuga Pakistan(BirdlifeInternational, 2012) Indian RedJungle fowl (G. gallus) merupakanbaka yang berasaldaripadaAsia Selatantetapi populasiterhad di kawasanIndia Utara dan Azad Jammu dan Kashmir, Pakistan(Subhaniet al., 2010). Populasiburung unggas merah India di dapati tidak seragamdan berpecahdalamkawasanIingkunganperedarannya.Olehitu menyebabkan 10.

pengurangan genetik sentiasa menurun (Peterson dan Brisbin, 1998). Terdapat beberapa laporan menunjukkan penurunan populasi burung unggas merah India disebabkanoleh penglupusantempat tinggal ataupun habitat oleh manusia untuk pembangunanseperti perumahan,kilang dan bnyak lagi, aktiviti pengumpulantelur yang tidak terkawal, percampurangenetik dengan ayam domestik yang lain turut menyumbangkepada penurunanpopulasigenetik ayam kampung merah (Subhani et al., 2010). Ayam kampungmerahsering dipeliharadi kawasanperkampunganataupun hutan. Pembiakaanuntuk ayam kampung domestik kini merupakanmekanismayang agak rumit dengan pelbagai persekitarandan faktor fizikal untuk berinteraksi dan menyumbangkepadakeberhasilandalampensenyawaan(Malik eta/., 2013). Secara amnya ayam kampung ini mempunyai bentuk fizikal yang kecil, mempunyaibuluyang pelbagaiwarna. Saiztelur bagiayam kampungtidak melebihi42g dan selalunyaayam bolehmencapaiberat 1.0 hingga1.5 kg padaumur mencecahempat hingga 5 bulan (Aini, 1990). Bagidaging ayam kampung,ia mmpunyairasa yang enak berbanding dengan ayam komersial yang lain, dan ayam kampung ini terbukti mempunyaikadarlemakyang rendahberbandingdenganayamkomersial.Hal ini kerana ayam kampung lebih banyak bergerak berbandingdengan ayam komersial (Engku Azahanet al., 1990). Menurut Petersondan Brisbin(1999) ayam kampungjantan mempunyaiwarna bulu yang menyerlahberbandingdenganbetina. Padabulan Jun hinggaOktoberayam kampung akan menggugurkanpada bulu eclipse. Bulu tersebut khusus untuk ayam jantan. Musimpembiakanbagiayam kampungialah padamusim bungaclanjuga musim panasuntuk negarayang bermusim.Anakayam kampungakan menetasdan hidup pada musim panas.Telur akan dihasilkandan akan dieramselama21 had, anak ayam akan berkembangdi dalamtelur. Padahad pertamahati dan salurandarah anak ayam akan berfungsi, kepala mula membentuk. Pada had keempat organ dalaman anak ayam terbentuk. Hari kelima stuktur jantina terbentuk. Pada had ke-13 tulang terbentuk dengan mengunakankalsium daripada kulit telur. Pada had ke-21 anak ayam telah lengkap,dan kulit telur mula retak dan anak ayam menetas(North dan Bell, 1990).. 11.

RU]UKAN Abouelezz,F. M. K., Castano,C., Toledano-Diaz,A., Esteso,M. C., Lopez-Sebastian, A., J. 2015. Effectof the interaction between Campo,J. L. and Santiago-Moreno, cryoprotectantconcentrationand cryopreservationmethod on frozen/thawed chickensperm variables.Reproductionin DomesticAnimals50(1): 135-141 Aini, I. 1990.Indigenouschickenproductionin South-eastAsia. World'sPoultryScience Journal46(1): 51-57 Aitken, R. J. 1995. Free radicals,lipid peroxidationand sperm function. Reproduction, Fertility and Development7(4): 659-668 Andrabi S, MaxwellW. 2007. A review on reproductivebiotechnologyfor conservation of endangeredmammalianSpecies.AnimalReproductionScience99: 233-243 Anel, L., De Paz,P., Alvarez,M., Chamorro,C. A., Boixo, J. C., Manso,A. and Anel, E. 2003. Field and in vitro assay of three methods for freezing ram semen. Theriogenology60(7): 1293-1308 Barbas,J. P., and Mascarenhas,R. D. 2009. Cryopreservation of domesticanimal sperm 49-62 Cell Tissue Banking 10(1): and cells. Birdlife International, 2012. GallusGallus.The IUCN Red List of ThreatenedSpecies. Cited: 27. November2017 Blanco,J. M., Gee, G., Wildt, D. E. and Donoghue,A. M. 2000. SpeciesVariation in Osmotic, Cryoprotectant,and Cooling Rate Tolerance in Poultry, Eagle, and PeregrineFalconSpermatozoa.Biologyof Reproduction63(4): 1164-1171 Blash,S., Melican,D.,Gavin,W., 2000. Cryopreservation of epididymalspermobtainedat necropsyfrom goats. Theriogenology54: 899-905 Blesbois,E. 2007. Current status in avian semen cryopreservation.Worlds Poultry ScienceJournal63(2): 213-222. Blesbois,E. 2007.Advancesin avian semencryopreservation.INRA,France,1-7. Blesbois,E., Dubos, F., Grasseau,I., Richard,M. M., Roman,Y., Saint Jalme, M. and Seigneurin,F. 2006. Cryopreservationof Avian Spermatozoaand Predictorsof Ability to Freezing.Lesactesdu BRG6: 415-431 Bratton, R. W., Foote, R. H. and Cruthers,J. C. 1955. Preliminaryfertility results with frozen bovine spermatozoa.Journalof Dairy Science38(1): 40-46 Burrows, W. H., & Quinn, J. P. 1935. A method of obtaining spermatozoafrom the domesticfowl. Poultry Science14(4): 251-253 Campo, J. L. and Santiago-Moreno,J. 2015. Effect of the interaction between cryoprotectantconcentrationand cryopreservationmethod on frozen/thawed chickenspermvariables.Reproductionin DomesticAnimals50(1): 135-141 Clarke, R. N., Sexton,T. J., Ottinger, M. A. 1982. Effect of holding temperature and storage time on respiratory rate, motility and fertility of chickenand turkey semen. PoultryScience61: 1912-1917 Comizzoli,P., Mermillod, P. and Mauget, R. 2000. Reproductivebiotechnologiesfor endangeredmammalianspecies.ReproductionNutrition Development40(5): 493-504 EngkuAzahan,E. A., Yeong,S. W. and Noraziah,M. 1990.Intensiverearingof kampung chickens for meat production. In Proceedings,Zid Congress Veterinarian Association.Malaysiapp. 108-110 Evans,G.and Maxwell,W. C. 1987. Salamons'artificialinseminationof sheepand goats (No. Ed. 2). Butterworths pp. 194 Fiser, P. S. and Fairfull, R. W. 1986. The effects of rapid cooling (cold shock) of ram semen, photoperiod,and egg yolk in diluents on the survivalof spermatozoa before and after freezing. Cryobiology23(6): 518-524 36.

Freshney,R. I. 2000. Biologyof culturedcells. Cultureof Animal Cells. Gao, D., Mazur, P. and Critser, J. K. 1997. FundamentalCryobiologyof Mammalian Spermatozoa.In: ReproductiveTissueBankingpp: 263-328 Gao,H. H., Li, Z. P., Wang,H. P., Zhang, L. F. and Zhang,J. M. 2016.Cryopreservation of whole bovine ovaries: comparisonsof different thawing protocols. Eur J Obstet GynecolReproductionBiology204: 104-107 Gautier,Z., 2002. Gallusgallus (On-line), AnimalDiversity Web, accessed31.05.16 at http://animaldiversity.org/accounts/Gallus gallus Gilmore,J. A., Liu, J., Woods,E. J., Peter,A. T. and Critser,J. K. 2000. Cryoprotective agent and temperature effects on human sperm membrane permeabilities: convergence of theoretical and empirical approaches for optimal cryopreservationmethods.HumanReproduction15(2): 335-343 Goffaux, M. (1991). Techniquesde congelationde la semencede taureau. UnceiaEl. and Ins 241: 3-18 Helmenstine, A. M. 2014. Ringer's Solution Recipe. Retrieved July 1,2015 from http:/chemistry. About.com/odlabrecipes/a/Ringer-S-Solution-Recipe. html Hammerstedt,R. H. and Graham,J. K. 1992. Cryopreservationof poultry sperm: the enigma of glycerol. Cryobiology29(1): 26-38 Han, X.F., Niu, Z.Y., Liu, F.Z., Yang, C.S., 2005.Effects of Diluents, Cryoprotectants, EquilibrationTime and Thawing Temperature on Cryopreservationof Duck Semen.InternationalJournalPoultry Science4: 197-201 Jang,T. H., Park,S. C., Yang,J. H., Kim,J. Y., Seok,J. H., Park,U. S., Choi,C. W., Lee, S. R. and Han,J. 2017.Cryopreservationand its clinicalapplications.Integrative MedicineResearch6(1): 12-18 Jacob, J., Pescatore,T. and Cantor, A. 2011. Avian digestive system. University of Kentucky-Collegeof Agriculturecited: 28.11.2017. . Long, J. A., Bongalhardo,D. C., Pelaez,J., Saxena,S., Settar, P., O'Sullivan,N. P., & Fulton,J. E. 2010. Roostersemencryopreservation:effect of pedigreeline and male age on postthawspermfunction. Poultry Science89(5): 966-973 LovelockJE, BishopMW. 1959.Preventionof freezingdamageto living cellsby dimethyl sulphoxide.Nature183: 1394-1395 Lukaszewicz,E., Jerysz,A., Partyka,A. and Siudziriska,A. 2008. Efficacyof evaluation of rooster sperm morphologyusing different staining methods. Researchin veterinaryscience85(3): 583-588 Malik, A., Haron,A. W., Yusoff, R., Nesa, M., Bukar,M., & KASIM,A. 2013. Evaluation of the ejaculate quality of the red jungle fowl, domesticchicken,and bantam chickenin Malaysia.TurkishJournal of Veterinaryand AnimalSciences37(5): 564-568 Massip, A. 2001. Cryopreservationof Embryos of Farm Animals. Reproduction in DomesticAnimal36: 49-55 Mazur, P., Leibo, S. P., Farrant,J., Chu, E. H. Y., Hanna,M. G. and Smith, L. H. 1970. Interactionsof coolingrate, warmingrate and protectiveadditiveon the survival FrozenCe/f pp. of frozen mammaliancells.In CibaFoundationSymposium-The 69-88. McGann,L. E., Yang, H. Y. and Walterson,M. 1988.Manifestationsof cell damageafter freezingand thawing. Cryobiology25: 178-185 and Fertility McDaniel,G. R. and Craig,J. V. 1959.BehaviorTraits, SemenMeasurements Science 38: 1005-1014 Journal Poultry of of White LeghornMales. Medeiros,C. M., Forell, F., Oliveira,A. T. and Rodrigues,J. L. 2002. Currentstatus of sperm cryopreservation:Why isn't better. Theriogenology57:327-344. 37.

Memon,A. A., Wahid, H., Rosnina,Y., Goh,Y. M., Ebrahimi,M., Nadia,F. M. and Audrey, G. 2011. Effect of butylatedhydroxytolueneon cryopreservationof Boer goat semenin Tris egg yolk pengekal.AnimalReproductionscience129(1): 44-49 North, M. 0. and Bell,D. D. 1990.Commercialchickenproductionmanual.Van Nostrand Reinhold Omeje,S. S. I. and Madre,B. N. 1990.Evaluationof the semencharacteristicsof adult cocksof different geneticbackgrounds.T77er/ogenology34(6):1111-1118 Pena,A, Linder-Forseberg C.2000. Effectsof equex, one- or twostep dilution, and two freezing and thawing rates on postthaw survival of dog spermatozoa. Theriogenology54: 859-875 Perry, E. J. 1955.Artificial inseminationof farm animals.RutgersUniversityPress New Brunswick. Peterson,A. T. and Brisbin, I. L. 1998. Geneticendangermentof wild RedJunglefowl Gallusgallus?.Bird ConservationInternationa/8(4): 387-394 Polge,C., Smith,A. U. and Parkes,A. S. 1949. Revivalof spermatozoaafter vitrification and dehydrationat low temperatures.Nature164(4172): 666 Purdy,P. H. 2006.A Reviewon GoatSpermCryopreservation.SmallRuminant Research63: 215-225 Rakha,B. A., Ansari, M. S., Akhter, S., Hussain,I. and Blesbois,E. 2016. Cryopreservationof Indian red jungle fowl (Gallusgallus murghi) semen. Animal ReproductionScience,174: 45-55 Rebsdat,S. and Mayer, D. 2001. Ethyleneoxide. Ullmann'sEncyclopediaof industrial chemistry. Riggs, R., Mayer,J., Dowling-Lacey,D., Chi, T. F., ]ones, E. and Oehninger,S. 2010. Does storage time influence postthaw survival and pregnancyoutcome?An analysisof 11,768cryopreservedhumanembryos.FertileSter///ty93: 109-115 Roca,J., Gil, M. A., Hernandez,M., Parrilla,I., Vazquez,3. M., & Martinez,E. A. 2004. Survival and fertility of boar spermatozoaafter freeze-thawingin pengekal supplementedwith butylatedhydroxytoluene.JournalofAndrology25(3): 397405. Romboli, D. K. Flock, A. Franchini (Eds.), 12th EuropeanPoultry Conference,10-14 September2006, Verona,Italy: Abstractsand Proceedings,Ithaca, NY(2006) Rebsdat,S., Mayer, S., Alfranseder,J. and Riedl, J. and HoechstAktiengesellschaft. 1980. Processfor improvingthe activityof usedsupportedsilvercatalysts.U.S. Patent4,186,106. Safalaoh,A. C. L. 1997.Characteristicsof indigenouschickensof Malawi.AnimalGenetic GenetiquesAnimales/RecursosGenet/cosAnlmales22: Resources/Resources 61-69. Salamon,S. and Maxwell,W. M. C. 2000. Storageof ram semen.AnimalReproduction Science62(1): 77-111 L. G., Maxwell,W. M., Paleg,L. G. and Setchell,B. P. 1992.Prolineand Sanchez-Partida, glycine betaine in cryoprotectivediluents for ram spermatozoa.Reproduction, Fertility and Development4(l): 113-118 Senger,P. L. 2003. Pathwaysto pregnancyand parturition. WashingtonState University. CurrentConceptions. Siegfried Rebsdat; Dieter Mayer 2005, "Etilena glikol", Ullmann's Encyclopediaof a10_101 Industrial Chemistry,Weinheim:Wiley-VCH,doi: 10.1002/14356007. Siudzinska,A, Lukaszewick,E. 2008. The effect of breed on freezability of semen of fancyfowl. An/ma/SciencePapersand Reports4: 331-340 Shamsuddin,M., Amiri, Y. and Bhuiyan,M. M. U. 2000. Characteristicsof buck semen with regardto ejaculatenumbers,collectionintervals,diluentsand preservation periods.Reproductionin DomesticAnimals35(2): 53-57 38.

Solihati, N., Idi, R., Setiawan,R. and Asmara,I. Y. 2006. PengaruhLamaPenyimpanan SemenCairAyam Buraspada Suhu 5 OCterhadap PeriodeFertil dan Fertilitas Sperma(The StorageTime Effectof The LocalChickenChilledSemenat 5 OC on Fertilityand Fertile Periodof Sperm).Jurnal/lmu ternak, 6(1). Squires, E. L., Keith, S. L. and Graham, J. K. 2004. Evaluation of Alternative Cryoprotectantsfor PreservingStallionSpermatozoa.Theriogeno/ogy62:10561065 Subhani,A., Awan, M. S., Anwar, M., Ali, U. and Dar, N. I. 2010. Populationstatus and distribution pattern of red jungle fowl (Ga//usgallusmurghi)in Deva Vatala National park, AzadJammu and Kashmir.Pakistan:A PioneerStudy. Pakistan Jounal of Zoology42: 701-706 Tarekegn, G. 2016. A ReviewArticle of Artificial Insemination in Poultry. Journal of Worlds Veter/nary6(1): 26-35 Tarvis, K. M. 2013. New Methodsfor CryopreservingRooster Spermatozoa.Degree ofMaster of Science.ColoradoState UniversityVeterinaryScience85: 583588 Yang, C. H., Wu, T. W., Cheng,F. P.,Wang,J. H. and Wu, J. T. 2016. Effectsof different cryoprotectants and freezing methods on post-thaw boar semen quality. ReproductiveBiology16(1): 41-46. 39.