LAPORAN PENELITAN KECIL PROYEK BIOLOGI SEL MOLEKULER (BI-3103)
PENGARUH VARIASI KONSENTRASI CdCl2 TERHADAP INDEKS
MITOSIS DAN INDEKS ABRASI AKAR BAWANG MERAH (Allium cepa .Linn)
Tanggal penelitian : 13 November 2015 Tanggal pengumpulan : 3 Desember 2015
Disusun Oleh : Ahmad Ardiansyah 10613007 Wyona Pramono 10613008 Fania Feby R 10613033 Meidiana Ebtayani 10613055 Yukiko P.H 10613064 Asisten : Faniar S 10612017 Meutia Hakim 10612006
PROGRAM STUDI BIOLOGI
SEKOLAH ILMU DAN TEKNOLOGI HAYATI INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG
BAB I PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Pada abad ke -21 ini sektor perindustrian semakin berkembang besat dari skala kecil seperti industri rumah tangga hingga industri perusahaan besar.Perkembangan industri yang cenderung pesat ini tentunya memiliki dampak negatif dan positif.Dampak dari adanya perkembangan industri yang pesat ini antara lain adalah meningkatnya limbah kimia dan biologi sehingga akan mencemari lingkungan dan menyebabkan ketidakseimbangan ekosistem.Buangan atau limbah yang mengandung logam berat yang merupakan toksikan yang mempunyai daya racun tinggi.
Pencemaran logam berat terhadap lingkungan merupakan suatu proses yang erat hubungannya dengan penggunaan logam tersebut oleh manusia untuk memenuhi kebutuhan hidup.Suatu proses produksi dalam industri yang memerlukan suhu tinggi seperti pertambangan, batubara, pembangkit tenaga listrik dengan energi minyak, banyak menimbulkan pencemaran terutama pada logam-logam yang larut dalam air (dalam bentuk ion), seperti tembaga (Cu), arsen(As), kadmium (Cd), timah hitam (Pb) dan merkuri(Hg)(Srinning,1998)
Limbah dari bahan-bahan kimia dan logam berat berbahaya tersebut memunculkan efek genotoksik dan mutagenik jika terpapar dan terakumulasi dalam makhluk hidup.Hal tersebut dapat menimbulkan beberapa masalah serius yang dapat memengaruhi generasi mendatang karena efek yang ditimbulkan pada organisme karena dapat diwariskan secara genetik (Leme & Marin-Morales, 2009).
Maka pada praktikum ini kami akan melakukan percobaan sederhana mengenai pengaruh dari pemberian senyawa logam berat yaitu Cd terhadap mitosis sel bawang merah (Allium cepa).Penggunaan bawang merah sebagai indikator genotoksik pada praktikum kali ini adalah karena sensitivitas yang tinggi dari tumbuhan ini pada
berbagai zat yang memengaruhi perubahan struktur kromosom serta pertumbuhan dari akar tumbuhan ini sangat cepat dan akan mengalami kontak langsung dengan larutan uji sehingga bisa diprediksikan kerusakan pada DNA model organisme eukariotik (Solange dan Haywood,2012).
1.2 Tujuan
Tujuan pada penelitian kali ini adalah :
1. Menentukan pengaruh berbagai konsentrasi Cd terhadap indeks mitosis sel akar bawang merah (Allium cepa Linn.)
2. Menentukan pengaruh berbagai konsentrasi Cd terhadap indeks abrasi sel akar bawang merah (Allium cepa Linn.)
1.3 Hipotesis
Semakin pekat konsentrasi Cd,maka indeks mitosis akan semakin menurun dan indeks abrasinya akan semakin meningkat secara signifikan.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Siklus sel dan tahapan
Siklus sel merupakan suatu proses berulang dalam sel makhluk hidup dan berfungsi dalam penerusan materi genetik yang identik ke sel anakan. Fungsi tersebut sangat berpengaruh dalam pembelahan sel. Pembelahan sel sendiri merupakan salah bagian integral dari siklus sel. Sel yang sedang membelah akan menduplikasi DNA, mengalokasikan kedua salinan ke dua ujung sel yang bersebrangan sehingga menjadi dua sel anakan. Mitosis merupakan salah satu bagian dari siklus sel dan memiliki beberapa tahap yaitu, profase, prometafase, metafase, anafase, dan telofase. Pembelahan sitoplasma (sitokinesis) biasanya segera mengikuti mitosis.
Pada siklus sel, terdapat tahap interfase yaitu fase G1. fase G2, dan Sintesis DNA. Selama tahap interfase, selaput nukleus masih membatasi nukleus, mengandung satu atau lebih nukleolus, dan kromosom masih belum terkondensasi. Pada tahap profase, serat-serat kromatin terkumpar lebih rapat dan terkondensasi menjadi kromosom. Nukleolus lenyap, setiap kromosom terduplikasi tampak sebagai dua kromatid saudara yang identik, Selain itu, sentrosom-sentrosom bergerak saling menjauhi. Pada tahap prometafase, selaput nukleus terfragmentasi, kromosom enjadi semakin terkondensasi.
Metafase merupakan tahap mitosis yang paling lama. Pada tahap ini, kromosom berjejer pada lempeng metafase. Tahap anafase merupakan tahap mitosis terpendek. Kedua kromosom anakan yang terbebas mulai bergerak menuju ujung-ujung sel yang berlawanan arah. Pada tahap telofase, terbentuk dua nukleus anakan di dalam sel, muncul selaput nukleus dari fragmen-fragmen selaput nukleus sel induk dan bagian-bagian lain dari sistem endomembrane. Nukleolus muncul kembali, kromosom menjadi kurang terdispensi. Pada tahap sitokinesis, pembelahan sitoplasma biasanya sudah berlangsung cukup jauh pada akhir telofase, sehingga kedua sel anakan muncul.(Campbell,2008)
2.2 Mutasi
Mutasi adalah perubahan materi genetik (gen atau kromosom) suatu sel yang diwariskan kepada keturunannya. Mutasi dapat disebabkan oleh kesalahan replikasi materi genetika selama pembelahan sel oleh radiasi, bahan kimia (mutagen), atau virus, atau dapat terjadi selama proses meiosis. Terdapat dua jenis mutasi, yaitu mutasi gen dan mutasi kromosom.Mutasi gen adalah perubahan kimiawi pada satu atau beberapa pasangan basa dalam satu gen tunggal yang menyebabkan perubahan sifat individu tanpa perubahan jumlah dan susunan kromosomnya,jika mutasi gen terjadi dalam gamet atau sel yang menghasilkan gamet,perubahan itu bisa diteruskan ke keturunan dan generasi berikutya sedangkan mutasi kromosom adalah perubahan yang terjadi pada kromosom yang disertai dengan perubahan struktur dan jumlah kromosom.
Mutasi gen dapat terjadi melalui berbagai cara diantaranya penggantian satu nukleotida dengan pasangannya didalam untaian DNA kompleter atau penambahan maupun pengurangan satu atau lebih pasangan nukleotida pada suatu gen saat replikasi DNA sedangkan mutasi kromosom dapat menyebabkan kerusakan seperti translokasi,duplikasi,delesi dan inversi ataupun ditandai dengan perubahan jumlah kromosom dalam individual dalam genom seperti aneuploid dan euploid (Campbell,2008)
2.3 Fungsi larutan
Pada penelitian kali ini juga digunakan beberapa macam larutan,yaitu larutan Carnoy yang terdiri dari etanol 90-95 % : asam asetat glasial = 3:1 untuk memfiksasi sel agar kita dapat mengamati fase mitosis pada sel bawang (Solange dan Haywood,2012) .Kemudian ujung akar dipindahkan di larutan HCL untuk melunakan dinding sel (Rank dan Nielsen,1997) .Lalu ditambakan asetokarmin sebagai pewarna.Prinsip kerja bahwa asetokarmin dapat mewarnai kromosom adalah hidrolisis asam sehingga kromosom bermuatan negatif dan asetokarmin tetap bermuatan positif sehingga kromosom terwarnai (Chu,1946)
2.4 Mekanisme masuknya Cd dalam sel
Cadmium (Cd) merupakan logam non-redox namun dapat menyebabkan pembentukan ROS (reactive oxygen species) seperti radikal superoksida, singlet oxygen, hidrogen peroksida, dan radikal hidroksil. Produksi ROS yang berlebihan dapat menyebabkan stres oksidatif pada tanaman. Stres Cd terjadi karena keracunan konsentrasi Cd tinggi di akar sehingga menyebabkan kematian terprogram pada sel.Cd menghambat pembelahan sel dan pertumbuhan ekspansi sel melalui efek tak langsung ataupun langsung dari metabolisme.Cd menyebabkan kelainan pada mitotis dalam pergerakan kromosom karena mengganggu calmodulin di mitotic spindle dan memengaruhi pengambilan Ca2+ (Seregin,2001)
Ion Cd2+ dapat memasuki sel melalui saluran Ca2+ pada membran plasma (Rivetta, et. al., 1997) karena keduanya memiliki jari-jari atom yang mirip (Wen, et. al., 1989) .Logam Cd dapat masuk ke sel akar bawang melalui transpor pasif namun, pengambilan secara aktif juga dapat terjadi. Transpor aktif memperlihatkan hubungan kompetisi dengan jenis logam lainnya untuk transpor membran dan ion channel (Seregin dan Ivanov,2001). Pengambilan Cd2+ yang berlebihan ke dalam sel akan menyebabkan penurunan kadar Ca2+ dalam sel sehingga menyebabkan rusaknya nukleolus (Wang, 2014) dan gagalnya regulasi kalsium secara intraseluler (Xu, 1985).
BAB III METODOLOGI 3.1 Alat dan Bahan
Alat dan bahan yang akan digunakan dalam praktikum kali ini terdapat pada tabel 3.1
3.2 Cara kerja
Umbi bawang merah dipilih yang masih baik dan ukurannya agak besar.Bawang dicuci dengan air yang mengalir dan diletakkan pada gelas kultur (botol vial) yang sesuai.Setelah itu,bawang didiamkan atas gelas kultur yang berisi air dan dasarnya harus terkena agar akar dapat tumbuh.Setelah akar mulai tumbuh,bawang dipindahkan ke dalam CdCl2 selama 24 jam
Setelah didiamkan selama 24 jam bagian ujung akar dipotong dengan pisau scalpel pada pagi hari pukul 04.50-05.00 WIB.Ujung akar difiksasi dengan menggunakan larutan Carnoy pada suhu ruang selama 10-15 menit.Lalu ujung akar dipindahkan ke dalam gelas vial yang berisi larutan campuran HCl : etanol 90-95 % = 1:1-2.Ujung akar disimpan selama 5 menit pada suhu ruang.Kemudian ujung akar dicuci dengan menggunakan air mengalir selama 15 menit.
Alat Bahan Botol vial Pisau scalpel Kaca objek Jarum jara Mikroskop Bunsen Bawang merah Air CdCl2 Larutan Carnoy Asetokarmin Asam asetat 45 % 1 N HCL Tabel 3.1 Alat dan Bahan
Ujung akar dipindahkan ke atas kaca objek.Setelah itu ditetesi dengan beberapa tetes asetokarmin dan dipanaskan selama beberapa saat tetapi tidak sampai mengering dan dicuci menggunakan asam asetat 45 %.Kaca objek kemudian ditutup dengan kaca penutup.Kaca tutup diketuk-ketuk dengan menggunakan ujung jarum jara hingga ujung akar menjadi hancur .Setelah itu ujung akar dapat diamati di bawah mikroskop.Pengamatan indeks mitosis dilakukan dengan menghitung jumlah sel yang sedang bermitosis 1000 sel.Aberasi kromosom diamati dan dicatat jenis-jenis aberasi yang terjadi.
BAB IV PEMBAHASAN
Berikut grafik indeks mitosis dan indeks aberasi pada gambar 3.1
Gambar 3.1 Indeks mitosis dan indeks aberasi
Pada gambar 3.1 dan gambar 3.2 hasil menunjukkan terjadi penurunan indeks mitosis seiring dengan kenaikan konsentrasi, sementara indeks aberasi menunjukkan kenaikan. Untuk mengetahui apakah rata-rata indeks antar konsentrasi berbeda signifikan dilakukan uji statistik ANOVA terhadap kedua indeks. Ternyata rata-rata antar indeks mitosis pada masing-masing konsentrasi berbeda secara signifikan (df : 3,44 ; p<0,05) sedangkan indeks aberasi juga berbeda secara signifikan (df : 3,44 ; p<0,05). Secara umum, pengaruh Cd2+ pada mitosis yaitu mengganggu konformasi mikrotubul sehingga benang spindel terganggu dan menghambat proses mitosis itu sendiri. Untuk gangguan mikrotubul yaitu dengan cara Cd2+ berkompetisi dengan Ca2+ untuk berikatan dengan calmodulin (CaM), termasuk CaM yang terdapat di spindel mitotik dan terlibat dalam polimerisasi dan depolimerisasi dari mikrotubul (Chueng ,1980; 1983). Sementara itu, mekanisme Cd2+ menghambat siklus sel untuk memasuki
tahap mitosis dengan cara mengganggu siklin B1 mRNA. Siklin B1 berperan seperti ‘tombol’ yang menentukan sel tersebut masuk ke tahap mitosis atau tidak (Wang,2014). Penghambatan siklin B1 oleh ion Cd2+ akan menyebabkan sel tidak bisa masuk ke tahap mitosis sehingga persentase sel yang berada dalam tahap mitosis menurun. Sementara itu, gangguan pada proses polimerisasi dan depolimerisasi mengakibatkan gangguan pada benang spindel.
Cadmium menyebabkan abnormalitas pada sel-sel yang sedang bermitosis. Abnormalitas-abnormalitas yang teramati adalah chromosome bridge di anafase, chromosome stickiness, dan micronuclei Apabila dibandingkan perlakuan konsentrasi 10 μM dengan 100 μM, maka chromosome bridge yang teramati lebih banyak terdapat pada konsentrasi 100 μM. Pada konsentrasi 10 μM biasanya hanya ada satu bridge, namun pada konsentrasi 100 μM bisa terdapat lebih dari satu bridge pada kromosom dari sel yang sedang bermitosis. Sedangkan konsentrasi 50 μM tidak berbeda jauh dengan konsentrasi 10 μM. Chromosome bridges berasal dari kromosom disentrik, yang terjadi karena proses perbaikan yang salah dari DNA yang patah. Selain itu chromosome bridges juga disebabkan oleh penggabungan ujung telomere dan kegagalan pemisahan sister chromatids yang disebabkan kegagalan dekatenasi (Wang, et al., 2014).
Chromosome stickiness banyak ditemukan pada perlakuan dengan konsentrasi 50 μM dan lebih banyak lagi pada perlakuan konsentrasi 100 μM. Chromosome stickiness atau kelengketan kromosom mengindikasikan tingkat toksisitas yang tinggi (Wang, et al., 2014). Chromosome stickiness ditandai dengan kromosom yang berkumpul pada tahap mitosis manapun (RAO,1990). Fenomena choromosome stickiness sudah sering ditemukan di beberapa spesies tumbuhan dan disebabkan oleh faktor genetik dan lingkungan (Kumar, et al., 2013). Walaupun begitu, belum dapat diketahui secara pasti apa yang menjadi mekanisme penyebab chromosome stickiness. Diduga, penyebabnya adalah kegagalan atau kesalahan fungsi kerja dari protein nonhiston (Gaulden, 1987).
Di semua perlakuan ditemukan micronuclei dengan jumlah yang tidak terlalu berbeda. Pada penelitian yang dilakukan Wang, et al. (2014), micronuclei bertambah sering bertambahnya waktu perlakuan dan bukan besarnya konsentrasi cadmium. Micronuclei adalah salah satu biomarker dalam menentukan genotoksisitas dan ketidakstabilan kromosom (Fenech, 2000). Micronuclei dapat berasal dari kromosom asentrik yang tertinggal pada saat anafase. Hal tersebut dikarenakan perbaikan yang salah atau tidak sama sekali dari DNA yang patah. Kromosom yang tertinggal tersebut menjadi gagal masuk ke dalam daughter nucleus pada saat akhir dari telofase (Fenech, 2011). Pada saat micronuclei terbentuk, terjadi eliminasi beberapa materi genetik dan kompaksi beberapa materi genetik lainnya di dalam micronuclei (Fernandes, et al., 2007).
Selain mempengaruhi aktivitas mitotik sel, Cadmium juga memicu kerusakan sitoskeleton, menggangu proliferasi sel (Rosas et al 1984) , transport elektron mitokondria (Miller et.al,1973), menggangu aktivitas enzim (Wiegel & Jager 1980), menginhibisi penyerapan nutrisi tambahan berupa Ca dan Zn (Root et al, 1975)
Gambar 3.3 Aberasi kromosom (dari kiri) C-mitosis,choromosomal bridge,chromosomal stickiness (Dokumentasi pribadi,2015)
BAB IV KESIMPULAN
Kesimpulan pada penelitian kali ini adalah :
1. Semakin pekat konsentrasi Cd,maka indeks mitosis akan semakin menurun 2. Semakin pekat konsentrasi Cd,maka indeks abrasinya akan semakin meningkat
DAFTAR PUSTAKA
Chu.J .1946. Reaction of Nucleic Acid to Aceto-carmine.Nature ,157 : 513-514
Chueng,W.Y.(ed.) : Calcium and Cell Function.Academic Press,London – New York.1980-1983
Fenech, M. 2000. Mathematical model of the in vitro micronucleus assay predicts false negative results if micronuclei are not scored specifically in binucleated cells or cells that have completed one nuclear division. 15: 329-336.
Fenech, M.2011. “Molecular mechanisms of micronucleus, nucleoplasmic bridge and nuclear bud formation in mammalian and human cells.” Mutagenesis 26: 125-132.
Gaulden, ME. 1987. Hypothesis: some mutagens directly alter specific chromosomal proteins (DNA topoisomerase II and peripheral proteins) to produce chromosome stickiness, which causes chromosome aberrations. Mutagenesis, v.2, p.357-365.
Leme, Daniela Morais, Marin-Morales, Maria Aparecida. 2009. “Allium cepa test in environmental monitoring: A review on its application”. Mutation Research 682(2009): 71-81.
Miller, R.J., Bittel, J.E., Koeppe, D.E. : The Effect of cadmium on Electron and Energy Transfer Reactions in Corn Mitochondria. –Physiol Plant 28 : 166 – 171, 1973
Pawan Kumar, R. A. N. A., Kumar, P., & Singhal, V. K. 2013. Spindle irregularities, chromatin transfer, and chromatin stickiness during male meiosis in Anemone tetrasepala (Ranunculaceae). Turkish Journal of Botany, 37, 167-176.
Rank, J.; Nielsen, M.H. 1997.Allium cepa anaphase-telophase root tip chromosome aberration assay on N-methyl-N-nitrosourea, maleic hydrazide, sodium azide, and ethyl methanesulfonate. Mutat. Res.Genet. Toxicol. Environ. Mutagen., 390, 121–127.
RAO, P.N.1990. Behavior of a sticky desynaptic mutant in pearl millet. Genetica, v.81, p.221-227.
Rivetta,A.,Negrini,N.,Cocucci,M.1997.: Involvement of Ca2+ calmodulin in Cd toxicity during the early phases of radish (Raphanus sativus .L) seed germination.Plant Cell Environ 20 :600-608
Root, R.A., Miller, R.J., Koeppe, D.E.1975.Uptake of Cadmium-Its Toxicity an Effect on the Iron to Zinc Ratio in Hydro-ponically Grown Cor.-J Environ. Qual. 4:473-476.
Rosas. J.. Cabajal. M.E., Gomez-Arroyo. S., Belmont, R., Accummulation on Water hyacinth (Eichornia crassipes). Environ. Pollut. 33:386-395.1984
Seregin, I. V., Ivanov, V. B. 2001. “Phusiological Aspects of Cadmium and Lead Toxic Effects on Higher Plants”. Russian Journal of Plant Physiolgy 48(4): 523-544.
Solange Bosio Tedesco and Haywood Dail Laughinghouse IV .2012. Bioindicator of Genotoxicity: The Allium cepa Test, Environmental Contamination, Dr. Jatin Srivastava (Ed.), ISBN: 978-953-51-0120-8, InTech.Diakses dari http://www.intechopen.com/books/environmental-contamination/bioindicator-of genotoxicitythe-allium-cepa-test pada Sabtu 5 September 2015 pukul 11 : 15 WIB SRINNING PENI, Dra. 1998.Pencemaran Logam Berat ke Lingkungan, Sekolah Tinggi Teknologi Nasional, Yogyakarta, 38 – 52,
Wang, Q. L., et al. "Effects of cadmium on root growth, cell division and micronuclei formation in root tip cells of Allium cepa var. agrogarum L."PHYTON-INTERNATIONAL JOURNAL OF EXPERIMENTAL BOTANY 83 (2014): 291-298.
Wen.Y.Y.1989.Calcium and calmodulin.Beijing : Chemical Industry Publishing House
Wiegel, H.J., Jager. H.J.1980. Subcellular Distribution and Chemical Form of Cadmium in Bean Plants. –Physiol Plant 65 : 480 – 482,
