LAPORAN PRAKTIKUM TEKNOLOGI ENZIM BT (2073)
DETEKSI GEN INVA DAN SPVC PENYANDI VIRULENT DAN INVASIF
FAKULTAS BIOTEKNOLOGI
UNIVERSITAS KRISTEN DUTA WACANA SEMESTER GASAL 2014/2015
BAB I PENDAHULUAN
A. Tujuan Praktikum
1. Memahami Prinsip analisis deteksi protein penyandi sifat virulensi dan invasif suatu bakteri patogen.
2. Mampu mengaplikasikan teknik biologi melekuler untuk amlifikasi gen
B. Dasar Teori
Polymerase chain reaction ("reaksi berantai polimerase", PCR) merupakan teknik yang sangat berguna dalam membuat salinan DNA. PCR memungkinkan sejumlah kecil sekuens DNA tertentu disalin (jutaan kali) untuk diperbanyak (sehingga dapat dianalisis), atau dimodifikasi secara tertentu. Sebagai contoh, PCR dapat digunakan untuk menambahkan situs enzim restriksi, atau untuk memutasikan (mengubah) basa tertentu pada DNA. PCR juga dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan sekuens DNA tertentu dalam sampel (Yepyhardi. 2011).
PCR memanfaatkan enzim DNA polimerase yang secara alami memang berperan dalam perbanyakan DNA pada proses replikasi. Namun demikian, tidak seperti pada organisme hidup, proses PCR hanya dapat menyalin fragmen pendek DNA, biasanya sampai dengan 10 kb (kb=kilo base pairs=1.000 pasang basa). Fragmen tersebut dapat berupa suatu gen tunggal, atau hanya bagian dari suatu gen. Proses PCR untuk memperbanyak DNA melibatkan serangkaian siklus temperatur yang berulang dan masing-masing siklus terdiri atas tiga tahapan. Tahapan yang pertama adalah denaturasi cetakan DNA (DNA template) pada temperatur 94-96 °C, yaitu pemisahan utas ganda DNA menjadi dua utas tunggal. Sesudah itu, dilakukan penurunan temperatur pada tahap kedua sampai 45-60 °C yang memungkinkan terjadinya penempelan (annealing) atau hibridisasi antara oligonukleotida primer dengan utas tunggal cetakan DNA(Yepyhardi. 2011).
Primer merupakan oligonukelotida utas tunggal yang sekuens-nya dirancang komplementer dengan ujung fragmen DNA yang ingin disalin; primer menentukan awal dan akhir daerah yang hendak disalin. Tahap yang terakhir adalah tahap ekstensi atau elongasi (elongation), yaitu pemanjangan primer menjadi suatu utas DNA baru oleh enzim DNA polimerase (Lisdiyanti, 1997).
Adapun macam-macam tipe dan modifikasi dari PCR adalah sebagai berikut: A. Real-Time PCR
Real-Time PCR adalah suatu metode analisa yang dikembangkan dari reaksi PCR. Real time ini juga dikenal sebagai quantitative real time polymerase chain reaction atau Q-PCR. Dimana teknik ini digunakanuntuk mengamplifikasi (memperbanyak) sekaligus menghitung(kuantifikasi) jumlah target molekul DNA hasil amplifikasi tersebut. Realtime PCR memungkinkan dilalukan deteksi dan kunatifikasi (sebagai nilaiabsolut dari hasil perbanyakan DNA atau jumlah relatif setelah dinormalisasi terhadap input DNA atau gen-gen penormal yangditambahkan) sekaligus terhadap sequens spesifik dari sampel DNA yangdianalisis. Pada analisa PCR konversional deteksi keberadaan DNAdilakukan pada akhir reaksi dan pengamatan keberadaan DNA hasilamplifikasi dilakukan di gel agarose setelah dilakukan proseselektroforesis. Sedangkan analisa menggunakan Real Time PCR memungkinkan untuk dilakukan pengamatan pada saat
reaksi berlangsung, keberadaan DNA hasil amplifikasi dapat diamati pada grafik yang munculsebagai hasil akumulasi fluoresensi dari probe(penanda) (Handoyo, D. & R. Ari. 2001).
B. Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)
Reverse Transcriptase-PCR juga sering dikenal dengan kineticpolymerase chain reaction. RT-PCR merupakan modifikasi dari PCR,dimana yang diamplifikasi berupa m-RNA. Pada metode PCR biasasumber sampel yang digunakan adalah DNA yang diekstrak dari sel atau jaringan. Pada RT-PCR sampel yang digunakan bukan DNA melainkanRNA. Sebagaimana kita ketahui, RNA merupakan asam ribonukleat rantaitunggal, sedangkan DNA adalah asam ribonuleat rantai ganda. Ciri khasRNA adalah tidak terdapat gugus basa timin (T) melainkan diganti olehurasil (U). Proses RT PCR dibantu oleh enzim Reverse Transcriptase,karena hanya enzim jenis ini yang dapat mensintesis DNA dengan cetakanRNA karena polimerase DNA hanya dapat mensintesis dengan menggunakan cetakan DNA (Labequip 2016).
C. Nested PCR
Nested PCR adalah suatu teknik perbanyakan(replikasi) sampel DNAmenggunakan bantuan enzim DNA polymerase yang menggunakan dua pasang primer untuk mengamplifikasi fragmen.Dengan menggunakan nested PCR, jika ada fragmen yang salah diamplifikasi maka kemungkinan bagian tersebut diamplifikasi untuk kedua kalinya olehprimer yang kedua. Dengan demikian, nested PCR adalah PCR yangsangat spesifik dalam melakukan amplifikasi.Nested PCR dan PCR biasa berguna untuk memperbanyak fragmenDNAtertentu dalam jumlah banyak. Dimana pada nested PCR digunakan 2 pasang primer sedangkanpada PCR biasa hanya menggunakan 1 pasang primer. Oleh karena ituhasil fragmen DNA dari nested PCR lebihspesifik (lebih pendek) dibandingkan dengan PCR biasa.Waktu yang diperlukan dalam reaksi nested PCR lebih lama daripada PCR biasa karena pada nested PCRdilakukan 2 kali reaksi PCR sedangkan pada PCR biasa hanya 1 kali reaksi PCR. Selain itu, keuntungan nested PCR adalah meminimalkan kesalahan amplifikasi gen dengan menggunakan 2 pasang primer.Mekanisme kerja dari nested PCR sendiri yakni pada Fase Denaturasi, Pertama-tama DNA mengalami denaturasi lalu memasuki fasepenempelan. Fase Penempelan, sepasang primer pertama melekat di keduautas tunggal DNA dan mengamplifikasi DNA di antara kedua primer tersebut dan terbentuklah produk PCR pertama. Fase pemanjangan, produk PCR pertama tersebut dijalankan pada proses PCR kedua di manapasangan primer kedua (nested primer) akan mengenali sekuen DNAspesifik yang berada di dalam fragmen produk PCR pertama dan memulai amplifikasi bagian di antara kedua primer tersebut. Hasilnya adalah sekuens DNA yang lebih pendek daripada sekuens DNA hasil PCR pertama(Labequip. 2006).
D. Multiplex-PCR
Multiplex PCR merupakan beberapa set primer dalam campuranPCR tunggal untuk menghasilkan amplikon dari berbagai ukuran yangspesifik untuk sekuens DNA yang berbeda. Dengan
penargetan gensekaligus, informasi tambahan dapat diperoleh dari lari-tes tunggal yangtidak akan membutuhkan beberapa kali reagen dan lebih banyak waktuuntuk melakukan. temperatur Annealing untuk masing-masing set primerharus dioptimalkan untuk bekerja dengan benar dalam reaksi tunggal, dan ukuran amplikon. Artinya, panjangnya pasangan basa harus berbeda cukup untuk membentuk band yang berbeda ketika divisualisasikan dengan elektroforesis gel(Handoyo, D. & R. Ari. 2001).
BAB II METODOLOGI
A. Alat dan Bahan
o Thermocycler-PCR machine
o Kit PCR (Dream Taq TM Green PCR Mastermix) o Sampel DNA target
o Primer gen inVA danSpvC
o Gel agarose 1,2% dalam TBE 10X o Sbyr safe green
o Loading dye o Marker DNA o Gel apparatus
B. Cara Kerja :
1. Hidupkan mesin PCR, kemudian dilakukan setting program PCR dengan pengaturan sebagai berikut (lihat tabel di bawah ini)
Tabel Program PCR
Program Jumlah siklus Tahapan Suhu Waktu Gen InvA (244 bp) dan SpvC (571 bp) 1 Hot-Star (denaturasi awal) 95°C 1 menit 35 Denaturasi 95°C 30 detik Annealing 54°C - 64°C 30 detik Ekstensi 72°C 30 detik 1 Ekstensi akhir 72°C 7 menit
2. disiapkan PCR mix solution sesuai dengan prosedur yang tercantum dalam kit PCR yang tersedia dengan mencampurkan :
- 25 µl PCR mastermix
- 1 µl primer forward (10 pmol) - 1 µl primer reverse (10 pmol) - 22 µl dH2O bebas DNAse/ RNAse - 1 µl DNA cetakan
3. dilakukan amplifikasi pada mesin PCR
4. setelah siklus ke 30 berakhir, dilakukan running produk PCR pada gel elektroforesis BAB III
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil praktikum yang didapatkan dari PCR lubang gel 6, kelompok 6 menggunakan isolat Salmonella Typhi NCTC 786 No. 9
B. Pembahasan
Optimasi PCR perlu dilakukan dengan tujuan untuk mendapatkan hasil PCR yang optimal. Secara umum optimasi proses PCR dapat dilakukan dengan cara memvariasikan kondisi yang digunakan pada proses PCR tersebut. Optimasi kondisi berkaitan erat dengan faktor-faktor seprti jenis polimirase DNA, suhu konsentrasi, PCR, buffer, dan waktu. Pemilihan suhu pada proses PCR sangat penting karena suhu merupakan salah satu faktor yang menentukan keberhasilan suatu PCR. Dalam hai ini suhu berkaitan dengan proses denaturasi DNA templat, anneling dan elongsi primer.
Enzim DNA poluymerase yang digunakn pada saat proses perbanyakkan DNA berasal dari Thermus aquaticus. Hal tersebut disebabkan karena bakteri tersebut bersifat termostabil sehingga enzim tidak mudah terdenaturasi pada proses PCR yang berlangsung pada suhu tinggi. Kondisi siklus reaksi yang digunkan dalam praktikum bergantung pada setiap tahap yang meliputi denaturasi, annealing dan polimerisasi. Pada tahap denaturasi diatur dengan suhu sebesar 94oC selama 30 detik. Denaturasi berfungsi untuk mengurangi untai ganda DNA menjadi untai tunggal. Tahap anneling (penempelan primer) berlangsung selama 30 detik pada suhu 55ºC. Tahap elongsu atau polimerisasi DNA berlangsung pada suhu 72ºC karena suhu tersebut merupakan suhu optimum polimirase DNA yang biasa digunakan untuk proses PCR. Ada bebrapa faktor yang menyebabkan tidak berhasilnya PCR, pada saat pengambilan gel salah, pengambilan primer ataupun reserve tertukar enzim.
BAB IV KESIMPULAN
1. Polymerase chain reaction ("reaksi berantai polimerase", PCR) merupakan teknik yang sangat berguna dalam membuat salinan DNA. PCR memungkinkan sejumlah kecil sekuens DNA tertentu disalin (jutaan kali) untuk diperbanyak (sehingga dapat dianalisis), atau dimodifikasi secara tertentu.
DAFTAR PUSTAKA
Handoyo, D. & R. Ari. 2001. Prinsip umum dan pelaksanaan Polymerase Chain Reaction (PCR). PCR 9: 17-28.
Labequip. 2006. Perkin elmer gene amp 9600 thermal cycler. 1 hlm.
http://www.labequip.com/perkinelmer-geneamp-9600-thermal-cycler.html, diakses 09 Mei 2013, pk. 15.57 WIB.
Lisdiyanti. 1997. Polimerase Chain Reaction: Cara Mudah Memperbanyak DNA. Warta Biotek. Bogor.
Yephyhardi. 2011. Mengenal PCR (Polymirase Chai Reaction). http://sciencebiotech.net/mengenal-pcr-polymerase-chain-reaction/
