Bagian Pulmonologi dan Kedokteran Respirasi FK UNS/ RS. Dr. Moewardi, 2016 Page 1 BAB III
METODE PENELITIAN
A. RANCANGAN PENELITIAN
Penelitian ini merupakan uji klinis experimental, pretest dan posttest design.
B. TEMPAT DAN WAKTU PENELITIAN
Penelitian dilakukan di RSUD Soehadi Pridjonegoro Sragen pada bulan Oktober 2015 sampai memenuhi besar sampel.
C. POPULASI PENELITIAN
Populasi target penelitian ini adalah penderita PPOK. Populasi terjangkau adalah penderita PPOK eksarsebasi akut yang di rawat di RSUD Soehadi Pridjonegoro Sragen pada bulan Oktober 2015 sampai memenuhi besar sampel.
D. PENGAMBILAN SAMPEL
Sampel dalam penelitian ini adalah penderita PPOK eksarsebasi akut yang menjalani perawatan di RSUD Soehadi Pridjonegoro Sragen pada bulan Oktober 2015 sampai besar sampel terpenuhi. Pengambilan sampel dilakukan secara consecutive sampling. Sampel dipilih berdasarkan ciri-ciri yang telah ditentukan (memenuhi kriteria inklusi). Penentuan sampel yang mendapat vitamin C atau plasebo dilakukan secara incidental sampling. Subjek penelitian bernomor ganjil dimasukkan dalam kelompok perlakuan dan subjek bernomor genap dimasukkan kelompok kontrol.
Bagian Pulmonologi dan Kedokteran Respirasi FK UNS/ RS. Dr. Moewardi, 2016 Page 2 E. BESAR SAMPEL
Penentuan besar sampel tergantung jenis penelitiannya. Gay dan Diehl (1992) dalam Kasjono dan Yasril (2013) menyatakan bahwa besar sampel harus diambil sebanyak-banyaknya sesuai kemampuan penelitian dengan mempertimbangkan waktu dan energi yang wajar. Besar sampel juga disesuaikan dengan jenis penelitiannya. Besar sampel minimal yang disarankan untuk penelitian eksperimental atau uji klinis adalah 15 subjek tiap kelompok.67 Penelitian ini melibatkan 1 kelompok perlakuan dan 1 kelompok plasebo. Besar sampel minimal untuk kelompok perlakuan (mendapat vitamin C) 15 subjek dan besar sampel minimal kelompok kontrol (plasebo) adalah 15 subjek. Koreksi besar sampel untuk antisipasi drop-out sebesar:
n ׳ = n/(1-f)
n’ = Besar sampel
n = Besar sampel yang dihitung
f = Perkiraan proporsi drop-out (10%)
n’ = 30/(1-0,1)
n’ = 33,33 dibulatkan menjadi 33
Untuk penelitian ini dipakai besar sampel sebanyak 34 subjek terdiri dari 17 subjek
kelompok kelompok perlakuan dan 17 subjek kelompok kontrol.67
F. KRITERIA INKLUSI, EKSKLUSI, DAN DISKONTINYU
1. Kriteria Inklusi
Penderita PPOK eksarsebasi akut yang telah terdiagnosis secara klinis, umur lebih dari 40 tahun berdasarkan selisih hari kelahiran dengan ulang tahun terakhir pada saat penelitian, bersedia mengisi kuesioner dengan lengkap dan
Bagian Pulmonologi dan Kedokteran Respirasi FK UNS/ RS. Dr. Moewardi, 2016 Page 3 benar, serta bersedia ikut dalam penelitian dan menandatangani lembar persetujuan.
2. Kriteria Eksklusi
Penderita PPOK eksarsebasi akut yang memerlukan perawatan ICU dan ventilator, menderita diare, gagal ginjal, kanker, yang menerima terapi antioksidan tambahan lain selama penelitian berlangsung, atau yang mempunyai riwayat alergi vitamin C.
3. Kriteria diskontinyu
Penderita mengundurkan diri atau meninggal dunia, mengalami efek samping pemberian vitamin C antara lain gejala gastroenteritis (mual, muntah, dan diare), sakit kepala selama penelitian berlangsung, mengalami penurunan fungsi ginjal sehingga memerlukan penghentian pemberian vitamin C, atau mengalami efek samping pemberian injeksi larutan NaCl 0,9 % maka pasien mengalami hipernatremia, hiperkloremia, dan hipokalemia dengan gejala yang dirasakan antara lain mual, muntah, diare, kram perut, mulut kering, mata kering, demam, berkeringat, detak jantung cepat, tekanan darah meningkat, nyeri kepala, badan lemah, kejang, dan kram otot.
G. VARIABEL PENELITIAN
1. Variabel bebas:
a. Terapi standar PPOK eksaserbasi akut dan vitamin C. b. Terapi standar PPOK eksaserbasi akut dan plasebo.
2. Variabel tergantung:
a. Kadar interleukine-6 (IL-6) plasma.
Bagian Pulmonologi dan Kedokteran Respirasi FK UNS/ RS. Dr. Moewardi, 2016 Page 4 H. DEFINISI OPERASIONAL
1. PPOK eksaserbasi akut yang terdiagnosis secara klinis
PPOK eksaserbasi akut adalah suatu kondisi perburukan gejala penderita PPOK yang membutuhkan perubahan terapi. Penegakan diagnosis PPOK eksarsebasi akut pada penelitian ini berdasarkan klinis dan radiologis. Gejala klinis PPOK eksarsebasi didapat perburukan gejala kondisi sehari-hari berupa batuk, sesak, dan perubahan purulensi dahak. Rontgen toraks didapatkan gambaran hiperinflasi, hiperlusen, diafragma mendatar, corakan bronkovaskuler meningkat, dan jantung pendulum.
2. Vitamin C
Vitamin C adalah antioksidan vitamin yang larut dalam air. L-ascorbic acid merupakan zat aktif vitamin C yang memiliki efek utama sebagai antioksidan dan antiinflamasi. Vitamin C diberikan pada subjek kelompok perlakuan sebanyak 1000 mg/ hari secara intravena selama hari perawatan. Kelompok kontrol tidak diberikan vitamin C, tetapi diberikan placebo berupa injeksi larutan NaCl 0,9% sebanyak 5 mL. Skala data nominal.
3. Interleukin-6
Interleukin-6 merupakan salah satu sitokin proinflamasi pada imunopatogenesis PPOK. Kadar IL-6 dinyatakan dalam satuan pikogram per milliliter (pg/ mL). Skala data menggunakan skala data numerik.45
4. Lama rawat inap
Lama rawat inap merupakan lama hari pasien PPOK eksaserbasi menjalani rawat inap sampai memenuhi kriteria pemulangan. Penghitungan hari lama rawat inap dilakukan dengan cara waktu lama perawatan ditotal dalam hitungan jam dibagi 24 jam, sisanya < 12 jam dibulatkan ke bawah, tetapi jika ≥ 12 jam di bulatkan ke atas. Penghitungan lama rawat inap dimulai pada saat pasien
Bagian Pulmonologi dan Kedokteran Respirasi FK UNS/ RS. Dr. Moewardi, 2016 Page 5 dinyatakan sebagai subjek penelitian sampai dinyatakan stabil secara klinis dan boleh pulang oleh dokter yang merawat yaitu ketika memenuhi kriteria pemulangan berdasarkan Global initiative for chronic obstructive lung disease tahun 2015 (mampu menggunakan bronkodilator kerja panjang dengan atau tanpa steroid inhalasi, membutuhkan bronkodilator jangka pendek lebih dari tiap 4 jam, mampu bergerak sekitar ruangan, mampu makan dan minum tanpa sesak, pasien stabil secara klinis 12-24 jam, dan pasien mampu menggunakan pengobatan di rumah). Skala ukur dinyatakan dalam hari sedangkan skala data menggunakan skala numerik (rasio).
I. INSTRUMEN PENELITIAN
1. Alat:
Affimetrix eBioscience Human IL-6 Platinum ELISA. Nomor katalog BMS213/ 2/ BMS213/ 2TEN, OxiSelectTM TBARS Assay kit (MDA Quantitation) produksi Cell Biolabs, Inc dengan nomor katalog STA-330, Spuit 5 mL, tabung EDTA, alat sentrifuge, mesin pendingin (suhu -20o C), ice gel, termos es, ELISA reader, spectrophotometric plate reader.
2. Bahan:
Darah vena ± 5mL, assay buffer, Biotin conjugate, absorbent paper, adhesive film, cairan streptavidin HRP, stop solution, lysis Solution, reagen thiobarbituric acid reactive.
J. PROSEDUR PENGUMPULAN DATA
1. Subjek penelitian terdiri dari penderita PPOK eksarsebasi akut yang datang ke RSUD Soehadi Pridjonegoro Sragen. Penegakan diagnosis PPOK eksaserbasi akut berdasarkan klinis dan radiologis. Gejala klinis PPOK eksarsebasi didapat perburukan gejala kondisi sehari-hari berupa batuk, sesak, dan perubahan
Bagian Pulmonologi dan Kedokteran Respirasi FK UNS/ RS. Dr. Moewardi, 2016 Page 6 purulensi dahak. Rontgen toraks didapatkan gambaran hiperinflasi, hiperlusen, diafragma mendatar, corakan bronkovaskuler meningkat, dan jantung pendulum. Subjek penelitian diberi penjelasan mengenai tujuan dan manfaat penelitian. 2. Subjek yang bersedia ikut penelitian diminta menandatangani lembar persetujuan
(informed consent).
3. Subjek yang memenuhi kriteria inklusi diberi penjelasan, dicatat identitas, riwayat merokok, penyakit lain yang diderita, pekerjaan, di ukur tinggi badan dan berat badannya, serta lain-lain pada formulir yang disediakan. Data awal subjek diperoleh dari anamnesis, pemeriksaan fisik, laboratorium darah, dan rontgen toraks. Subjek kemudian diambil darah vena untuk diperiksa kadar IL-6 dan mulai dicatat tanggal dan jam rawat inap.
4. Subjek dibagi menjadi dua kelompok secara insidental. Kelompok pertama mendapat vitamin C 1X1000 mg/ hari yang diberikan secara intravena selama dirawat. Kelompok kedua mendapat plasebo berupa NaCl 0,9 % sebanyak 5 mL secara intravena sekali sehari selama dirawat.
5. Terapi standar PPOK eksarsebasi akut (bronkodilator, kortikosteroid, antibiotik) dan terapi suportif lainnya tetap diberikan sesuai prosedur.
6. Penderita di follow-up (gejala klinis dan efek samping) dilakukan setiap hari sampai kriteria pemulangan penderita terpenuhi.
7. Penderita yang memenuhi kriteria pemulangan diambil darah vena untuk pemeriksaan kadar IL-6 dan dihitung lama rawat inap. Kriteria pemulangan yang digunakan terdiri dari mampu menggunakan bronkodilator kerja panjang dengan atau tanpa steroid inhalasi, membutuhkan bronkodilator jangka pendek lebih dari tiap 4 jam, mampu bergerak sekitar ruangan, mampu makan dan minum tanpa sesak, pasien stabil secara klinis 12-24 jam, dan pasien mampu menggunakan pengobatan di rumah.)
Bagian Pulmonologi dan Kedokteran Respirasi FK UNS/ RS. Dr. Moewardi, 2016 Page 7 K. TEKNIK PEMERIKSAAN
1. Sebanyak 5 mL darah vena diambil 1-2 jam setelah penderita masuk IGD sebelum penderita mendapatkan terapi standar. Darah dimasukkan dalam tabung EDTA, dibolak-balik secara perlahan, kemudian dikirim ke laboratorium patologi klinik RSUD dr. Soehadi Pridjonegoro Sragen.
2. Dilakukan sentrifuge terhadap darah vena tersebut dengan kecepatan 300 rpm selama 15 menit, kemudian diambil plasma darah hasil sentrifuge.
3. Plasma darah disimpan dalam lemari pendingin dengan suhu -20o C sampai semua sampel diambil.
4. Setelah jumlah sampel terpenuhi, plasma darah dikirim ke laboratorium biomedik FK UNS dengan menggunakan termos es dan ice gel.
5. Kadar IL-6 plasma diukur di laboratorium Biomedik FK UNS dengan metode ELISA.
Prosedur pemeriksaan kadar IL-6:
a. Tentukan berapa banyak microwell strips yang dibutuhkan untuk tes (termasuk sample wells dan wells untuk running blank dan standar). Tiap sampel, standar, blank, dan kontrol harus diuji secara rangkap. Buka extra microwell strips dari pegangannya dan simpan dalam kantung alumunium foil sehingga dapat terjaga suhunya pada 2-8oC.
b. Cuci microwell stips dua kali dengan 400 mikroliter (μL) pencuci. Buffer tiap well dan aspirasi isi microwell diantara pencucian. Biarkan wash buffer berada pada well selama 10-15 menit sebelum diaspirasi. Jaga jangan sampai permukaan microwell tergores. Setelah pencucian terakhir, kosongkan well dan ketuk-ketukkan microwell strips pada absorbent pad atau paper towel untuk membersihkan kelebihan wash buffer. Gunakan microwell strips secepatnya setelah pencucian atau letakkan miring pada absorbent paper tidak lebih dari 15 menit. Jangan biarkan well kering.
Bagian Pulmonologi dan Kedokteran Respirasi FK UNS/ RS. Dr. Moewardi, 2016 Page 8 c. Letakkan cairan standar pada microwell plate. Tambahkan 100 μL assay buffer/ kali sebanyak dua kali pada semua wells standar. Pindahkan 100 μL standar yang telah disiapkan dua kali, masukkan pada well A1 dan A2. Jaga jangan sampai permukaan dalam microwell tergores. Ulangi nprosedur ini lima kali, buat dua baris cairan standar IL-6 dengan rentang natar 100,00-1,56 pg/ mL. Keluarkan 100 μL isi microwell terakhir (G1,G2) yang digunakan.
d. Tambahkan 100 μL assay buffer/ kali yang dibuat rangkap pada blank wells. e. Tambahkan 50 μL assay buffer/ kali pada sample wells.
f. Tambahkan 50 μL assay buffer/ kali tiap sample yang dibuat rangkap pada sample wells.
g. Siapkan Biotin conjugate. Tambahkan 50 μL Biotin conjugate pada semua wells. Tutup dengan adhesive film dan inkubasi pada suhu ruangan (18-25oC) selama 2 jam, jika memungkinkan letakkan pada microplate shaker dan lakukan pemutaran dengan kecepatan 400rpm.
h. Siapkan streptavidin-HRP. Buka adhesive film dan well kosong. Cuci microwell strips empat kali seperti cara b.
i. Tambahkan 100 μL cairan streptavidin HRP pada semua well termasuk well yang kosong. Tutup dengan adhesive film dan inkubasi pada suhu ruang selama 1 jam dan jika mungkin purar pada microplate shaker dengan kecepatan 400 rpm.
j. Sedot 100 μL TMB substrate solution pada semua well. Inkubasi microwell strip pada suhu ruang (18-25oC) sekitar 10 menit. Hindari paparan cahaya langsung. Dianjurkan ditambahkan stop solution ketika standar tertinggi yang berwarna biru tua terbentuk. Alternatifnya warna yang terbentuk dapat dimonitor dengan ELISA reader pada lempeng 620 nanometer (nm). Reaksi substrat harus dihentikan secepatnya setelah standar pertama terbentuk pada OD 0,9-0,95.
k. Hentikan reaksi enzimatik secepatnya dengan menambahkan 100 μL stop solution pada tiap well. Hasilnya harus segera dibaca setelah stop solution
Bagian Pulmonologi dan Kedokteran Respirasi FK UNS/ RS. Dr. Moewardi, 2016 Page 9 ditambahkan atau dalam 1 jam jika microwell strips disimpan pada suhu 2-8oC di tempat gelap.
l. Baca absorbance tiap microwell dengan spectrophotometer pada lempeng 450 nm.
6. Perhitungan lama rawat inap dihitung dengan cara menjumlahkan total jam perawatan mulai saat masuk rumah sakit (MRS) sampai memenuhi kriteria pemulangan dan samapai dinyatakan boleh pulang oleh dokter. Jumlah total jam perawatan dibagi 24. Hasilnya jika < 12 jam di bulatkan ke bawah dan jika ≥12 jam di bulatkan ke atas.
L. ETIKA PENELITIAN
Persetujuan penelitian diajukan penulis ke Panitia Kelaikan Etik Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret (FK UNS) Surakarta sebelum dilakukan penelitian. Penjelasan mengenai tujuan, manfaat, dan prosedur penelitian dijelaskan dengna rinci kepada masing-masing subjek penelitian sebelum penelitan dimulai. Subjek yang setuju dan bersedia mengikuti penelitian diminta menandatangani lembar persetujuan (informed consent) dan isian data penderita.
M. ANALISIS DATA
Dalam analisis data penelitian ini akan dinilai pengaruh pemberian vitamin C pada penderita PPOK eksarsebasi akut. Data dianalisis menggunakan program komputer SPSS 21 for Windows. Pengaruh adalah penilaian pemberian vitamin C terhadap kadar IL-6 plasma dan lama rawat inap penderita PPOK eksarsebasi akut. Data yang didapat diolah dengan uji beda. Uji beda digunakan untuk mengetahui perbedaan kadar IL-6 plasma dan lama rawat inap antara sampel yang mendapat vitamin C dan placebo.
Bagian Pulmonologi dan Kedokteran Respirasi FK UNS/ RS. Dr. Moewardi, 2016 Page 10 Uji beda adalah uji statistik yang digunakan untuk mengetahui hasil perbedaan dua sampel. Analisis data perbedaan kadar IL-6 plasma dan lama rawat inap penderita PPOK eksarsebasi akut sebelum dan sesudah pemberian vitamin C atau plasebo adalah sebagai berikut:
a. Data berdistribusi normal, analisis data dengan uji parametrik atau uji t-test berpasangan.
b. Data tidak berdistribusi normal, analisis data dengan melakukan transformasi data terlebih dahulu. Jika data hasil transformasi berdistribusi normal maka dilakukan uji parametrik dengan uji t-test berpasangan. Jika data hasil transformasi berdistribusi tidak normal maka dilakukan uji nonparametrik untuk kelompok berpasangan yaitu dengan uji Wilcoxon.69
Analisis data untuk membandingkan kadar IL-6 plasma dan lama rawat inap penderita PPOK eksarsebasi akut antara kelompok yang mendapat vitamin C dan plasebo menggunakan:69
a. Data berdistribusi normal, analisis data dengan uji t-test tidak berpasangan b. Data tidak berdistribusi normal, analisis data dengan melakukan transformasi
data. Jika data hasil transformasi berdistribusi normal maka dilakukan uji parametrik dengan uji t-test tidak berpasangan. Jika data hasil transformasi berdistribusi tidak normal maka dilakukan uji nonparametrik untuk kelompok tidak berpasangan yaitu dengan uji Mann Whitney.69
Batas kemaknaan:69
- Nilai p > 0,05: tidak bermakna. - Nilai p ≤ 0,05: bermakna.
Bagian Pulmonologi dan Kedokteran Respirasi FK UNS/ RS. Dr. Moewardi, 2016 Page 11 N. ALUR PENELITIAN
Gambar 17. Alur penelitian hubungan pemberian vitamin C terhadap kadar IL-6 plasma, MDA plasma, dan lama rawat inap penderita PPOK eksarsebasi akut.
Keterangan: : alur penelitian, ---: area analisis statistik Penderita datang di
IGD Anamnesis, pemeriksaan fisik, laboratorium darah, dan
rontgen toraks PPOK eksarsebasi akut
Memenuhi kriteria inklusi
Informed consent
Setuju ikut penelitian Tidak setuju ikut penelitian
Eksklusi
Pemeriksaan kadar MDA plasma, IL-6 plasma
Insidental secara berurutan
Terapi standar + Vitamin C 1x 1000 mg
Terapi standar + Plasebo
Pemeriksaan IL-6 dan MDA plasma lama rawat inap
Analisis statistik
Penilaian perbaikan klinis dan laboratorium (Kriteria Discharge)
