KLONING DAN SEQUENCING GEN COAT PROTEIN PEPPER
VEIN YELLOW VIRUS PENYEBAB PENYAKIT DAUN
MERAH PADA TANAMAN WORTEL
DAYANG DIANI PUTRI
DEPARTEMEN PROTEKSI TANAMAN
FAKULTAS PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
3
ABSTRAK
DAYANG DIANI PUTRI. Kloning dan Sequencing Gen Coat Protein
Pepper vein yellow virus Penyebab Penyakit Daun Merah pada Tanaman Wortel.
Dibimbing oleh GEDE SUASTIKA.
Pepper vein yellow virus (PeVYV) merupakan virus dengan kisaran inang
terbatas pada cabai, namun untuk pertama kalinya dilaporkan menyebabkan penyakit daun merah (RLD) pada tanaman wortel di Jawa Barat. Gejala penyakit ini mirip dengan gejala infeksi Carrot motley dwarf yang diinduksi oleh spesies
Polerovirus, yaitu Carrot red leaf virus. Tujuan dari penelitian ini adalah (1)
untuk mengkloning gen coat protein (CP) virus ke dalam vektor plasmid untuk mempersiapkan antigen yang akan digunakan untuk produksi antiserum dan (2) untuk mengkonfirmasi bahwa virus yang terisolasi tersebut adalah PeVYV. Gen CP, berhasil disisipkan ke plasmid vektor pQE-30, sehingga dihasilkan fragmen DNA pQE-CP PeVYV. Kompeten sel Escherichia coli M15 (pREP) hasil transformasi berhasil ditumbuhkan pada media selektif yang mengandung ampicilin dan kanamicyn. Plasmid yang terdeteksi membawa gen CP berhasil diisolasi dari beberapa koloni bakteri yang tumbuh baik dengan teknik
polymerase chain reaction maupun dengan penyisipan pada situs pemotongan BamHI dan PstI. Kloning gen CP ke dalam plasmid vektor telah berhasil
dilakukan. Gen CP berhasil teramplifikasi hingga diperoleh panjang fragmen sebesar 650 bp, sesuai dengan gen CP Polerovirus yang telah dilaporkan di Genebank. Berdasarkan hasil analisis menggunakan Multiple alignment dengan software Crustal W, diperoleh tingkat homologi gen CP sebesar 98% dengan spesies PeVYV yang menginfeksi tanaman cabai di Bali. Hasil ini mengkonfirmasi bahwa RLD yang menginfeksi tanaman wortel berasosiasi dengan infeksi PeVYV, seperti laporan sebelumnya.
Kata kunci : Chimera, Escherichia coli M15 (pREP4), plasmid rekombinan pQE-CP PeVYV.
5
ABSTRACT
DAYANG DIANI PUTRI. Cloning and Sequencing of Coat Protein Gene of Pepper vein yellow virus causing Red Leaf Disease on Carrots. Superviced by GEDE SUASTIKA.
Pepper vein yellow virus (PeVYV), a virus having host range restricted on
chili pepper, has been reported for the first time to cause red leaf disease (RLD) on carrot in West Java. The disease symptom was resemble to those of Carrot
motley dwarf induced by other Polerovirus species, Carrot red leaf virus. The
objectives of this research were (1) to clone coat protein (CP) gene of the virus into a plasmid vector in order to prepare antigen used for antiserum production and (2) to confirm that the isolated virus was PeVYV. The CP gene, amplified from the virus genome isolated from RLD showing carrot sample, was successfully inserted to the 30 plasmid vector, resulting a chimera of pQE-CP PeVYV. Escherichia coli M15 (pREP) competent cells transformed with the chimera could grow on selected media containing ampicillin. Plasmids isolated from some colonies of the growing bacteria detected to carry the CP gene either by polymerase chain reaction or by BamHI and PstI enzyme restrictions. Thus, cloning of the CP gene into plasmid vector was successfully be done. The CP gene was successfully sequenced and found to consist of 650 nucleotides, a sized in accordane with CP gene of Polerovirus reported worldwide. Based on multiple alignment analysis using crustal W, the nucleotide sequence of the CP gene having high homology of about 98% with those of PeVYV infected chili pepper in Bali. This result confirmed that RLD on carrot was associated with infection of PeVYV, as previously reported.
Keywords: Chimera, Escherichia coli M15 (pREP4), recombinant plasmid pQE-CP PeVYV.
7
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya meyatakan bahwa skripsi berjudul “Kloning dan
Sequencing Gen Coat Protein Pepper vein yellow virus Penyebab Penyakit Daun
Merah pada Tanaman Wortel” adalah benar karya saya dengan arahan dari pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya pada Institut Pertanian Bogor.
Bogor, Agustus 2014
Dayang Diani Putri
NIM A34100074
_______________________________
*Pelimpahan hak cipta atas karya tulis dari penelitian kerja sama dengan pihak luar IPB harus didasarkan pada perjanjian kerja sama yang terkait
9
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk melakukan Penelitian Tugas Akhir
pada
Departemen Proteksi Tanaman
KLONING DAN SEQUENCING GEN COAT PROTEIN PEPPER
VEIN YELLOW VIRUS PENYEBAB PENYAKIT DAUN
MERAH PADA TANAMAN WORTEL
DAYANG DIANI PUTRI
DEPARTEMEN PROTEKSI TANAMAN
FAKULTAS PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
11 Judul Skripsi : Kloning dan Sequencing Gen Coat Protein Pepper vein yellow
virus Penyebab Penyakit Daun Merah pada Tanaman Wortel
Nama : Dayang Diani Putri NIM : A34100074
Disetujui oleh
Dr. Ir. Gede Suastika, M.Sc Pembimbing
Diketahui oleh
Dr Ir Abdjad Asih Nawangsih, M.Si Ketua Departemen
13
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT yang telah memberikan segala rahmat dan karunia-Nya sehingga dapat menyelesaikan skripsi ini yang berjudul “Kloning dan Sequencing Gen Coat Protein Pepper vein
yellow virus Penyebab Penyakit Daun Merah pada Tanaman Wortel”. Penelitian
dilakukan di Laboratorium Virologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Penelitian ini berlangsung mulai bulan Januari sampai Mei 2014.
Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada orang tua serta keluarga yang selalu memberikan do’a, dukungan serta motivasi kepada penulis. Terima kasih juga penulis sampaikan kepada Dr. Ir. Gede Suastika, MSc selaku dosen pembimbing skripsi sekaligus pembimbing akademik yang memberikan banyak saran, pengetahuan, dan dukungan, Prof. Dr. Ir. Dadang, MSc selaku dosen penguji tamu yang telah memberikan banyak kritik dan saran terhadap penulis, seluruh dosen Proteksi Tanaman yang telah membimbing, dan memberikan banyak pengetahuan kepada penulis. Terimakasih kepada Fitrianingrum Kurniawati, SP, MSi, Sari Nurulita, SP, Msi, dan teman-teman Laboratorium Virologi yang telah memberikan bimbingan dan membantu selama proses penelitian, serta teman-teman Proteksi Tanaman angkatan 47 (Ina, Egi, Ika, Titah, Gita, Risna, Almira, Rian) dan KR (Ami, Dini, Estu, Ita, Qiqin) yang memberikan banyak dukungan dan motivasi selama perkuliahan hingga penelitian.
Penulis menyadari masih banyak kekurangan yang perlu diperbaiki dalam skripsi ini, oleh karena itu penulis membutuhkan kritik dan saran bersifat membangun untuk mencapai tujuan yang diinginkan. Semoga skripsi ini dapat memberikan manfaat.
Bogor, Agustus 2014
15
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL vii
DAFTAR GAMBAR vii
DAFTAR LAMPIRAN vii
PENDAHULUAN 1
Latar Belakang 1
Tujuan Penelitian 2
Manfaat Penelitian 2
BAHAN DAN METODE 3
Metode Penelitian 3
Amplifikasi Gen CP 3
Ekstraksi RNA Virus 3
Sintesis Complementary (c) DNA 3
PCR 3
Elusi Produk PCR 4
Insersi Gen CP PeVYV pada Plasmid Vektor pQE-30 4
Restriksi Plasmid dan Insert 4
Ligasi Plasmid dan Insert 4
Transformasi E. coli M15 4
Konfirmasi Transforman 4
Isolasi Plasmid 4
Pemotongan pQE-CP PeVYV dengan Enzim Restriksi 5
Koloni PCR 5
Sekuen Nukleotida gen CP PeVYV 5
HASIL DAN PEMBAHASAN 6
Gejala Penyakit di Lapangan 6
Amplifikasi Gen CP PeVYV 6
Kloning Gen CP PeVYV 7
Kofirmasi Transforman 8
Sekuen nukleotida Gen CP PeVYV 9
PENUTUP 11
Simpulan 11
Saran 11
DAFTAR PUSTAKA 12
17
DAFTAR TABEL
1 Homologi sekuen nukleotida PeVYV isolat wortel asal Jawa Barat (PeVYV-Indonesia) dengan spesies virus yang sudah dilaporkan dapat
menginfeksi tanaman wortel. 9
DAFTAR GAMBAR
1 Tanaman wortel yang menunjukkan gejala penyakit daun merah akibat terinfeksi PeVYV di daerah Cikajang, Garut (A); gejala khas penyakit daun merah ditandai dengan terjadinya klorosis menguning
hingga merah pada jaringan daun (B). 6
2 Hasil amplifikasi gen CP-PeVYV berukuran sekitar 650 bp melalui
reverse transcription-polymerase chain reaction terhadap sampel
tanaman wortel dari Garut (lajur G1) menggunakan primer spesifik terhadap isolat wortel dari Garut (lajur G1). Lajur M adalah 1 kb DNA ladder, lajur K- adalah kontrol negatif, dan lajur K+ adalah kontrol positif (sampel tanaman cabai terinfeksi PeVYV asal Bali). 7 3 Koloni Escherichia coli M15 (pREP4), setelah ditransformasi dengan
pQE-CP PeVYV, yang tumbuh pada media LB yang mengandung antibiotik ampisilin (A); dan replika koloni rekombinan (B) 8 4 Hasil elektroforesis pada 1% gel agarose dari (A) pemotongan
plasmid rekombinan pQE-CP PeVYV dengan enzim restriksi BamHI dan PstI. Lajur 1: 1 kb DNA ladder, lajur 2: pQE-CP PeVYV yang tidak dipotong, lajur 3: pQE-CP PeVYV yang dipotong dan (B) hasil PCR koloni Escherichia coli yang membawa plasmid chimera pQE-CP PeVYV. Lajur 1: 1 kb DNA ladder, lajur 2-5: PCR koloni
transforman yang mengandung pQE-CP PeVYV 8
5 Pohon filogenetika klon gen CP Pepper vein yellow virus dibandingkan dengan isolat-isolat negara lain. Nomor aksesi PeVYV isolat ranti asal India adalah JX427531, PeVYV-Thailand-Cabai JX427541, PeVYV-Mali-Paprika AB594828, PeVYV-Jepang-Cabai AB594828, PeVYV-Taiwan-Cabai JX427542, PeVYV-Philippines-Cabai JX427538, PeVYV-Israel-PeVYV-Philippines-Cabai HM439608,
PeVYV-China-Cabai AJ575129. 10
DAFTAR LAMPIRAN
1 Hasil penjajaran sekuen nukleotida isolat virus asal Jawa Barat dengan isolat Pepper vein yellow virus asal Bali, Taiwan, Thailand, India, Filipina, Jepang, Mali, China, dan Israel menggunakan program
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Wortel (Daucus carota L) termasuk ke dalam famili Umbelliferae berasal dari Asia Tengah dan banyak ditanam di daerah beriklim subtropik atau dataran tinggi di daerah tropik (Balitsa 2010). Awalnya budidaya wortel di Indonesia hanya terkonsentrasi di Jawa Barat yaitu daerah Lembang, Bandung, dan Cipanas, Cianjur. Namun, dalam perkembangannya menyebar luas ke daerah-daerah sentra sayuran di Jawa dan luar Jawa (Rahman 2010). Dalam pengembangannya terdapat faktor penghambat seperti Organisme Pengganggu Tumbuhan (OPT). Beberapa virus telah dilaporkan menginfeksi pertanaman wortel di berbagai negara. Murayama et al. (1998) melaporkan di Jepang ditemukan Carrot red leaf virus (CtRLV) yang tergolong famili Luteoviridae genus Polerovirus. Gejala infeksi virus ini menyebabkan daun menguning dan kemerahan serta tanaman menjadi kerdil. Virus lain yang dilaporkan adalah Carrot latent virus, dan Carrot yellow
leaf virus dengan gejala yang hampir sama dengan CtRLV. Hasanah (2014)
melaporkan di Jawa Barat ditemukan tanaman wortel yang terinfeksi Pepper vein
yellow virus (PeVYV). PeVYV merupakan anggota famili Luteoviridae, genus Polerovirus. Murakami et al. (2010), berhasil mengamplifikasi PeVYV yang
menginfeksi tanaman paprika di Jepang dengan ukuran genom lengkap sebesar 6244 nukleotida. Ukuran genom tersebut menunjukkan kesamaan struktur dengan anggota genus Polerovirus. Suastika et al. (2012) juga melaporkan terdapat
Polerovirus yang menginfeksi tanaman cabai di Bali. Setelah dilakukan sekuen
nukleotida, kemudian dianalisis menggunakan program Basic Local Alignment
Search Tool (BLAST) menunjukkan adanya kemiripan antara virus isolat cabai
asal Bali dengan isolat virus yang termasuk spesies PeVYV dari negara lain dengan nilai homologi mencapai 98%.
Berdasarkan laporan Hasanah (2014), terdapat indikasi spesies virus yang berasosiasi dengan penyakit klorosis pada tanaman cabai di Bali sama dengan spesies virus yang berasosiasi dengan penyakit daun merah pada tanaman wortel di Jawa Barat. PeVYV yang tergolong famili Luteoviridae dapt ditularkan ke tanaman melalui vektor serangga yaitu Aphis gossypii (Aphididae: Hemiptera) secara persisten non propagatif (Huang et. al 2005 dan Murakami et. al 20011). Hal tersebut menunjukkan ada kemungkinan bahwa PeVYV juga sudah menginfeksi jenis tanaman lain. Oleh karena itu, diperlukan sarana deteksi yang lebih mudah namun tetap akurat selain teknik reverse transcription-polymerase
chain reaction (RT-PCR) dalam mengonfirmasi PeVYV. Salah satu metode
tersebut adalah uji serologi. Dalam produksi antiserum, sebagai salah satu komponen utama dalam uji serologi diperlukan antigen berupa coat protein (CP) dari PeVYV. Kemajuan teknologi di bidang biologi molekuler telah menyediakan metode ekspresi suatu gen tertentu (gen CP virus, misalnya) yang disisipkan dalam vektor ekspresi (plasmid) pada Escherechia coli. Ekspresi gen CP PeVYV pada E. coli menjanjikan tersedianya immunogen dalam jumlah cukup untuk produksi antiserum.
2
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk (1) memperoleh klon rekombinan gen CP PeVYV dalam plasmid vektor ekspresi pQE-30 dan (2) mengonfirmasi penyebab penyakit daun merah pada tanaman wortel.
Manfaat Penelitian
Klon rekombinan yang diperoleh pada penelitian ini dapat digunakan untuk mengekspresikan gen CP dari PeVYV di dalam sel bakteri E. coli. Protein CP yang telah dimurnikan dapat digunakan sebagai antigen dalam produksi antiserum terhadap PeVYV. Antiserum yang spesifik dapat digunakan sebagai sarana deteksi pada berbagai metode uji serologi.
3
BAHAN DAN METODE
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Virologi Tumbuhan Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor mulai Januari sampai Mei 2014. Tanaman wortel bergejala khas penyakit daun merah yang diambil dari pertanaman petani di daerah Garut, Jawa Barat yang telah tersedia di Laboratorium Virologi Tumbuhan IPB digunakan sebagai sumber virus.
Metode Penelitian Amplifikasi Gen CP
Ekstraksi RNA Virus. Ekstraksi RNA dilakukan dengan menggunakan
Rneasy Plant Mini Kits (Phille Korea Technology). Sebanyak 0.1 g sampel daun
tanaman wortel yang bergejala digerus menggunakan pistil dan mortar, dibantu dengan penambahan nitrogen cair. Serbuk hasil gerusan ditambahkan 500 μl Plant
RNA Lysis yang mengandung merkaptoetanol 1% (5 μl), kemudian dipindahkan
ke tabung eppendorf 1.5 ml. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 56 ºC selama 5 menit, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 14 000 rpm selama 5 menit. Supernatan (cairan) diambil tanpa menyentuh pelet dan dipindahkan ke tabung
eppendorf 1.5 ml. Sebanyak 250 μl etanol 96% ditambahkan dalam tabung dan
dipipeting lalu dipindahkan ke purifikasi kolom. Kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 11 000 rpm selama 1 menit dan supernatan dibuang. Sebanyak 700 μl
wash buffer (WB1) ditambahkan ke dalam purifikasi kolom yang sama.
Selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 11 000 rpm selama 1 menit, supernatan dibuang. Sebanyak 500 μl wash buffer (WB2) dan disentrifugasi dengan kecepatan 11 000 rpm selama 1 menit. Supernatan dibuang dan disentrifugasi dengan kecepatan 14 000 rpm selama 1 menit. Sebanyak 50 μl
nuclease free water pada bagian tengah tabung purifikasi, disentrifugasi 11 000
rpm selama 1 menit dan dipindahkan pada tabung eppendorf. Tabung purifikasi dibuang dan RNA disimpan pada suhu -80 ºC.
Sintesis Complementary (c) DNA. RNA yang diperoleh selanjutnya ditranskripsikan menjadi DNA komplemen (cDNA) dengan menggunakan teknik
reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) pada mesin PCR.
Komposisi reagen RT untuk satu kali reaksi (Thermo Scientific, US) dengan total volume 10 μl (3.7 μl ddH2O, 2 μl buffer RT, 0.5 μl dNTPS, 0.35 μl dTT, 0.35 μl M-MuLV, 0.35 μl RNAse inhibitor, dan 0.75 μl oligo d(T)).
PCR. PCR dilakukan dalam volume 25 μl yang terdiri dari 12.5 μl GoTag
Green (Thermo Scientific, US), 1 μl primer spesifik PeVYV-CP F-Bam: 5’-AA
TTAAGGATCCAATACGGGAGGGGTTAGGAGAAAT-3’ dan R-Pst: 5’-AATTAACTGCAGTTTCGGGTTGTGCAATTGC ACAGTA-3’, 8.5 μl ddH2O,
dan 2 μl cDNA. PCR dilakukan pada Automated Thermal cycler (Gene Amp PCR System 9700; PE Applied Biosystem, USA) pada kondisi predenaturasi pada 94 ºC selama 5 menit ; dilanjutkan dengan 35 siklus yang terdiri dari denaturasi pada 94 ºC selama 30 detik, penempelan primer (annealing) pada 50 ºC selama 1 menit dan pemanjangan (extension) pada 72 ºC selama 1 menit; dan siklus terakhir ditambahkan 10 menit pada 72 ºC.
4
Elusi Produk PCR. Produk PCR dielektroforesis dalam gel agarose 1%. Produk PCR dan marker DNA 1 kb (Thermo Scientific, US), masing-masing 10 μl dan 5 μl dimasukkan ke dalam sumuran yang telah disiapkan pada gel agarose. Elektroforesis dilakukan selama 30 menit pada 100 Volt. DNA yang telah dielektroforesis kemudian divisualisasi dengan UV transluminator. Bagian gel tepat pada produk PCR dipotong dan dimasukkan ke tabung yang sudah ditambahkan 500 μl Buffer DF (HiYield, China), kemudian divortex dan diinkubasi pada suhu 55 ºC sampai gel cair. Siapan kemudian dimasukkan ke DF column dan disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm selama 1 menit. Selanjutnya, 500 μl wash buffer (HiYield, China) dimasukkan dalam DF column dan disentrifugasi pada kecepatan 8000 rpm selama 1 menit. Sebanyak 20 μl Buffer Elusi (HiYield, China) ditambahkan pada column dan disentrifugasi pada kecepatan 8000 rpm selama 1 menit. Hasil elusi (yang merupakan gen CP PeVYV) disimpan pada suhu -20 ºC.
Insersi Gen CP PeVYV pada Plasmid Vektor pQE-30
Restriksi Plasmid dan Insert. Plasmid pQE-30 dan Gen CP PeVYV direstriksi dengan enzim BamHI dan PstI sesuai dengan jenis pemotongan yang ada pada masing-masing DNA tersebut. Reaktan untuk masing-masing restriksi yang dilakukan dengan total volume 20 μl memiliki komponen: 1 μl plasmid pQE-30 atau gen CP PeVYV, 1 μl enzim BamHI, 1 μl enzim PstI, 2 μl Medium Buffer, dan 15 μl ddH2O. Reaksi restriksi diinkubasi pada suhu 37 ºC selama
semalam.
Ligasi Plasmid dan Insert. Gen CP PeVYV disisipkan ke dalam plasmid pQE-30 melalui reaksi ligasi mengikuti prosedur (Qiagen, US). Ligation mix dengan total volume 10 μl terdiri dari Plasmid pQE-30 sebanyak 2 μl, 2 μl gen CP PeVYV, 1 μl enzim T4 DNA ligase, 1 μl buffer ligasi, dan 4 μl ddH2O. Reaksi
ligasi dilakukan pada suhu 4 ºC selama 16 jam. Hasil ligasi akan menghasilkan plasmid pQE-30 yang mempunyai insert gen CP PeVYV, yang untuk selanjutnya disebut plasmid pQE-CP PeVYV.
Transformasi E. coli M15. Transformasi dilakukan dengan mencampur 10 μl hasil ligasi dengan 100 μl sel kompeten E. coli M15 mengikuti protokol dari Qiagen (USA). Campuran hasil ligasi dan kompeten sel diinkubasi dalam es batu selama 20 menit, kemudian heat shock pada suhu 42 ºC selama 1 menit, lalu dipindah kembali ke dalam es selama 2 menit. Selanjutnya ditambahkan 500 μl Luria Bertani (LB) cair, diinkubasi dengan dishaker pada suhu 37 ºC selama 2 jam, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 12 000 selama 1 menit. Setelah itu supernatan dibuang, pelet dan LB yang tersisa sebanyak 100 μl dihomogenasi, dan ditumbuhkan dalam media LB agar 50 ml yang telah diberi ampisilin 100 μl dan kanamycin 25 μl. Biakan tersebut ditumbuhkan pada suhu 37 ºC semalam. Konfirmasi Transforman
Transforman yang membawa plasmid pQE-CP terlebih dahulu ditumbuhkan pada media LB cair 5 ml yang mengandung 10 μl ampisilin dan 2.5 μl kanamycin pada suhu 37 ºC selama semalam, kemudian plasmid diisolasi dengan dengan Kit
Geneaid Plasmid (Geneaid, TW). Konfirmasi dilakukan dengan (1) memotong
Plasmid pQE30-CP dengan enzim restriksi BamHI dan PstI dan (2) koloni PCR. Isolasi Plasmid. Isolasi plasmid dilakukan dengan Kit Geneaid Plasmid (Geneaid, TW). Transforman dalam media LB yang telah diinkubasi semalam disentrifugasi dengan kecepatan 12 000 rpm selama 1 menit. Selanjutnya,
5 sebanyak 1.5 ml kultur sel bakteri dipindahkan ke tabung eppendorf, disentrifugasi selama 1 menit dengan kecepatan 14 000 rpm, dan supernatan dibuang. Kemudian sebanyak 200 μl buffer PD 1 ditambahkan dan diresuspensi, setelah itu 200 μl buffer PD 2 dicampurkan dalam tabung eppendorf dengan cara dibolak-balik 10x dan didiamkan selama 2 menit. Sebanyak 300 μl buffer PD 3 ditambahkan dan dicampurkan dengan cara tabung dibolak-balik 10x lalu disentrifugasi dengan kecepatan 14 000 rpm selama 3 menit. Tahap selanjutnya adalah DNA Binding dengan cara penempatan PD column di tabung 2 ml, dan supernatan dari tahap netralisasi ditambahkan dalam PD column, disentrifugasi dengan kecepatan 14 000 rpm selama 30 detik. PD column ditempatkan kembali pada tabung 2 ml yang baru, sebanyak 400 μl buffer W 1 ditambahkan pada PD
column, disentrifugasi kembali selama 30 detik dengan kecepatan 14 000 rpm.
Supernatan dibuang, sebanyak 600 μl wash buffer ditambahkan dalam PD
column, disentrifugasi dengan kecepatan 14 000 rpm selama 30 detik, supernatan
dibuang, dan disentrifugasi kembali untuk memastikan column kering. Selanjutnya PD column yang kering dipindahkan ke tabung baru dan ditambahkan 50 μl elution buffer tepat ditengah matriks column, didiamkan selama 2 menit, lalu disentrifugasi dengan kecepatan 14 000 rpm selama 2 menit. Hasil isolasi plasmid disimpan pada suhu -80 ºC.
Pemotongan pQE-CP PeVYV dengan Enzim Restriksi. Plasmid pQE-CP PeVYV dipotong dengan enzim restriksi BamHI dan PstI seperti pada Restriksi Plasmid di atas. Hasil restriksi dielektroforesis pada gel agarose 1% dengan tegangan 100 V selama 30 menit. Hasil elektroforesis divisualisasikan dengan UV
Transluminator dan didokumentasikan dengan kamera digital.
Koloni PCR. Satu koloni hasil tranformasi diambil dengan tip digores ke media LB agar yang telah dibagi empat kuadran (untuk replika), kemudian dimasukan ke tabung eppendorf yang telah diisi dengan komponen PCR (12.5 μl
Go Tag Green, 1 μl primer forward PeVYV-CP BamHI: 5’-AA
TTAAGGATCCAATACGGGAGGGGTTAGGAGAAAT-3’, 1 μl primer reverse PeVYV-CP PstI: 5’-AATTAACTGCAGTTTCGGGTTGTGCAATTGC
ACAGTA-3’, 9.5 μl ddH2O). Reaksi PCR dilakukan dengan program yang sama
dengan saat amplifikasi gen CP PeVYV. Hasil koloni PCR dielektroforesis pada gel agarose 1% dengan tegangan 100 V selama 30 menit. Hasil elektroforesis divisualisasikan dengan UV transluminator dan didokumentasikan dengan kamera digital.
Sekuen Nukleotida gen CP PeVYV
Sampel hasil koloni PCR yang positif diperbanyak kembali dengan PCR dalam jumlah 50 μl dan sampel dikirim ke PT. Genetika Science Indonesia untuk dilakukan sekuen nukleotida. Hasil sekuen dianalisis untuk mengetahui tingkat homologi atau kesejajaran dengan sekuen gen CP dari virus yang sama yang telah dipublikasikan di GenBank dengan Program Basic Local Alignment Tool (BLAST) (NCBI 2014). Data sekuen nukleotida kemudian dianalisis melalui
CrustalW multiple alignment dengan software Bioedit V7.05, kemudian
dilanjutkan dengan analisis filogenetika menggunakan software Molecular
6
HASIL DAN PEMBAHASAN
Gejala Penyakit di Lapangan
Berdasarkan hasil survei Hasanah (2014), penyakit daun merah telah ditemukan menyerang areal pertanaman wortel di daerah Jawa Barat yang meliputi Cipanas, Garut, dan Lembang. Pengumpulan tanaman bergejala yang dilakukan di ketiga daerah di Jawa Barat tersebut berhasil mendapatkan wortel yang terinfeksi Pepper vein yellow virus (PeVYV) (Gambar 1A). Tanaman wortel yang terinfeksi PeVYV menunjukkan gejala yang diawali dengan menguningnya jaringan daun kemudian berubah menjadi berwarna merah. Perubahan warna ini dimulai pada daun teratas, kemudian berkembang secara merata ke daun-daun bagian bawah (Gambar 1B).
Penyakit daun merah pada tanaman wortel yang ditemukan di daerah Jawa Barat ini mirip dengan gejala penyakit daun merah yang disebabkan oleh infeksi
Polerovirus yang telah dilaporkan di negara lain (Murayama et al. 1998). Oleh
karena itu identifikasi difokuskan pada Polerovirus. Berdasarkan hasil penelitian Hasanah (2014), deteksi dengan RT-PCR menggunakan primer spesifik
Polerovirus, cDNA berhasil diamplifikasi hingga diperoleh fragmen DNA
PeVYV yang berukuran sekitar 650 bp. Salah satu sampel tanaman wortel bergejala penyakit daun merah digunakan sebagai sumber virus dalam penelitian ini. Isolat virus yang digunakan dalam penelitian ini disebut PeVYV-CWJ dan untuk selanjutnya disebut demikian.
Amplifikasi Gen CP PeVYV
Gen CP PeVYV-CWJ berhasil diamplifikasi menggunakan primer yang didesain sedemikian rupa sehingga produk RT-PCR dapat melingkupi seluruh gen CP mulai dari start codon sampai stop codon. Panjang fragmen DNA yang diperoleh sekitar 650 bp (Gambar 2). Telah dilaporkan sebelumnya oleh Rahayuningsih (2013) bahwa teknik PCR menggunakan pasangan primer F-Bam dan R-Pst berhasil mengamplifikasi gen CP Polerovirus dari tanaman cabai yang
B
A
Gambar 1 Tanaman wortel yang menunjukkan gejala penyakit daun merah akibat terinfeksi PeVYV di daerah Cikajang, Garut (A); gejala khas penyakit daun merah ditandai dengan terjadinya klorosis menguning hingga merah pada jaringan daun (B).
Gambar 2 Tanaman wortel yang menunjukkan gejala penyakit daun merah akibat terinfeksi PeVYV di daerah Cikajang, Garut (A); gejala khas penyakit daun merah ditandai dengan terjadinya klorosis menguning hingga merah pada jaringan daun (B).
B
A
7 terinfeksi Polerovirus yang ditunjukkan dengan panjang fragmen DNA sekitar 650 bp. Oleh karena itu, diperlukan konfirmasi kesamaan penyebab penyakit daun merah yang menyerang wortel dan klorosis cabai dengan cara kloning gen CP.
Fragmen gen CP hasil amplifikasi tersebut digunakan pada tahapan berikutnya yaitu kloning gen CP PeVYV. Sebelumnya dilakukan isolasi fragmen gen CP dari gel agarose dengan teknik elusi, sehingga dari tahapan ini akan diperoleh fragmen tunggal gen CP.
Kloning Gen CP PeVYV
Tahapan utama dalam kloning gen yaitu proses ligasi dan transformasi. Proses ligasi yaitu menggabungkan DNA sisipan (fragmen gen CP) ke dalam vektor. Hasil ligasi antara plasmid sebagai vektor dengan suatu fragmen DNA (chimera) diintroduksi ke dalam E. coli sebagai inangnya yang kemudian ditumbuhkan dalam media yang telah diberi ampisilin. Bakteri yang digunakan dalam proses transformasi adalah bakteri E. coli yang telah kompeten. Pada kondisi normal, bakteri ini mempunyai keterbatasan dalam mengambil DNA, sehingga harus diberi perlakuan fisik dan kimia tertentu agar menjadi kompeten dalam mengambil DNA (Brown 1991).
Keberhasilan proses transformasi dapat dilihat dari kemampuan tumbuh E.
coli pada media yang mengandung ampisilin karena plasmid yang digunakan
mengandung gen resisten terhadap ampisilin. Keberhasilan proses ligasi dapat diketahui dari adanya koloni yang berwarna putih (Gambar 3). Sel yang mengandung plasmid yang membawa sisipan DNA akan berwarna putih pada media LB yang mengandung antibiotik ampisilin (Sambrook et al. 2001).
Gambar 2 Hasil amplifikasi gen CP-PeVYV berukuran sekitar 650 bp melalui
reverse transcription-polymerase chain reaction terhadap sampel
tanaman wortel dari Garut (lajur G1) menggunakan primer spesifik terhadap isolat wortel dari Garut (lajur G1). Lajur M adalah 1 kb DNA ladder, lajur K- adalah kontrol negatif, dan lajur K+ adalah kontrol positif (sampel tanaman cabai terinfeksi PeVYV asal Bali).
Gambar 3 Hasil amplifikasi gen CP-PeVYV berukuran sekitar 650 bp melalui
reverse transcription-polymerase chain reaction terhadap sampel
tanaman wortel dari Garut (lajur G1) menggunakan primer spesifik terhadap isolat wortel dari Garut (lajur G1). Lajur M adalah 1 kb DNA ladder, lajur K- adalah kontrol negatif, dan lajur K+ adalah kontrol positif (sampel tanaman cabai terinfeksi PeVYV asal Bali).
M K- K+ G1 M K- K+ G1 750 bp 750 bp ±650 bp ±650 bp 500 bp 500 bp
8
Kofirmasi Transforman
Plasmid rekombinan pQE-CP PeVYV yang membawa gen CP-PeVYVY berhasil dikonstruksi dengan menyisipkan gen tersebut pada situs pemotongan
BamHI/PstI. Hasil pemotongan plasmid rekombinan pQE CP PeVYV dengan BamHI/PstI menghasilkan dua pita berukuran sekitar 3400 bp dan 650 bp yang
masing-masing merupakan plasmid vektor pQE-30 dan gen CP PeVYV (Gambar 4A).
Enzim restriksi yang digunakan yaitu BamHI dan PstI yang masing-masing mempunyai situs pengenalan enam nukleotida. BamHI akan mengenali situs GGATCC dan akan memotong antara basa G dan G, PstI mengenali situs CTGCAG dan akan memotong antara basa G dan A (Glick dan Pasternak 2003).
Setelah restriksi, tahap terakhir dalam penyusunan molekul DNA rekombinan adalah menyambung molekul vektor dan molekul DNA yang akan disisipkan. Proses ini disebut ‘ligasi’ dan enzim yang mengkatalisis reaksi Gambar 4 Hasil elektroforesis pada 1% gel agarose dari (A) pemotongan plasmid
rekombinan pQE-CP PeVYV dengan enzim restriksi BamHI dan PstI. Lajur 1: 1 kb DNA ladder, lajur 2: pQE-CP PeVYV yang tidak dipotong, lajur 3: pQE-CP PeVYV yang dipotong dan (B) hasil PCR koloni Escherichia coli yang membawa plasmid chimera pQE-CP PeVYV. Lajur 1: 1 kb DNA ladder, lajur 2-5: PCR koloni transforman yang mengandung pQE-CP PeVYV
Gambar 3 Koloni Escherichia coli M15 (pREP4), setelah ditransformasi dengan pQE-CP PeVYV, yang tumbuh pada media LB yang mengandung antibiotik ampisilin (A); dan replika koloni rekombinan (B)
Tabel 1 Homologi sekuen nukleotida PeVYV isolat wortel asal Jawa Barat (PeVYV-Indonesia) dengan spesies virus yang sudah dilaporkan dapat menginfeksi tanaman wortel.Gambar 4 Koloni Escherichia coli M15 (pREP4), setelah ditransformasi dengan pQE-CP PeVYV, yang tumbuh pada media LB yang mengandung antibiotik ampisilin (A); dan replika koloni rekombinan (B)
A
A
B
B
650 bp 650 bp 650 bp 650 bp 750 bp 750 bp 3400 bp 3400 bp 3000 bp 3000 bp 500 bp 500 bp 5000 bp 5000 bp 1 2 3 1 2 3 A A 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 B B9 tersebut adalah DNA ligase. Koloni E. coli M15 (pREP4) yang membawa plasmid rekombinan telah berhasil diseleksi dengan PCR. Satu pita tunggal dengan ukuran sekitar 650 bp berhasil diamplifikasi dari beberapa koloni tunggal E. coli M15 (pREP4) (Gambar 4B). Dengan hasil verifikasi melalui PCR dan enzim restriksi ini, maka kloning gen CP PeVYV isolat wortel ke dalam plasmid vektor pQE-30 telah berhasil dilakukan.
Sekuen nukleotida Gen CP PeVYV
Gen CP PeVYV isolat wortel asal Jawa Barat (PeVYV-CWJ) yang telah dikloning dalam vektor pQE-30 berhasil dibaca sekuen nukleotidanya (Lampiran). Hasil analisis homologi, seperti yang ditampilkan pada Tabel 1, ternyata gen CP ini mempunyai tingkat kesamaan yang sangat rendah yaitu 22%-43%, dengan sekuen nukleotida padanannya dari spesies virus yang telah dilaporkan dapat menginfeksi wortel. Namun demikian, gen CP ini mempunyai tingkat homologi yang sangat tinggi (98%) dengan gen padanan dari PeVYV.
No Aksesi Spesies Virus* Homologi (%)
- PeVYV 98% NC_001726 CMoMV 43% NC_011515 CMoV 43% JX156435 CTLV 41% NC_013007 CYLV 22% NC_006265 CtRLV 56%
*PeVYV=Pepper vein yellow virus asal Indonesia (Bali), CMoMV=Carrot mottle mimic virus asal Australia, CMoV=Carrot mottle virus asal Jerman, CYLV=Carrot yellow leaf virus asal Jerman, CtRLV=Carrot red
leaf virus asal Inggris, dan CTLV=Carrot thin leaf virus asal China.
Fauquet et al. (2005) menyatakan apabila terdapat persamaan runutan nukleotida dari gen CP antara satu virus dengan virus lain dengan nilai lebih dari 90%, maka virus-virus tersebut merupakan spesies virus yang sama. Hasil penelitian ini mengkonfirmasi bahwa virus yang berasosiasi dengan penyakit daun merah pada tanaman wortel di Jawa Barat adalah PeVYV, seperti yang telah dilaporkan oleh Hasanah (2014). PeVYV termasuk salah satu anggota genus
Polerovirus dari famili Luteoviridae. Virus dari famili ini memiliki genom berupa
RNA (ssRNA) dan partikel berbentuk isometrik (Agrios 2005). Virus ini tidak dapat ditularkan secara mekanis melalui sap tanaman, tetapi dapat ditularkan melaui serangga vektor (Walkey 1991). PeVYV merupakan virus tanaman dengan kisaran inang yang terbatas, hanya pada cabai. Namun, Hasanah (2014) yang menemukan bahwa PeVYV dapat menginfeksi wortel merupakan laporan pertama PeVYV dapat menginfeksi tanaman selain cabai.
Tabel 1 Homologi sekuen nukleotida PeVYV isolat wortel asal Jawa Barat (PeVYV-Indonesia) dengan spesies virus yang sudah dilaporkan dapat menginfeksi tanaman wortel.
Tabel 2 Homologi sekuen nukleotida PeVYV isolat wortel asal Jawa Barat (PeVYV-Indonesia) dengan spesies virus yang sudah dilaporkan dapat menginfeksi tanaman wortel.
10
Analisis filogenetika menunjukkan hubungan kekerabatan PeVYV isolat wortel asal Jawa Barat (PeVYV-CWJ-Wortel) yang paling dekat adalah terhadap isolat PeVYV yang menginfeksi tanaman cabai di Bali (PeVYV-Bali-Cabai; Gambar 5). Hasil ini selaras dengan nilai homologi gen CP PeVYV yang diperoleh melalui analisis kesejajaran, dimana PeVYV isolat wortel asal Jawa Barat memiliki nilai homologi tertinggi terhadap gen CP PeVYV isolat cabai asal Bali. Hasil analisis hubungan kekerabatan melalui pohon filogenetika ini mengindikasikan bahwa terdapat kemungkinan besar bahwa di Indonesia PeVYV menginfeksi cabai terlebih dahulu, dan kemudian menyebar ke tanaman wortel melalui serangga vektor kutu daun.
Gambar 5 Pohon filogenetika klon gen CP Pepper vein yellow virus dibandingkan dengan isolat-isolat negara lain. Nomor aksesi PeVYV isolat ranti asal India adalah JX427531, Thailand-Cabai JX427541, Mali-Paprika AB594828, PeVYV-Jepang-Cabai AB594828, PeVYV-Taiwan-Cabai JX427542, PeVYV-Philippines-Cabai JX427538, PeVYV-Israel-Cabai HM439608, PeVYV-China-Cabai AJ575129.
Gambar 5 Pohon filogenetika klon gen CP Pepper vein yellow virus dibandingkan dengan isolat-isolat negara lain. Nomor aksesi PeVYV isolat ranti asal India adalah JX427531, Thailand-Cabai JX427541, Mali-Paprika AB594828, PeVYV-Jepang-Cabai AB594828, PeVYV-Taiwan-Cabai JX427542, PeVYV-Philippines-Cabai JX427538, PeVYV-Israel-Cabai HM439608, PeVYV-China-Cabai AJ575129.
11
PENUTUP
Simpulan
Gen CP PeVYV isolat wortel asal Jawa Barat berhasil diklon ke dalam plasmid vektor pQE-30. Karakterisasi terhadap gen CP melalui analisis kesejajaran sekuen nukleotida menunjukkan bahwa gen virus tersebut memiliki homologi yang tinggi (98%) terhadap PeVYV dari negara lain yang terdapat di GeneBank. Oleh karena itu, telah dapat dikonfirmasi bahwa spesies Polerovirus yang menyebabkan penyakit daun merah pada tanaman wortel di Jawa Barat adalah PeVYV.
Saran
E. coli M15 (pREP4), yang telah berhasil ditransformasi dengan pQE-CP
PeVYV pada penelitian ini, perlu diinduksi dengan IPTG, pada penelitian selanjutnya, agar dapat mengekspresikan protein CP PeVYV. Protein ini dapat digunakan sebagai antigen dalam produksi antiserum PeVYV untuk sarana barbagai uji serologi.
12
DAFTAR PUSTAKA
Agrios GN. 2005. Plant Pathology. 5th ed. New York (US): Academic Press. [Balitsa] Balai Penelitian Tanaman Sayuran. 2010. Budidaya wortel[Internet]
[diunduh 2014 Feb 3]. Tersedia pada:
http://balitsa.litbang.deptan.go.id/ind/.../MP11%20Budidaya%20wortel.pdf [BPS] Badan Pusat Statistik. 2013. Luas panen, produksi dan produktivitas
wortel, 2009-2013 [Internet]. [diunduh 2014 Mar 30]. Tersedia pada:http://webbeta.bps.go.id/tab_sub/view.php?kat=1&tabel=1&daftar=1& id_subyek=55¬ab=65.
Brown TA. 1991. Pengantar Kloning GenA. Muhammad SA, Praseno, penerjemah. Yogyakarta (ID): YayasanEssentiaMedica, Terjemahandari:
Gene Cloning an Introduction.
Fauquet CM, Mayo MA, Maniloff J, Desselberger U, Ball LA, editor. 2005. Virus
Taxonomy Eight Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. San Diego: Virol Div Int Union of Microb Soc.
Glick BR, Pasternak JJ. 2003.Molecular Biotechnology Principles and
Applications of Recombinant DNA. Ed ke-3. Washington DC (US): ASM
Press.
Hasanah IR. 2014. Identifikasi spesies Polerovirus pada tanaman wortel melalui analisis sekuen nukleotida gen coat protein [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Huang LF, Naylor M, Pallet DW, Reeves J, Cooper JL, Wang H. 2005. The complete genome sequence, organization an affinities of Carrot red leaf
virus. Arch Virol. 150:1845-1855. doi: 10. 1007/s00705-005-0537-6.
Murakami R, Nakashima N, Hinomoto N, Kawano S, Toyosato T. 2011. The genome sequence of Pepper vein yellows virus (Family: Luteoviridae, genus
Polerovirus). J Arch Virol. [Internet] [diunduh 2014 Mar 6];
156(1):921-923. 10.1007/s00705-011-0956-5.
Murayama D, Agrawal HO, Inove T, Kimoro I, Shikata E, Tomaru K, Tsuchizaki T, Triharso. 1998. Plant Viruses in Asia. Yogyakarta (ID): UGM Press. Rahayuningsih T. 2013. Identifikasi spesies Polerovirus penyebab penyakit
klorosis pada tanaman cabai melalui sekuen nukleotida [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Rahman BB. 2010. Sejarah dan budidaya wortel [Internet] [diunduh pada 2014 Mar 23]. Tersedia pada:
http://m.epetani.deptan.go.id/budidaya/sejarah-budidaya-wortel-873.
Sambrook J, Russel DW. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. New York (US): Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Suastika G, Hartono S, Nyana IDN, Natsuaki T. 2012. Laporan pertama tentang infeksi Polerovirus pada tanaman cabai di daerah Bali, Indonesia. J
Fitopatol Indones. [Internet] [diunduh 2014 Mar 21]; 8(1):151-154.
Tersedia pada:http://journal.ipb.ac.id/index.php/jfiti/article/download/6789/
5233.
13
14
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
5 15 25 35 45 PeVYV-CWJ- TTT-AATTAA --GGGATCCA ATACGGGAGG GGTTAGGAGA AATAATAATG
PeVYV-Bali TTT-AATTAA --GG-ATCCA ATACGGGAGG GGTTAGGAGA AATAATAATG PeVYV-Taiw TAC-GTGCAA TCGTTAATGA ATACGGGAGG GGTTAGGAGA AACAATAATG PeVYVP-Tha TAC-GCGCGA TCGTTAATGA ATACGGGAGG AGTTAGGAGA AACAATAATG PeVYV-Indi TAC-GCGCGA TCGTTAATGA ATACGGGAGG AGTTAGGAGA AACAATAATG PeVYV-Phil TTC-GCGCGA TCGTTAATGA ATACGGGAGG AGTTAGGAGC AATAATAATG PeVYV-Japa TTC-GCGCAA TCGTTAATGA ATACGGGAGG GGTTAGGAGA AATAATAATG PeVYV-Mali TCC-GTGCGA TCGTTAATGA ATACGGGAGG AGTTAGGAGA AACAATAATG PeVYV-Chin TAC-GCGCGA TCGTTAATGA ATACGGGCGG AGCTAGGAGA AACAACAATG PeVYV-Isra TTCCGCGCGA TCGTTAATGA ATACGGAAGG GGTTAGGAGA AATAATAATG Clustal Co * * * * * ****** ** * ****** ** ** **** ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
55 65 75 85 95 PeVYV-CWJ- GNAATGGTGG ATCACGTAAC ACCCGCCGTC GTAGACGCCC ACGACAGGTT
PeVYV-Bali GAAATGGTGG ATCACGTAAC ACCCGCCGTC GTAGACGCCC ACGACAGGTT PeVYV-Taiw GAAATGGTGG ATCACGTAAC ACCCGCCGTC GTAGACGCCC ACGACAGGTT PeVYVP-Tha GAAATGGTGG ATCACGTAAC ACCCGCCGTC GTAGACGCCC ACGACAGGTT PeVYV-Indi GAAATGGTGG ATCACGTAAC ACCCGCCGTC GTAGACGCCC ACGACAGATT PeVYV-Phil GAAATGGTGG ATCACGTAGC ACCCGCCGTC GCAGACGCCC ACGACAGGTT PeVYV-Japa GAAATGGTGG ATCACGTAAC ACCCGCCGTC GTAGACGCCC ACGACAGGTT PeVYV-Mali GAAATGGTGG ATCACGTAAC ACCCGCCGTC GCAGACGCCC ACGACAGGTT PeVYV-Chin GAAATGGTGG ATCACGAAGC ACCCGCCGTC GCAGACGCCC AAGACAGGTT PeVYV-Isra GAAATGGTGG ATCACGCGGC ACCCGCCGTC GTAGACGCCC ACGACAGGTT Clustal Co * ******** ****** * ********** * ******** * ***** ** ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
105 115 125 135 145 PeVYV-CWJ- CGCCCTGTCG TTGTGGTCGC ACCCCCTGGG CGCACACGGC GAGGAAATCG
PeVYV-Bali CGCCCTGTCG TTGTGGTCGC ACCCCCTGGG CGCACACGGC GAGGAAATCG PeVYV-Taiw CGCCCTGTCG TTGTGGTCGC ACCCCCTGGG CGCACACGGC GAGGAAATCG PeVYVP-Tha CGCCCTGTCG TTGTGGTCGC ACCCCCTGGG CGCACACGGC GCGGAAATCG PeVYV-Indi CGCCCTGTCG TTGTGGTCAC ACCCCCTGGG CGCACACGGC GCGGAAATCG PeVYV-Phil CGCCCTGTCG TTGTGGTCGC ACCCCCTGGG CGCACACGGC GGGGAAATCG PeVYV-Japa CGCCCTGTCG TTGTGGTCGC ACCCCCTGGG CGCACACGGC GAGGAAATCG PeVYV-Mali CGCCCTGTCG TTGTGGTCGC ACCCCCTGGG CGCGCACGGC GCGGAAATCG PeVYV-Chin CGCCCTGTCG TTGTGGTCGC ACCCTCTGGG ACAGCACGGC GTGGAGGTCG PeVYV-Isra CGCCCTGTCG TTGTGGTCGC ACCCCCTGGG CGCACACGGC GGGGAAATCG Clustal Co ********** ******** * **** ***** ****** * *** *** ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
155 165 175 185 195 PeVYV-CWJ- AAGACGACGA AATGGAGGCC GGAACCGAAG AAGCCGAAAT AGAGTTGGAG
PeVYV-Bali AAGACGACGA AATGGAGGCC GGAACCGAAG AAGCCGAAAT AGAGTTGGAG PeVYV-Taiw AAGACGACGA AATGGAGGCA GGAACCGAAG AAGCCGAGAT AGAGTTGGAG PeVYVP-Tha AAGACGACGA AATGGAGGCA GGAACCGAAG AAGCCGAAAT GGAGTTGGAG PeVYV-Indi AAGACGACGA AATGGAGGCA GGAACCGAAG AAGCCGAAAT GGAGTTGGAG PeVYV-Phil AAGACGACGA AATGGAGGCA GGAACCGAAG AAGCCGAAAT AGAGTTGGAG PeVYV-Japa AAGACGACGA AATGGAGGCA GGAACCGAAG AAGCCGAAAT AGAGTTGGAG PeVYV-Mali AAGACGACGA AATGGAGGCA GGAACCGAAG AAGCCGAAAT GGAGTTGGAG PeVYV-Chin AAGACGACGA AGTGGAGGCC GGAACCGAAG AAGCCGAGAT GGAGTTGGAG PeVYV-Isra AAGACGACGA AGTGGAGGCA GGAACCGAA- ---AT AGAGTTGGAG Clustal Co ********** * ******* ********* ** *********
Lampiran 1 Hasil penjajaran sekuen nukleotida isolat virus asal Jawa Barat dengan isolat Pepper vein yellow virus asal Bali, Taiwan, Thailand, India, Filipina, Jepang, Mali, China, dan Israel menggunakan program CrustaslW.
Lampiran 2 Hasil penjajaran sekuen nukleotida isolat virus asal Jawa Barat dengan isolat Pepper vein yellow virus asal Bali, Taiwan, Thailand, India, Filipina, Jepang, Mali, China, dan Israel menggunakan program CrustaslW.
15
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
205 215 225 235 245 PeVYV-CWJ- GAAGGTCGAG CAACAGCGAA ACTTTCGTCT TCAACAAGGA CTCAATCAAG
PeVYV-Bali GAAGGTCGAG CAACAGCGAA ACTTTCGTCT TCAACAAGGA CTCAATCAAG PeVYV-Taiw GAAGGTCGAG CAACAGCGAA ACTTTCATCT TCAACAAGGA CTCAATCAAG PeVYVP-Tha GAAGGTCGAG CAACAGCGAA ACTTTCGTCT TCAACAAGGA CTCAATCAAG PeVYV-Indi GAAGGTCGAG CAACAGCGAA ACTTTCGTCT TCAACAAGGA CTCAATCAAG PeVYV-Phil GACGGTCGAG CAACAGCGAG ACTTTCATCT TCAACAAGGA CTCAATCAAG PeVYV-Japa GAAGGTCGAG CAACAGCGAA ACTTTCATCT TCAACAAGGA CTCAATCAAG PeVYV-Mali GAAGGTCGAG CAATAGCGAA ACTTTCATCT TCAACAAGGA CTCAATCAAG PeVYV-Chin GAAGGTCGAG CAACAGCGAG ACTTTCATCT TCAACAAGGA CTCAATCAAG PeVYV-Isra GAAGGTCGAG CAACAGCGAA ACTTTCATCT TCAACAAGGA CTCAATCAAG Clustal Co ** ******* *** ***** ****** *** ********** ********** ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
255 265 275 285 295 PeVYV-CWJ- GATAGTTCCT CAGGAGCTGT CACCTTCGGG CCGTCTCTAT CAGAGAGCAT
PeVYV-Bali GATAGTTCCT CAGGAGCTGT CACCTTCGGG CCGTCTCTAT CAGAGAGCAT PeVYV-Taiw GATAGTTCCT CAGGATCTGT CACCTTCGGG CCGTCTCTAT CAGAGAGCGT PeVYVP-Tha GATAGTTCCT CAGGAGCTGT CACCTTCGGG CCGTCTCTAT CAGAGAGCAT PeVYV-Indi GATAGTTCCT CAGGATCTGT CACCTTCGGG CCGTCTCTAT CAGAGAGCAT PeVYV-Phil GATAGTTCCT CAGGAGCTGT CACCTTCGGG CCGTCTCTAT CAGAGAGCAT PeVYV-Japa GATAGTTCCT CAGGATCTGT CACCTTCGGG CCGTCTCTAT CAGAGAGCGT PeVYV-Mali GATAGTTCCT CAGGAGCTGT CACCTTCGGG CCGTCTCTAT CAGAGAGCGT PeVYV-Chin GATGGTTCCT CAGGAGCTAT CACCTTCGGG CCGTCTCTAT CAGAGAGCGT PeVYV-Isra GATAGTTCCT CAGGAACTGT CACCTTCGGG CCGTCTCTAT CAGAGAGCAT Clustal Co *** ****** ***** ** * ********** ********** ******** * ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
305 315 325 335 345 PeVYV-CWJ- CGCGCTTTCA GGTGGAGTTC TCAAAGCCTA CCATGAATAT AAGATCACAA
PeVYV-Bali CGCGCTTTCA GGTGGAGTTC TCAAAGCCTA CCATGAATAT AAGATCACAA PeVYV-Taiw CGCGCTTTCA GGTGGAGTTC TCAAAGCCTA CCATGAATAT AAGATCACAA PeVYVP-Tha CGCGCTTTCA GGTGGAGTTC TCAAAGCCTA CCATGAATAT AAGATCACAA PeVYV-Indi CGCGCTTTCA GGTGGAGTTC TCAAAGCCTA CCATGAATAT AAGATCACAA PeVYV-Phil CGCGCTTTCA GGTGGAGTTC TCAAAGCCTA CCATGAATAT AAGATCACAA PeVYV-Japa CGCGCTTTCA GGTGGAGTTC TCAAAGCCTA CCATGAATAT AAGATCACAA PeVYV-Mali TGCGCTTTCA GGTGGAGTTC TCAAAGCCTA CCATGAATAT AAGATCACAA PeVYV-Chin CGCGCTTTCA GGTGGAGTTC TCAAAGCCTA CCATGAGTAT AAGATCACAA PeVYV-Isra CGCGCTTTCA GGTGGAGTTC TCAAAGCCTA CCATGAGTAT AAAATCACAA Clustal Co ********* ********** ********** ****** *** ** ******* ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
355 365 375 385 395 PeVYV-CWJ- TGGTCAACAT ACGCTTCGTC AGTGAATCCT CTTCCACAGC GGAGGGCTCC
PeVYV-Bali TGGTCAACAT ACGCTTCGTC AGTGAATCCT CTTCCACAGC GGAGGGCTCC PeVYV-Taiw TGGTCAACAT ACGCTTCGTC AGTGAATCCT CTTCCACAGC GGAGGGCTCC PeVYVP-Tha TGGTCAACAT ACGCTTCGTC AGTGAATCCT CTTCCACAGC GGAGGGCTCC PeVYV-Indi TGGTCAACAT ACGCTTCGTC AGTGAATCCT CTTCCACAGC GGAGGGCTCC PeVYV-Phil TGGTCAACAT ACGCTTCGTC AGTGAATCCT CTTCCACAGC GGAGGGCTCC PeVYV-Japa TGGTCAACAT ACGCTTCGTC AGTGAATCTT CTTCCACAGC GGAGGGCTCC PeVYV-Mali TGGTCAACAT ACGCTTCGTC AGTGAATCCT CTTCCACAGC GGAGGGCTCC PeVYV-Chin TGGTCAACAT ACGCTTCATC AGTGAATCCT CTTCCACAGC GGAGGGCTCC PeVYV-Isra TGGTTAATAT ACGCTTCGTC AGCGAATCCT CTTCCACAGC GGAAGGCTCC Clustal Co **** ** ** ******* ** ** ***** * ********** *** ****** ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
405 415 425 435 445 PeVYV-CWJ- ATCGCTTACG AGCTGGACCC CCACTGCAAG CTTACTAGTC TCCAATCCAC
PeVYV-Bali ATCGCTTACG AGCTGGACCC CCACTGCAAG CTTACTAGTC TCCAATCCAC PeVYV-Taiw ATCGCTTACG AGCTGGACCC CCACTGCAAG CTTACTAGTC TCCAATCCAC PeVYVP-Tha ATCGCTTACG AGCTGGACCC CCACTGCAAG CTTACTAGTC TCCAATCCAC PeVYV-Indi ATCGCTTACG AGCTGGACCC CCACTGCAAG CTTACTAGTC TCCAATCCAC PeVYV-Phil ATCGCTTACG AGCTGGACCC CCACTGCAAG CTTACTAGTC TCCAATCCAC PeVYV-Japa ATCGCTTACG AGCTGGACCC CCACTGCAAG CTTACTAGTC TCCAATCCAC
16
PeVYV-Mali ATCGCTTACG AGCTGGACCC CCACTGCAAG CTTACTAGTC TCCAATCCAC PeVYV-Chin ATCGCTTACG AGCTGGACCC CCACTGCAAG CTTACTAGCC TCCAATCCAC PeVYV-Isra ATCGCTTACG AGCTGGACCC CCACTGCAAG CTTACTAGTC TCCAATCCAC Clustal Co ********** ********** ********** ******** * ********** ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
455 465 475 485 495 PeVYV-CWJ- CCTGCGTAAA TTCCCCGTCA CCAAAGGCGG GCAAGCGACT TTTCGGGCTT
PeVYV-Bali CCTGCGTAAA TTCCCCGTCA CCAAAGGCGG GCAAGCGACT TTTCGGGCTT PeVYV-Taiw CCTGCGTAAG TTCCCCGTCA CCAAAGGCGG GCAAGCGACT TTTCGGGCTT PeVYVP-Tha CCTGCGCAAG TTCCCCGTCA CCAAAGGCGG GCAAGCGACT TTTCGGGCTT PeVYV-Indi CCTGCGCAAG TTCCCCGTCA CCAAAGGCGG GCAAGCGACT TTTCGGGCTT PeVYV-Phil CCTGCGTAAG TTCCCCGTCA CCAAAGGCGG GCAAGCAACG TTCCGGGCTT PeVYV-Japa CCTGCGTAAG TTCCCCGTCA CCAAAGGCGG GCAAGCGACT TTTCGGGCTT PeVYV-Mali CCTGCGCAAG TTCCCCGTCA CCAAAGGCGG GCAAGCGACT TTTCGGGCTT PeVYV-Chin CCTGCGTAAG TTCCCCGTCA CCAAAGGCGG GCAAGCTACG TTCCGGGCTG PeVYV-Isra CCTGCGCAAG TTCCCCGTCA CCAAAGGCGG GCAAGCGACC TTTCGGGCTT Clustal Co ****** ** ********** ********** ****** ** ** ****** ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
505 515 525 535 545 PeVYV-CWJ- CGCAGATTAA CGGGGTAGAG TGGCATGATA CATCCGAAGA TCAATTTAGG
PeVYV-Bali CGCAGATTAA CGGGGTAGAG TGGCATGATA CATCCGAAGA TCAATTTAGG PeVYV-Taiw CGCAGATTAA CGGGGTAGAG TGGCATGATA CATCCGAAGA TCAATTTAGG PeVYVP-Tha CGCAGATTAA CGGGGTAGAG TGGCATGATA CATCCGAAGA TCAATTTAGG PeVYV-Indi CGCAGATTAA CGGGGTAGAG TGGCATGATA CATCCGAAGA TCAATTTAGG PeVYV-Phil CGCAGATTAA TGGGATAGAG TGGCATGATA CATCCGAAGA TCAATTTAGG PeVYV-Japa CGCAGATTAA CGGGGTAGAG TGGCATGATA CATCCGAAGA TCAATTTAGG PeVYV-Mali CGCAGATTAA CGGGGTAGAG TGGCATGATA CATCCGAAGA TCAATTTAGG PeVYV-Chin CGCAGATTAA TGGGGTAGAG TGGCATGATA CAGCTGAAGA TCAATTTAGG PeVYV-Isra CGCAGATTAA TGGGGTAGAG TGGCACGATA CATCTGAAGA TCAATTCAGG Clustal Co ********** *** ***** ***** **** ** * ***** ****** *** ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
555 565 575 585 595 PeVYV-CWJ- CTGCTCTACA AAGGCAACGG GACGAAGAAC GTTGCCGCCG GTTNCTTCCA
PeVYV-Bali CTGCTCTACA AAGGCAACGG GACGAAGAAC GT-GCCGCCG GTTC--TCCA PeVYV-Taiw CTGCTCTACA AAGGCAACGG GACAAAGAAC GTTGCCGCCG GTTTCTTCCA PeVYVP-Tha CTGCTCTACA AAGGCAACGG GACGAAGAAC GTCGCCGCCG GTTTCTTTCA PeVYV-Indi CTGCTCTACA AAGGCAACGG GACGAAGAAC GTTGCCGCCG GTTTCTTTCA PeVYV-Phil CTGCTCTATA AAGGCAACGG AACAAAGAAC GTTGCCGCCG GTTTCTTCCA PeVYV-Japa CTGCTCTACA GAGGCAATGG GACGAAGAAC GTTGCCGCCG GTTTCTTCCA PeVYV-Mali CTGCTCTACA AAGGCAACGG GACGAAGAAC GTTGCCGCTG GTTTCTTTCA PeVYV-Chin CTGCTCTATA AAGGCAATGG AACGAAGAAC GTTGCCGCTG GATTTTTCCA PeVYV-Isra CTGCTCTATA AAGGTAACGG AACAAAAGGC GTTGCCGCTG GGTTTTTCCA Clustal Co ******** * *** ** ** ** ** * ** ***** * * * * ** ....|....| ....|....| ...
605 615 PeVYV-CWJ- GATCCNGTTT ACTGTGCAAT TGC PeVYV-Bali GATCCGGTTT TTTTTN---- --- PeVYV-Taiw GATCCGGTTC ACTGTGCAAT TGC PeVYVP-Tha GATCCGGTTT ACTGTGCAAT TGC PeVYV-Indi GATCCGGTTT ACTGTGCAAC TGC PeVYV-Phil GATCCGGTTC ACTGTGCAAT TGC PeVYV-Japa GATCCGGTTT ACTGTGCAAT TGC PeVYV-Mali GATCCGGTTT ACTGTGCAAT TGC PeVYV-Chin GATCCGGTAC ACAGTGCAAT TGC PeVYV-Isra AATCCGGTTT ACTGTGCAAC TGC Clustal Co **** ** *
17
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Pariaman pada tanggal 3 Maret 1992, anak pertama dari dua bersaudara dari pasangan Andrianus dan Zaharni. Pendidikan formal penulis yang telah ditempuh yaitu pendidikan Sekolah Dasar Negeri Panaragan III, Bogor periode tahun 1998-2004, kemudian penulis melanjutkan ke pendidikan SMP Taruna Andigha, Bogor periode tahun 2004-2007. Tahun 2010 penulis menamatkan Sekolah Menengah Atas di SMA Negeri 5 Bogor, dan pada tahun yang sama diterima di Institut Pertanian Bogor melalui Jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI).
Selama belajar di IPB, penulis aktif mengikuti kegiatan-kegiatan kemahasiswaan. Pengurus Himpunan Mahasiswa Proteksi Tanaman (Himasita) (2012-2013) dan aktif dalam kepanitiaan yang dilaksanakan Departemen Proteksi Tanaman maupun Fakultas Pertanian. Selain itu, penulis juga pernah menjadi asisten praktikum mata kuliah Ilmu Penyakit Tumbuhan Dasar (2014).
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Pertanian di Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor, penulis melaksanakan penelitian dengan judul Kloning dan Sequencing Gen Coat Protein Pepper vein yellow virus Penyebab penyakit Daun Merah pada Tanaman Wortel, dibimbing oleh Dr Ir Gede Suastika, MSc.
