33 BAB IV
METODE PENELITIAN
4.1. Desain Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratorium dengan rancangan True experimental dengan pretest-posttest control group design yang bertujuan untuk mengetahui dan membandingkan beberapa kelompok perlakuan.
Penelitian ini menggunakan tikus Wistar jantan yang dibuat model ulkus diabetik.
4.2. Populasi dan Sampel Penelitian
Sebagai sampel penelitian digunakan 20 ekor tikus Rattus norvegicus Wistar race usia 6-8 minggu dengan berat antara 150-200 gram yang diadaptasikan selama 1 minggu di Labolatorium FK UMM sebelum perlakuan.
Selanjutnya dilakukan screening dengan kriteria sebagai berikut:
Kriteria inklusi:
a) Tikus Wistar dewasa dan sehat b) Jantan, umur 6-8 minggu c) Berat antara 150-200 gram Kriteria ekslusi
a) Tikus Wistar tidak aktif bergerak b) Tikus Wistar terdapat rambut kusut
Penelitian ini menggunakan 5 perlakuan, yang terdiri dari
A. Kelompok yang diberi 55 mg/kgBB Streptozotocin(STZ) dan punggung di eksisi (kontrol positif)
B. Kelompok yang diberi 55 mg/kgBB STZ dan punggung di eksisi kemudian diberi ekstrak etanol daun afrika 10 mg/kgBB
C. Kelompok yang diberi 55 mg/kgBB STZ dan punggung di eksisi kemudian diberi ekstrak etanol daun afrika 30 mg/kgBB
D. Kelompok yang diberi 55 mg/kgBB STZ dan punggung di eksisi kemudian diberi insulin 10 IU/kgBB
E. Kelompok normal yang hanya diberi aquades dan punggung di eksisi (kontrol negatif)
Maka pengulangannya adalah:
P(n-1) ≥ 16 5(n-1) ≥ 16
5n ≥ 21 n ≥ 4
Maka jumlah pengulangan yang dibutuhkan untuk tiap kelompok perlakuan minimal adalah 4.
4.3. Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Farmako dan Laboratorium Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas Muhammadiyah Malang.
4.4. Variabel Penelitian
4.4.1. Variabel Bebas (Independen)
Variabel bebas dalam penelitian ini adalah pemberian ekstrak etanol daun afrika (Vernonia amygdalina).
4.4.2. Variabel Tergantung (Dependen)
Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah kadar gula darah, kecepatan penutupan luka secara makroskopis, penyembuhan luka secara histopatologi, dan kadar serum sitokin TNF-α pada pada tikus model ulkus diabetik.
4.5. Definisi operasional
Tabel 4. 1 Definisi Operasional Penelitian
No .
Variabel Definisi Operasional
Variabel
Cara Ukur / Cara Pemberian
Variabel
Hasil Ukur / Indikator
Variabel
Skala ukur variabel
1. Ekstrak Etanol Daun Afrika (Vernonia amygdalina)
Pemberian ekstrak etanol daun afrika dengan kadar 10 mg/kgBB dan 30 mg/kgBB
Pembuatan ektrak etanol dilakukan di Laboratorium Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas Muhammadiya h Malang dengan proses
Dosis I : 10 mg/kgBB Dosis II : 30 mg/kgBB Diberikan setiap hari selama 16 hari
Kategori k
(ordinal)
maserasi dan evaporasi, Pemberian ekstrak pada hewan coba dengan teknik sonde per oral 1x per hari selama 16 hari 2. Kadar Gula
darah
Membandingka n kadar gula darah tiap kelompok sebelum pemberian perlakuan (terapi) setelah di induksi streptozotocin dan sesudah perlakuan (terapi) pada hari ke 17
Pemeriksaan kadar gula darah melalui pengambilan cuplikan darah dari vena di ekor tikus dengan cara memotong sedikit ujung ekornya. Darah selanjutnya di teteskan pada glucose stick dan dibaca melalui kit diagnostik.
Maka hasilnya akan muncul dalam konsentrasi mg/dl.
Data disajikan dalam bentuk tabel hasil
penelitian
Nominal
3. Penyembuha n Luka (makroskopis )
Persentase hasil pengukuran luas
penyembuhan luka
pada hewan coba
Setelah kadar glukosa darah mencapai 250mg/dL, kemudian dilakukan eksisi pada punggung tikus berbentuk
Data disajikan dalam bentuk tabel hasil
penelitian
Nominal
persegi berukuran 2x2cm sampai seluruh
ketebalan kulit (epidermis dan hipodermis) terpisah.
Setelah itu dilakukan pengamatan dan
pengukuran luas luka dilakukan setiap 2 hari sekali
menggunakan penggaris dan menuliskan hasilnya pada rumus
persentase penutupan luas luka
4. Penyembuha n Luka secara
Histopatologi
Gambaran histopatologi untuk melihat hasil
penyembuhan luka selama percobaan dengan melihat beberapa komponen seperti proliferasi epitel dan infiltrasi sel radang.
Penilaian histopatologi dilakukan dari spesimen kulit yang telah diberi
pewarnaan HE dibawah mikroskop perbesaran 400x
Data disajikan dalam bentuk penjelasan deskriptif berdasarkan hasil
gambaran Histopatolog i Anatomi dengan menilai adanya proliferasi epitel dan
Deskripti f
infiltrasi sel radang 5. Kadar sitokin
TNF-α
Membandingka n kadar sitokin TNF-α antar tiap kelompok hewan coba
Saat
pembedahan, diambil sampel darah dari jantung menggunakan spuit,
kemudian ditampung pada vacutainer.
Sampel darah disentrifus untuk memperoleh serum, dan dilakukan pengecekan kadar
menggunakan kit diagnostik Serum ELISA Mouse TNF-α.
Hasil akhir plate dibaca dengan ELISA Reader
Data disajikan dalam bentuk tabel hasil
penelitian
Nominal
4.6. Bahan dan Alat Penelitian 4.6.1. Bahan
1. Pemeliharaan hewan coba : tikus wistar, pelet, sekam, air 2. Induksi : Streptozotocin (Bioworld 1 gram), Insulin 3. Ekstrak Daun Afrika
4. Reagen ELISA TNF-α.
5. Pembuatan luka dan Pembedahan : Lidocaine, Alcohol swab, Chloroform, Formalin
4.6.2. Alat
1. Wadah kandang tikus
2. Induksi diabetes dan uji kadar gula darah : Spuit 3cc, needle, glucose strip 3. Instrumen pembuatan luka dan pembedahan : Spuit 3cc, gunting, pinset,
styrofoam, kertas bedah, scalpel, surgical blade, handscone 4. Kit diagnostik Serum ELISA TNF-α.
5. Diagnostik dan pengukuran : Penggaris, bulpoin, kamera, mikroskop
4.7. Prosedur Penelitian
4.7.1. Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Afrika (Vernonia amygdalina)
Daun afrika (Vernonia amygdalina) didapat di perkebunan Daun Afrika Inovasi Nusantara (DAIN) Bandung, dikeringkan dan dilakukan proses ekstraksi di Laboratorium Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas Muhammadiyah Malang dengan metode maserasi dan evaporasi dengan pelarut alkohol 90%.
4.7.1.1. Proses Maserasi
1. Serbuk halus daun afrika ditimbang sebanyak 100 gram (sampel kering.
2. Serbuk dimasukkan ke dalam gelas Erlenmeyer ukuran ± 1L.
3. Serbuk kemudian direndam dengan etanol sampai volume 1000 mL.
4. Campuran tersebut dikocok sampai benar-benar tercampur (±30 menit).
5. Campuran kemudian didiamkan 1 malam sampai mengendap.
6. Lapisan atas campuran etanol (pelarut) dengan zat aktif yang sudah tercampur diambil, bbisa dengan caradisaring menggunakan kertas saring.
7. Proses perendaman ini dilakukan berulang hingga 3 kali.
4.7.1.2. Proses Evaporasi
1. Hasil penyaringan dimasukkan dalam labu evaporasi 1 L.
2. Labu evaporasi dipasang pada evaporator dan isi water bath dengan air.
3. Semua rangkaian alat termasuk rotary evaporator dipasang, pemanas water bathdiatur sampai 75oC, sesuai dengan titik didih pelarut,dan disambungkan dengan aliran listrik.
4. Larutan etanol dibiarkan terpisah dengan zat aktif yang sudah ada dalam labu evaporasi.
5. Ditunggu sampai aliran etanol berhenti menetes pada labu penampung (± 1,5 sampai 2 jam untuk 1 labu) ± 900 mL.
6. hasil ekstraksi dimasukkan ke dalam botol plastik/kaca.
7. Hasil Ekstraksi disimpan dalam freezer (Anita, et al., 2013)
4.7.2. Persiapan Hewan Coba
Preparasi hewan coba dilakukan selama 1 minggu untuk aklimatisasi di laboratorium. Disiapkan 20 tikus Wistar untuk melakukan penelitian ini. Tikus dibagi mencadi 5 kelompok masing-masing terdiri dari 4tikus.
4.7.3. Pembagian Kelompok Hewan Coba
Gambar 4.1 Pembagian Kelompok Hewan Coba A: STZ + Insisi + Aquades
B: STZ + Insisi + Ekstrak 10 mg/kgBB C: STZ + Insisi + Ekstrak 30 mg/kgBB D: STZ + Insisi + Insulin 10 IU/kgBB E: Insisi + Aquades
Keterangan:
Kelompok A, B, C, dan D diberi 55 mg/kgBB STZ secara intraperitoneal pada minggu ke-0 perlakuan. Semua tikus yang kadar serum glukosanya mencapai 250 mg/dL kemudian di eksisi pada punggung. Kelompok E juga dilakukan eksisi di punggung pada minggu ke-0. Selama 16 hari, kelompok A, dan E di berikan minum saja, sedangkan kelompok B diberi ekstrak daun afrika (Vernonia amygdalina) dengan sonde dengan dosis 10 mg/kgBB dan kelompok C diberi ekstrak dengan dosis 30 mg/kgBB. Kelompok D mendapat injeksi insulin subkutan dengan dosis 10 IU/kgBB selama 16 hari. Perubahan area luka di foto dan diukur pada hari ke 1,3,5,7,9,11,13,15. Semua tikus ditimbang pada hari ke-1 dan ke-16. Pada hari ke-17 dilakukan pembedahan.
4.7.4. Pembuatan Model Diabetes
Dosis tunggal Streptozotocin (STZ) 55 mg/kgBB yang dilarutkan pada buffer sitrat (pH 4,4, 0,1 M) diinjeksikan secara intraperitoneal untuk menginduksi diabetes. Kelompok tikus kontrol yang seusia memperoleh volume buffer sitrat yang sama. Sampel darah diambil menggunakan glucose stick dan diukur dengan kit diagnostik. Tikus yang kadar glukosanya mencapai lebih dari 250 mg/dL dipilih untuk digunakan dalam penelitian.
4.7.5. Pembuatan Model Ulkus Diabetik
Sebelum hari perlakuan tikus dilakukan eksisi, tikus di anastesi menggunakan lidocaine IM. Setelah hipostesia tercapai, rambut pada regio tulang belakang punggung paling atas dicukur dan didesinfeksi menggunakan Iodin.
Setelah infiltrasi dengan Lidokain, dibuat irisan persegi sepanjang 2cm, dan melebar 2cm, kedalaman sampai subkutis. Luka dibersihkan dan dioles larutan Iodin. Kemudian luka ditutup dengan transparent dressing untuk pengondisian luka dalam keadaan lembab yang merupakan kondisi ideal untuk penyembuhan luka dan mencegah kontaminasi ke area sekitarnya. Tikus dibagi dalam tiap kelompok perlakuan. Kelompok tikus yang tidak diinduksi diabetes juga dilakukan eksisi pada punggung. Perawatan luka dengan menggunakan NaCl 0,9% untuk mencegah timbulnya infeksi.
4.7.6. Pemberian Ekstrak Etanol Daun Afrika (Vernonia amygdalina)
Ekstrak etanol daun afrika diberikan dalam dosis pada tikus B sebesar 10 mg/kgBB, tikus C sebesar 30 mg/kgBB, selama 16 hari secara oral menggunakan sonde. Pemberian dosis ini mengacu pada penelitian sebelumnya oleh Asante (2016) yang meneliti tentang efek dari anti-diabetes ekstrak daun afrika tua dan muda terhadap tikus yang diinduksi STZ dengan menilai kadar serum glukosa darah, parameter hematologi, enzim hepar, kadar lipid, dan efek toksik secara histopatologi.
4.7.7. Pengukuran area luka, dan pengukuran “half closure time”
Tikus diletakkan pada meja pemeriksaan dengan pencahayaan yang cukup.
Penggaris meteran diletakkan pada tepi luka untuk perhitungan luas luka.
Pengukuran dilakukan secara manual menggunakan penggaris untuk mengukur luas luka. Setelah itu dilakukan pencatatan dan perhitungan persentase penutupan luka diukur dengan rumus:
4.7.8. Isolasi PunggungTikus 1. Alat
Gunting kecil, pinset, spidol, sarung tangan, masker, toples untuk anastesi, botol formalin, kertas label
2. Bahan
Tikus yang sudah dibuat ulkus diabetik, eter, formalin 10%, alkohol, styrofoam, kapas, alumunium foil
3. Cara Kerja
a. Pada hari ke-17, tikus yang sudah diinduksi ulkus diabetik dibunuh menggunakan eter
b. Tikus dibaringkan pada styrofoam yang dilapisi alumunium foil dan disemprot dengan alkohol
c. Tikus dibedah dengan diambil bagian kulit punggungnya
d. Punggung dengan luka dipotong sepanjang 1 cm sebagai sampel dan diletakkan pada dalam botol berisi formalin
4.7.9. Metode pembuatan preparat histopatologi
Pembuatan preparat histologi jaringan luka menurut Aziza, et.al. (2010) dapat dilakukan dengan prosedur sebagai berikut:
a) Fiksasi
a. Sediaan direndam dalam larutan Buffer Neutral Formalin (BNF) 0,1 mg/KgBB, kemudian dipotong dengan ketebalan +/- 3 mm dan potongannya dimasukkan ke dalam kaset jaringan.
b) Dehidrasi
a. Organ yang berada dalam kaset jaringan dimasukkan ke dalam gelas-gelas mesin tissue processor untuk dilakukan dehidrasi.
Dehidrasi ini dilakukan bertahap menggunakan alkohol yang konsentrasinya berbeda, dimulai dari konsentrasi 70%, 80%, 90%, 95%, alcohol absolute I dan alcohol absolute II masing-masing 2 jam. Setelah itu dilakukan proses penjernihan (clearing) memasukkan sediaan ke dalam xilol I dan II masing-masing 2 jam.
c) Perendaman dan Pencetakkan (Embedding)
a. Parafin dimasukan ke dalam cetakan sampai setengah, kemudian potongan jaringan dimasukkan, selanjutnya cetakan ditambah dengan parafin hingga penuh dan dilabel. Proses pencetakan dilakukan dengan menggunakan tissue embedding console.
Sediaan lalu dibekukan dan didinginkan sebelum dilakukan pemotongan dengan menggunakan mikrotom.
d) Pemotongan (Sectioning)
a. Jaringan dipotong dengan menggunakan rotary microtome dengan ketebalan 4-5 microm dan hasil potongan selanjutnya ditempelkan pada gelas objek, kemudian dikeringkan pada suhu ruang lalu disimpan dalam inkubator sampai dilakukan pewarnaan.
e) Pewarnaan HE
a. Pewarnaan HE merupaan pewarnaan umum untuk melihat morfologi jaringan secara umum. Pada pewarnaan ini inti yang bersifat asam diwarnai dengan Hematoksilin (asidofilik) sedangkan sitoplasma diwarnai dengan Eosin (basofilik). Penggunaan pewarnaan ini dapat memvisualisasikan secara kontras bagian inti dan sitoplasma, sehingga gambaran mikroskopis jaringan dapat diamati dengan jelas.
b. Pewarnaan HE diawali dengan proses deparafinasi dengan menggunakan xilol I, II dan III masing-masing selama 3 meit.
Kemudian dilanjutkan dengan proses rehidrasi dengan
menggunakan alcohol absolute I, II, dan III masing-masing 3 menit, alcohol 95%, 90%, 80% dan 70% secara berurutan masing- masing selama 3 menit. Sediaan dicuci dengan air kran selama 10 menit dan dilanjutkan dengan air aquades selama 5 menit. Sediaan diwarnai dengan pewarna Hematoksilin selama 1 menit, kemudian dicuci dengan air kran selama 10 menit dan air aquades selama 5 menit.
c. Setelah itu sediaan diwarnai dengan pewarna Eosin selama 5 menit dan dicuci kembali dengan air kran selama 10 menit dan air aquades selama 5 menit. Setelah sediaan diwarnai, dilakukan dehidrasi dengan alcohol 70%, 80%, 90% dan 95% masing-masing selama beberapa detik, dan dilanjutkan dengan alkohol 100% I, II, dan III masing-masing 2 menit. Setelah itu dilakukan proses Clearing dengan xilol I, II, dan III selama 3 menit dan ditutup dengan gelas penutup.
4.7.10. Penilaian kadar gula darah
Penilaian kadar gula darah pada hewan coba dilakukan setelah di induksi streptozotocin sebelum perlakuan dan setelah perlakuan pada hari ke 17.
Pemeriksaan kadar gula darah melalui pengambilan cuplikan darah dari vena di ekor tikus dengan cara memotong sedikit ujung ekornya. Tetesan darah yang pertama dibuang, tetesan darah berikutnya diperiksan dengan menggunakan glucose stick. Reagen strip pada glucose stick yang telah ditetesi darah vena dimasukkan ke alat pemeriksa kit diagnostik, kemudian hasilnya dibaca pada
layar dalam waktu kurang dari 30 detik. Nilai yang tertera pada layar adalah nilai konsentrasi gula darah dalam mg/dl.
4.7.11. Penilaian Histopatologi
Dari masing-masing kelompok dilakukan fiksasi dengan blok paraffin, kemudian dilakukan pewarnaan dengan HE, dan menilai beberapa komponen seperti proliferasi epitel dan infiltrasi sel radang yang menginfiltrasi pada lapisan kutis dan subkutis. menggunakan mikroskop dengan perbesaran 400x dalam lapang pandang dan dilakukan pengamatan secara deskriptif terkait proliferasi sel epitel dan infiltrasi sel radang pada setiap kelompok.
4.7.12. Pengukuran Kadar Serum TNF-α
Saat pembedahan, diambil sampel darah dari jantung menggunakan spuit, kemudian ditampung pada vacutainer tanpa EDTA. Sampel darah disentrifus untuk memperoleh serum, dan dilakukan pengecekan kadar menggunakan kit diagnostik Serum ELISA Mouse TNF-α. Hasil akhir plate dibaca dengan ELISA Reader 450nm.
4.7.13. Pengolahan Data
Data dikumpulkan dan diolah dengan menggunakan komputer SPSS 11.0 windows, dan dinyatakan data rerata ± simpang baku (mean ± SD). Untuk pengukuran luas penutupan luka dilakukan uji normalitas Saphiro-Wilk dan homogenitas, kemudian dilakukan uji Anova, dan selanjutnya dilakukan uji post
hoc Tamhane. Untuk pengukuran kadar gula darah dilakukan uji normalitas Saphiro-Wilk dan homogenitas, kemudian dilakukan uji Anova, dan selanjutnya dilakukan uji post hoc Bonferroni. Untuk pengukuran kadar serum sitokin TNF-α dilakukan uji normalitas Saphiro-Wilk dan homogenitas, kemudian dilakukan uji Anova, dan selanjutnya dilakukan uji post hoc Bonferroni. Uji homogenitas bertujuan untuk mengetahui varian data, dikatakan normal jika sig > 0,05.
Uji normalitas dilakukan untuk mengetahui apakah sebaran data normal atau tidak, dengan menggunakan uji Saphiro-Wilk karena besar sampel yang digunakan ≤ 50. Sebaran data dikatakan normal jika sig > 0,05. Uji Anova digunakan sebagai alat analisis untuk menguji hipotesis penelitian yang mana menilai adakah perbedaan rerata antara kelompok, adanya perbedaan bermakna apabila nilai sig <0.05. Uji Post-Hoc Tamhane dan Bonferroni digunakan untuk mengetahui perbedaan signifikan antar kelompok perlakuan. Adanya perbedaan bermakna apabila nilai sig <0.05.
4.7.14 Alur Penelitian
Gambar 4.2 Alur Penelitian
