III
OBJEK DAN METODE PENELITIAN
3.1 Objek Penelitian 3.1.1 TernakPercobaan
Objek yang digunakan dalam penelitian ini adalah ternak domba lokal jantan umur 2 tahun sebagai sumber penghasil sperma yang di tampung untuk diberi lima perlakuan. Domba yang digunakan ini adalah domba lokal yang dipelihara di kandang domba breeding station Fakultas Peternakans Universitas Padjadjaran, dengan jumlah satu ekor.
3.1.2 Peralatan yang Digunakan 1. Penampungan Semen
Peralatan yang digunakan saat penampungan adalah : satu set vagina, termometer, tabung penampung, air hangat dan vaselin
2. Evaluasi Semen SecaradanMikroskopis
Peralatan yang digunakan saat evaluasi semen secara mikroskopis adalah : mikroskop, cover glass, pipet hemacytometer, kamar hitung nebauer, pH meter, pembakar bunsen dan gelas objek
3. Pengenceran Semen
Peralatan yang digunakan saat pengenceran semen adalah : spuit, tabung reaksi, rak tabung, aluminium foil, beaker glass dan batang pengaduk.
4. Keutuhan Membran Plasma
Peralatan yang digunakan untuk mengevaluasi keutuhan membran plasma adalah mikroskop dan inkubator untuk menyimpan bahan selama 30 menit.
3.1.3. Bahan yang Digunakan 1. Penampungan Semen
Pada saat penampungan bahan yang digunakan yaitu air hangat dan hasil penampungan yaitu sperma.
2. Evaluasi Secara Mikroskopis
Pada evaluasi secara mikroskopis bahan yang digunakan yaitu : larutanNaCl fisiologis.
3. Pengenceran Semen
Pada saat pengenceran semen bahan yang digunakan yaitu : tris, kuningtelur, aquabides, fruktosa, asamsitrat, penicillin, streptomycin, dan madu. Madu yang digunakan adalah madu perhutani jenis randu, dengan komposisi dengan komposisi pada Tabel 1.
4. Keutuhan Membran Plasma
Bahan yang digunakan untuk pengamatan membran plasma utuh yaitu : fruktosa, Na Citrat, dan aquabidest.
3.2 Metode Penelitian
Metode penelitian yang digunakan adalah eksperimen.Metode eksperimen adalah metode penelitian yang digunakan untuk mencari pengaruh perlakuan tertentu terhadap yang lain dalam kondisi yang terkendalikan. Berdasarkan definisi tersebut dapat dipahami bahwa penelitian eksperimen adalah penelitian
yang dilakukan untuk mengetahui pengaruh pemberian suatu perlakuan terhadap objek penelitian.
3.2.1 Perlakuan Penelitian
Berikutperlakuan yang diberikan, yaitu :
P0 = Pengencer Tris – Kuning Telur (dengan fruktosa) + 0% madu dari total pengencer
P1 = Pengencer Tris - Kuning Telur (tanpa fruktosa) + 1% madu dari total pengencer
P2 = Pengencer Tris – Kuning Telur (tanpa fruktosa) + 2% madu dari total pengencer
P3 = Pengencer Tris – Kuning Telur (tanpa fruktosa) + 3% madu dari total pengencer
P4 = Pengencer Tris – Kuning Telur (tanpa fruktosa) + 4% madu dari total pengencer.
3.2.2 Prosedur Penelitian 1. Penampungan Sperma
1) Menyiapkan pemancing (domba betina) dan domba jantan (untuk ditampung spermanya).
2) Menyiapkan unit vagina buatan.
3) Mengisi satu unit vagina buatan dengan air hangat dengan suhu kurang lebih 40oC
4) Menampung sperma dari pejantan
5) Di bawa ke laboratorium untuk dievaluasi secara makroskopik dan mikroskopik.
2. Pemeriksaan Makroskopis
1) Volume semen dapat dilakukan dengan melihat skala yang tertera pada tabung penampung.
2) Pemeriksaan pH dilakukan dengan pemeriksaan menggunakan indikator pH.
3) Konsistensi semen dapat dilihat dengan memiringkan tabung penampung semen lalu menegakannya kembali. Bila jatuhnya semen lambat maka konsistensinya tinggi.
4) Warna dapat dilihat dengan memperhatikan warna semen dan diperhatikan apakah ada kelainan pada semen seperti warna merah akibat kontaminasi darah atau warna hijau akibat kontaminasi kotoran.
3. Pemeriksaan mikroskopik : 1) Gerakan massa sperma
Gerakan massa spermatozoa dapat dilihat dengan meletakan satu tetes semen pada gelas objek, kemudian diamati dibawah mikroskop dengan pembesaran 10 x 10.
2) Perhitungan konsentrasi spermatozoa total menggunakan Haemacytometer dan Kamar Hitung Neubauer. Isap semen yang belum diencerkan dengan menggunakan pipet erythrocyt sampai dengan tanda 0,5. Kemudian isap NaCl 3% sampai tanda 101. Setelah itu dengan hati- hati gerakan pipet membentuk angka 8 selama 2- 3 menit.
Buang beberapa tetesan cairan dari pipet kemudian masukan 1 tetes melalui celah ke dalam kamar hitung Neaubauer yang sudah dipasangi gelas penutup (cover glass) di atasnya. Kemudian hitung jumlah sel spermatozoa dalam 5 kamar dihitung melalui arah diagonal
dibawah mikroskop dengan perbesaran 10 x 45. Perhitungan konsentrasi spermatozoa dapat dilakukan dengan menggunakan rumus :
X x (400/80) x 10 x 200
= 10.000 x spermatozoa/mm3 atau
= X x 107 spermatozoa/ml semen 3) Motilitas Spermatozoa
Dihitung melalui perhitungan konsentrasi sperma total dan konsentrasi sperma mati dengan meletakan satu tetes semen pada kamar hitung Neubauer. Cara perhitungan konsentrasi sperma mati sama dengan menghitung konsentrasi sperma total, tetapi larutan yang dihisap adalah NaCl fisiologis. menggunakan perhitungan sebagai berikut :
Keterangan : Y= Motilitas Sperma.
4) Keutuhan Membran Plasma
Standar kualitas spermatozoa beku yaitu mempunyai nilai MPU diatas 30% (Evan dan Maxwell, 1987). MPU ditentukan dengan menghitung persentase spermatozoa yang memiliki membran plasma utuh dengan metode hypoosmotic swelling test, larutan HOST dibuat menurut (Saemi dkk, 2012), dengan menggunakan bahan NaCl 0,0032 M (0,173 mg NaCl dilarutkan dalam 100 ml aquadest). Sebanyak 0,1 ml semen ditambahkan dengan 0,5 ml larutan HOST. Untuk mengamatinya membuat preparat ulas tipis pada gelas objek dan
dievaluasi menggunakan mikroskop dengan jumlah minimum 200 spermatozoa.
4. Perhitungan Kebutuhan Pengencer
Setelah melakukan pemeriksaan secara makroskopik dan mikroskopik, semen yang memenuhi syarat, segera dicampur dengan larutan pengencer.
Caramenghitung volume pengencer yang digunakanberdasarkan volume dankualitas semen yang di dapatdenganrumus :
1) Perhitungan jumlah dosis
2) Perhitungan volume pengencer dan semen VPS= Jumlah dosis x Volume inseminasi 3) Volume pengencer yang ditambahkan
VP = (Volume pengencer dan semen) – (Volume semen) 5. Pengenceran Sperma
Saat dilakukan pengenceran semen ini, semen segar yang telah dikoleksi dan dievaluasi dibagi menjadi lima bagian untuk kemudian dicampur dengan pengencer tris-kuning telur. Kemudian saat ditambahkan madu, masing-masing bagian diberikan level madu yang berbeda yaitu : 0%, 1%, 2%, 3%, dan 4%.
Prosedur pembuatan pengencer Tris-Kuning Telur Ditambah Madu sebagai berikut :
1) Menimbang 3,634 gram kristal Tris (hydroxymethyl) aminomethane;
1,99 gram Asam Sitrat Monohidrat dan fruktosa 0,5 gr. Ketiga bahan tersebut dimasukan ke dalam labu ukur 100 ml yang bersih.
Tambahkan aquabidestilata steril sampai mencapai 100 ml.
Pindahkan larutan ke dalam labu Erlenmeyer 100 ml dan tutup dengan aluminium foil atau paraffin film. Penggunaan fruktosa hanya dilakukan satu kali pada saat belum dicampur dengan madu.
2) Mencampurkan 20% kuning telur dengan larutan Tris – fruktosa – asam sitrat dalam beaker glass 100 ml, kemudian aduk secara perlahan-lahan hingga homogen.
3) Menambahkan 100.000 IU penicillin dan 100 mg streptomycin ke dalam larutan Natrium Sitrat kuning telur (1000 IU penicillin dan 1 mg streptomycin untuk setiap milliliter pengencer).
4) Selanjutnya menutup beaker glass menggunakan alumunium foil atau paraffin film.
5) Larutan pengencer Tris-Kuning telur siap digunakan.
6) Berikutnya melakulan pemisahan terhadap semen yang di dapat saat penampungan secara merata pada setiap tabung yang terdiri dari 5 tabung sesuai perlakuan dari penelitian.
7) Selanjutnya melakuan pemcampuran semen dengan larutan pengencer Tris Kuning telur untuk perlakuan ke 0.
8) Untuk perlakuan 1 sampai 4 pencampuran dilakuan terhadap semen menggunaka pengencer Tris kuning telur tanpa fruktosa yang diganti dengan madu pada berbagai level yang berbeda yaitu : 0%, 1%, 2%, 3%, dan 4%. Volume pengencer yang digunakan didapat dari hasil perhitungan berdasarkan volume dan kualitas semen segar yang didapat saat penampungan.
9) Lakukan pengamatan terhadap daya tahan hidup dan keutuham membran plasma, sampai sperma mati.
3.3 Variabel yang Diamati
Variabel yang diamati dalam penelitian ini adalah : 1. Daya Hidup Sperma
Daya tahan hidup semen dapat dihitung dengan satuan waktu (jam), untuk menentukan daya tahan hidup sperma dapat menggunakan data motilitas semen.
Motilitas dapat dihitung melalui pengurangan antara konsentrasi spermatozoa total dengan konsentrasi spermatozoa mati dibagi konsentrasi spermatozoa total dikali 100%. Motilitas ini diamati secara berkala setiap 12 jam sekali setelah dicampur dengan pengencer, apabila motilitas sudah mendekati angka 40% maka pengamatan dilakukan lebih intensif sampai seluruh sperma mati. Nilai 40%
merupakan batas minimal motilitas progresif yang layak digunakan untuk Inseminasi Buatan.
2. Keutuhan Membran Plasma
Evaluasi keutuhan membran plasma dilakukan dengan metode hypoosmotic swelling test (HOS test) menggunakan larutan hipoosmotik. Standar spermatozoa beku memiliki nilai MPU > 30% (Evan dan Maxwell, 1987) Spermatozoa yang memiliki membran plasma utuh ditandai dengan ekor yang membengkak, melingkar, dan menggembung akibat terpapar larutan hipotonis (Rusdin, 1997).
Spermatozoa yang membran plasmanya tidak utuh ditandai dengan bentuk ekor yang lurus. Perhitungan membran plasma utuh dapat dilakukan dengan rumus :
3.4. Rancangan Percobaan dan Analisis Data
Penelitian dilakukan dengan metode eksperimental. Rancangan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan 5 perlakuan. Masing- masing perlakuan diulang 4 kali, sehingga didapat 20 unit percobaan
Data kemudian di uji dengan sidik ragam. Apabila H1 diterima maka diadakan uji lanjut untuk mengetahui pada perlakuan mana yang lebih signifikan atau yang memberikan hasil paling baik dengan uji jarak berganda Duncan.
Adapun model matematika dan rancangan yang digunakan, yaitu : Yij = µ + αi + εij
Keterangan :
Yij : Respon yang memperoleh perlakuan ke-i, ulangan ke-j.
µ : Nilai tengah populasi αi : Pengaruh perlakuan ke-i εij : Pengaruh komponen galat i : Pengaruh ke-I (1,2,3,4) j : Ulangan ke-j (1,2,3,4,5)
Asumsi yang digunakan pada analisis ini adalah :
Nilai εij menyebar normal dan bebas satu sama lain. Nilai harapan (εij) sama dengan nol, (εij) = σ2 merupakan ragam dari pengaruh pengacakan adalah σ2, jadi εij = NID (0, σ2) adalah nilai tengah sama dengan nol dan ragam harapan σ2.Pengaruh perlakuan bersifat tetap.
Tabel 2. Daftar Sidik Ragam
Sumber keragaman DB JK KT Fhit F tabel0,05
Perlakuan (P) (t-1) JKP KTP KTP/KTG
Galat t(r-1) JKG KTG
Total (tr-1) JKT
Hipotesis :
H0 : Pengaruh perlakuan R0 = R1 = R2 = R3 = R4
H1 : Pengaruh perlakuan R0 ≠ R1 ≠ R2 ≠ R3 ≠ R4 atau paling sedikit ada sepasang perlakuan yang tidak sama.
Kaidah keputusan :
1. Jika Fhitung ≤ F tabel 0,05 artinya tidak berbeda nyata (non significant), terima H0
dan tolak H1.
2. Jika Fhitung> F tabel 0,05 artinya berbeda nyata (significant), tolak H0 dan terima H1.
Apabila hasil yang diperoleh berbeda, maka dilakukan uji lanjut dengan menggunakan uji jarak berganda Duncan dengan rumus :
Keterangan :
Standar error
Least Significant Range
Significant Studentiezed Range Kuadrat Tengah Galat
Ulangan Perlakuan
Selisih antar perlakuan (d) dibandingkan dengan LSR :
Jisa kelisih antara perlakuan d≤ LSR , berarti tidak berbeda nyata.
Jika selisih antara perlakuan d > , berarti berbeda nyata atau sangat nyata.
