BAB III
METODE PENELITIAN
A. RANCANGAN PENELITIAN
Penelitian ini merupakan uji klinis dengan desain quasi experimental studies dengan pendekatan pre test dan post test control group design pada kelompok intervensi dan kontrol.
B. TEMPAT DAN WAKTU PENELITIAN
Penelitian dilakukan di RSUD Dr. Moewardi Surakarta pada 23 Desember 2015 – 2 Februari 2016.
C. POPULASI PENELITIAN
Populasi target penelitian adalah penderita pneumonia. Populasi terjangkau adalah penderita pneumonia yang menjalani rawat inap di RSUD Dr. Moewardi Surakarta pada 23 Desember 2015 – 2 Februari 2016.
D. PEMILIHAN SAMPEL
Sampel penelitian adalah penderita pneumonia yang menjalani rawat inap di RSUD Dr. Moewardi Surakarta. Pengambilan sampel dilakukan dengan cara
consecutive sampling yaitu memilih subjek penelitian yang datang dan
memenuhi kriteria pemilihan, dimasukkan dalam penelitian sampai jumlah sampel yang diperlukan terpenuhi.
E. BESAR SAMPEL
Besar sampel ditentukan berdasarkan jenis penelitian analitis dengan rumus: ( Z√2PQ + Z√P1Q1+P2Q2 ) 2
n = n1 =
( P1-P2 )2 n = besar sampel
P1 = proporsi normalisasi kadar PCT dan IL-6 serum pada penderita yang menerima vitamin C 1 gram/hari = 80%
P2 = proporsi normalisasi kadar PCT dan IL-6 serum pada penderita yang menerima placebo = 20%
P = ( P1 + P2 )/2 = 0.50 Q = (1 - P) = 0.50
α = tingkat kemaknaan, bila α = 0.05 maka Zα = 1,960 ᵦ = kekuatan/power = 0.10 maka Zᵦ = 1,282
( 1,960 √ 2x0.50x0.50 + 1.282 √ 0.8x0.2 + 0.2x0.8) 2 n = n1 =
( 0.8-0.2 )2 n = n1 = 13
Besar minimal sampel yang diperlukan adalah 13x2 = 26
Toleransi jumlah sampel 10% tiap kelompok, sehingga besar total sampel yang diperlukan adalah 30 orang
F. KRITERIA INKLUSI, EKSKLUSI, DAN DISKONTINYU
1. Kriteria inklusi
a. Penderita pneumonia laki-laki dan perempuan berusia lebih dari 18 tahun. b. Pneumonia yang dirawat inap:4
Diagnosis pneumonia ditegakkan apabila didapatkan infiltrat atau air
bronchogram pada foto toraks disertai gejala berupa batuk, perubahan
karakteristik sputum atau purulen, suhu tubuh ≥380C (aksila) atau riwayat demam, dan sesak. Pemeriksaan fisik didapatkan tanda-tanda konsolidasi, suara napas bronkial, dan ronki, sedangkan hasil pemeriksaan laboratorium darah didapatkan leukosit ≥10.000 atau <4500.
- Pneumonia komunitas dengan skor PSI (pneumonia severity index) lebih dari 70
- Pneumonia komunitas dengan skor PSI kurang dari 70 tetapi memenuhi salah satu dari kriteria: frekuensi napas >30 kali per menit, PaO2/FiO2
<250 mmHg, foto toraks menunjukkan infiltrat multilobus, tekanan sistolik <90 mmHg, tekanan diastolik <60 mmHg
- Health care associated pneumonia (HCAP)
Health care associated pneumonia adalah pneumonia yang telah terjadi
sebelum masuk rumah sakit pada penderita yang memiliki salah satu dari faktor risiko yaitu pernah rawat inap di rumah sakit minimal selama dua hari dalam 90 hari terakhir sebelum infeksi pneumonia terjadi, penghuni panti jompo atau penghuni fasilitas perluasan perawatan kesehatan, perawatan di rumah dengan terapi menggunakan infus (termasuk antibiotik), menjalani hemodialisis rutin terutama pada 30 hari terakhir, perawatan luka di rumah, dan adanya anggota keluarga serumah yang memiliki riwayat terinfeksi patogen MDR (multi-drug resistant).
c. Dirawat di RSUD dr.Moewardi Surakarta d. Setuju ikut penelitian
2. Kriteria eksklusi
a. Pneumonia nosokomial b. Tuberkulosis aktif
c. Titer antibodi HIV positif (berdasarkan data dari rekam medik) d. Wanita hamil (berdasarkan data dari rekam medik)
e. Gagal ginjal kronik 3. Diskontinyu
a. Muncul efek samping terhadap vitamin C selama penelitian berlangsung. b. Penderita meninggal selama follow up
c. Mengundurkan diri
G. VARIABEL PENELITIAN
1. Variabel bebas
Vitamin C injeksi intravena 1000 mg/orang/hari 2. Variabel tergantung
- Lama rawat inap
H. DEFINISI OPERASIONAL VARIABEL PENELITIAN
1. Vitamin C
Asam askorbat merupakan zat aktif vitamin C yang memiliki efek antioksidan dan antiinflamasi.Vitamin C diberikan secara intravena dengan dosis 1000 mg yang diencerkan dalam 100 mL NaCl 0,9% , diberikan dengan kecepatan maksimal 0,5 g/ menit, dan diberikan sekali sehari. Vitamin C diberikan sampai tercapai perbaikan klinis. Plasebo berupa cairan NaCl 0,9 % sebanyak 100 mL intravena. Skala data berupa skala nominal, dengan skala ukur 1000 mg/orang/hari.
2. Prokalsitonin
Prokalsitonin merupakan prekursor hormon kalsitonin yang diproduksi oleh sel C-tiroid, disekresikan sebagai respons terhadap stimulasi inflamasi terutama bakterial. Pengukuran kadar serum PCT dilakukan di laboratorium Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret Surakarta (FK UNS) dengan metode enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Skala data berupa skala numerik (rasio), dengan skala ukur nanogram/mililiter (ng/ml).
3. Lama rawat inap
Subjek penelitian dirawat inap sampai tercapai perbaikan klinis yang dinilai berdasarkan kriteria klinis stabil menurut ATS/IDSA (2007) yaitu tanda vital stabil dalam waktu 24 jam (suhu tubuh aksiler < 37,8oC, laju pernapasan ≤ 24 kali per menit, denyut jantung ≤ 100 kali per menit, tekanan darah sitolik ≥ 90 mmHg) dan SpO2 ≥ 90% atau tekanan PaO2 ≥ 60 mmHg saat bernapas dengan oksigen ruangan, mampu mempertahankan intake oral, dan status mental normal. Dikatakan perbaikan jika kriteria di atas terpenuhi semua (tujuh kriteria) atau minimal satu kriteria tidak terpenuhi. Sebagian besar penderita pneumonia menunjukkan perbaikan klinis dalam 72 jam pertama setelah pemberian
antibiotik awal.4 Lama rawat inap merupakan lama hari penderita pneumonia menjalani rawat inap sampai tercapai kondisi klinis stabil dan layak untuk dipulangkan, dihitung dengan cara lama rawat inap ditotal dalam hitungan jam kemudian dibagi 24 jam, apabila sisanya <12 jam dibulatkan ke bawah sedangkan ≥12 jam dibulatkan ke atas. Penghitungan lama rawat inap dimulai saat penderita pneumonia dinyatakan sebagai subjek penelitian. Skala data berupa skala numerik (rasio), dengan skala ukur dalam hari.
4. Plasebo
Plasebo adalah zat atau obat tidak aktif yang tampak sama dan diberikan dengan cara sama seperti obat aktif atau pengobatan yang diuji. Penelitian ini menggunakan NaCl 0,9% 100 ml sebagai plasebo, merupakan cairan infus tidak berwarna, jernih, steril, dan nonpirogenik. Osmolaritas sebesar 308 mOsmol/L, Na+ 154 mOsmol/L, dan Cl- 154 mOsmol/L. Dapat digunakan sebagai pelarut obat parenteral, pengganti defisit cairan ekstraselular dan elektrolit, serta irigasi steril. Efek yang tidak diinginkan dapat berupa demam, infeksi pada tempat suntikan, trombosis vena atau flebitis. Pemberian berlebihan dapat menyebabkan hipernatremia, hipokalemia, dan asidosis. Plasebo diberikan sampai tercapai perbaikan klinis.
I. INSTRUMEN PENELITIAN
Human Procalcitonin ELISA Kit nomor katalog E-EL-H1492 dari
eBioscience (range deteksi 0,03125 – 2 ng/ml) Alat dan bahan:
- Microwell plate ELISA (8x12 strip)
- Standar referensi 2 vial
- Diluent standar referensi dan sampel 1 vial (20 ml) - Biotinylated konsentrat pendeteksi Ab 1 vial (120 µl) - Biotinylated diluent pendeteksi Ab 1 vial (10 ml)
- Konjugat Avidin-Horseradish peroxidase (HRP) konsentrat 1 vial isi 120 µl
- Konjugat HRP diluent 1 vial (10 ml)
- Konsentrat buffer pencuci (25 x) 1 vial (30 ml)
- Reagen substrat 1 vial (10 ml)
- Solution stop 1 vial (10 ml)
- Plate sealer 5 buah
J. PROSEDUR PENGUMPULAN DATA
1. Penderita yang datang ke RSUD Dr. Moewardi Surakarta yang telah terdiagnosis pneumonia komunitas atau HCAP sebagai subjek diberikan penjelasan tentang tujuan penelitian.
2. Subjek yang bersedia ikut dalam penelitian diminta untuk menandatangani lembar persetujuan (informed consent).
3. Subjek yang memenuhi kriteria inklusi diberikan edukasi, dicatat identitas, riwayat merokok, penyakit lain yang diderita, dan lain-lain pada formulir yang disediakan. Data awal subjek diperoleh dari anamnesis, pemeriksaan fisik, laboratorium darah, dan foto toraks. Dilakukan penilaian jumlah skor PSI berdasarkan PORT untuk penderita pneumonia komunitas, serta diambil darah vena untuk memeriksa kadar serum PCT (lampiran 3). 4. Subjek dibagi menjadi dua kelompok. Kelompok pertama mendapat
vitamin C 1 gram/hari, diencerkan dalam NaCl 0,9 % 100 mL, diberikan secara intravena (pagi hari sesudah makan) selama dirawat sampai tercapai perbaikan klinis. Kelompok kedua mendapat plasebo berupa NaCl 0,9 % 100 mL secara intravena sekali sehari sampai tercapai perbaikan klinis. 5. Antibiotik dan terapi suportif lainnya diberikan sesuai terapi empirik atau
definitif apabila sudah didapatkan data kultur.
6. Penderita kemudian di follow-up sampai kondisi klinis stabil. Kondisi klinis stabil dapat dicapai antara hari ke-3 sampai ke-6 yang dinilai berdasarkan kriteria: tanda vital stabil dalam waktu 24 jam (suhu tubuh
<37,80C, laju pernapasan ≤24 kali per menit, denyut jantung ≤100 kali per menit, tekanan darah sistolik ≥90 mmHg, SpO2 ≥90% atau PaO2 ≥60 mmHg pada oksigen ruang) , mampu mempertahankan intake oral, dan status mental normal.94
7. Setelah tercapai kondisi klinis stabil, penderita diambil lagi darah vena untuk pemeriksaan kadar PCT dan selanjutnya dipulangkan. Respons terapi setelah pemberian vitamin C diukur berdasarkan penurunan kadar serum PCT dan makin pendeknya lama rawat inap.
K. TEKNIK PEMERIKSAAN
1. Penilaian skor PSI
Subjek dicatat identitas, dilakukan anamnesis, pemeriksaan fisik, pemeriksaan darah rutin, kimia darah, elektrolit darah, analisis gas darah, dan foto toraks, kemudian untuk pneumonia komunitas dihitung skor PSI berdasarkan PORT.
2. Pemeriksaan kadar serum PCT
Media yang diteliti adalah darah vena yang pengambilannya dilakukan dua kali yaitu pada saat penderita pneumonia dinyatakan sebagai subjek penelitian dan saat tercapai kondisi klinis stabil. Pengambilan darah menggunakan tabung SST (serum separator tube) yang pertama dilakukan ≤ 2 jam setelah penderita masuk IGD (sebelum diberikan antibiotik) dengan volume darah kurang lebih 3 cc. Darah kemudian segera dikirim ke laboratorium Biomedik FK UNS apabila pengambilannya dilakukan pada saat jam kerja (hari Senin sampai Jum’at jam 08.00-15.00 WIB) untuk disentrifus dan diambil serumnya untuk diperiksa. Apabila pengambilan darah dilakukan di luar jam kerja laboratorium Biomedik FK UNS, maka darah dalam tabung SST disentrifus terlebih dahulu di laboratorium cito Patologi Klinik RS Dr. Moewardi dan disimpan dalam freezer bersuhu -60C sampai saatnya
sampel dikirim ke laboratorium Biomedik FK UNS. Pengukuran kadar PCT menggunakan teknik ELISA dengan satuan ng/ml.
Prosedur pemeriksaan PCT :
- Ditambahkan 100 µL larutan standar, kontrol, atau sampel pada tiap
plate. Plate yang kosong ditambahkan dengan reference standard dan sample diluent. Larutan kemudian ditambahkan ke bagian dasar microwell plate ELISA, hindarkan menyentuh dinding dan bergelembung kemudian campur perlahan. Tutup plate menggunakan
sealer, kemudian inkubasi selama 90 menit pada suhu 370C.
- Cairan dari masing-masing lempeng dibuang tetapi jangan dicuci. Segera ditambahkan 100 µL biotinylated detection antibody pada tiap
plate. Tutup plate dengan sealer, ditekan perlahan untuk memastikan
pencampurannya. Inkubasi selama satu jam pada suhu 370C.
- Pencucian: tiap plate diaspirasi dan dicuci, diulang sampai tiga kali. Kemudian isi tiap plate dengan buffer pencuci (sekitar 350 µL). Buang cairan sampai habis pada tiap langkah. Setelah pencucian terakhir, buang buffer pencuci yang tersisa dengan melakukan aspirasi atau penuangan. Balikkan plate dan tepuk perlahan pada kertas absorben. - Ditambahkan 100 µL konjugat Avidin-Horseradish peroxidase (HRP)
ke tiap plate. Tutup dengan sealer, inkubasi selama 30 menit pada suhu 370C.
- Prosedur pencucian diulang sebanyak lima kali.
- Ditambahkan 90 µL solusi substrat pada tiap plate. Tutup dengan sealer yang baru, inkubasi selama 15 menit pada suhu 370C. Hindarkan dari cahaya. Reaksi yang terjadi dapat membutuhkan waktu singkat atau lama tergantung perubahan warna, tetapi tidak lebih dari 30 menit. Saat terjadi perubahan warna yang terlihat nyata pada plate standar, hentikan reaksi.
- Ditambahkan 50 µL stop solution pada tiap plate, kemudian warna akan segera berubah kuning.
- Pengukuran optical density (OD): Tentukan OD dari tiap plate menggunakan micro-plate reader yang disetel pada nilai 450 nm. 3. Lama rawat inap
Lama rawat inap merupakan lama hari penderita pneumonia menjalani rawat inap di RSDM Surakarta, dihitung dengan cara lama rawat inap ditotal dalam hitungan jam kemudian dibagi 24 jam, apabila sisanya <12 jam dibulatkan ke bawah sedangkan ≥12 jam dibulatkan ke atas. Penghitungan lama rawat inap dimulai saat penderita pneumonia dinyatakan sebagai subjek penelitian.
L. ETIKA PENELITIAN
Penulis mengajukan persetujuan penelitian ke Panitia Kelaikan Etik Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret Surakarta sebelum dilakukan penelitian. Setiap subjek penelitian diberikan penjelasan yang benar dan terperinci tentang tujuan dan manfaat penelitian sebelum dilakukan prosedur penelitian, setelah subjek mengerti dan setuju mengikuti penelitian maka diminta menandatangani lembar persetujuan dan isian data penderita.
M. ANALISIS DATA
Analisis data dilakukan dengan memakai SPSS 17 for Windows. 1. Uji Beda
Uji beda adalah uji untuk melihat perbedaan sampel perlakuan dengan pemberian vitamin C dan sampel kontrol dengan pemberian placebo. Penelitian ini menggunakan sampel berpasangan dengan uji parameter t test.95
Batas kemaknaan:
- nilai p > 0,05: tidak bermakna - nilai p ≤ 0,05: bermakna
2. Korelasi
Korelasi merupakan suatu metode untuk mencari hubungan timbal balik antara dua variabel. Hubungan antara variabel numerik dan numerik akan dilakukan dengan uji korelasi Pearson, tetapi apabila syarat tidak terpenuhi maka menggunakan uji korelasi Spearman. Hubungan dua variabel dinyatakan positif apabila satu variabel ditingkatkan maka akan meningkatkan variabel yang lain dan sebaliknya apabila satu variabel diturunkan maka akan menurunkan variabel yang lain.
Hubungan dua variabel atau lebih dinyatakan negatif apabila nilai satu variabel dinaikkan maka akan menurunkan variabel yang lain dan sebaliknya apabila satu variabel diturunkan maka akan menaikkan variabel yang lain.
Batas kemaknaan:
- nilai p ≤ 0,01 : terdapat korelasi sangat bermakna antara dua variabel yang diuji.
- nilai p ≤ 0,05 : terdapat korelasi yang bermakna antara dua variabel yang diuji.
- nilai p > 0,05: tidak terdapat korelasi yang bermakna antara dua variabel yang diuji.
N. ALUR PENELITIAN
Gambar 16. Alur penelitian pengaruh vitamin C terhadap kadar serum PCT dan lama rawat inap penderita pneumonia.
Anamnesis , pemeriksaan fisik, laboratorium darah,
foto toraks Penderita datang di IGD
Pneumonia (komunitas dan
HCAP) Memenuhi kriteria
inklusi
Hitung skor PSI (untuk pneumonia komunitas)
Penjelasan, penawaran persetujuan (informed consent)
Setuju ikut penelitian Tidak setuju ikut
penelitian
Eksklusi Pemeriksaan serum PCT
Penilaian klinis dan laboratorium
Antibiotik/terapi standar
Placebo (NaCl 0,9% 100 mL sampai tercapai perbaikan
klinis) Vitamin C intravena 1000 mg/orang/hari
dalam NaCl 0,9% 100 mL (sampai tercapai perbaikan klinis)
Analisis statistik
Kondisi klinis stabil pemeriksaan serum PCT
dipulangkan Kondisi klinis stabil
pemeriksaan serum PCT dipulangkan
