Bioreaksi pada buah pisang docx

LAPORAN

PRAKTIKUM BIOREAKSI

METABOLISME PROTEIN PADA PEMATANGAN BUAH PISANG

Disusun Oleh:

Denok Risky Ayu Paramita 101810301015

Luluk Masnia 101810301032

Binti Risalatul Muawanah 101810301033

LABORATORIUM BIOKIMIA JURUSAN KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS JEMBER

I. Judul

Metabolisme Protein Pada Pematangan Buah Pisang

II. Tujuan

 Mempelajari proses bioreaksi yang terjadi pada pematangan buah pisang. III. Dasar Teori

Pisang Ambon yang masak mempunyai komposisi kimia antara lain adalah: kadar gula 88,28%, gula reduksi 5,44%, sukrosa 1,05%, pati 0,84%, protein 0,68%, pektin 0,93%, protopektin 0,21%, lemak 0,53%, serat kasar 1,28%, dan abu 1,33%. Metabolisme protein dalam pemasakan buah pisang dapat diketahui berdasarkan kadar enzim yang berperan dalam proses pematangan buah pisang. Kadar protein yang dimaksud adalah jumlah total enzim yang berperan dalam proses pemasakan buah pisang.

Pemasakan buah pisang adalah suatu proses biokimia yang bersifat degradasi dan sintesis. Kedua proses biokimia ini terjadi baik di kulit maupun di daging buah. Proses biokimia yang terjadi pada kulit pisang menyebabkan perubahan tekstur buah sehingga buah menjadi lunak. Pada kulit pisang, senyawa yang mengalami degradasi adalah senyawa pektin, selulosa, hemiselulosa dan klorofil. Senyawa pada daging buah yang mengalami perubahan kimiawi adalah amilum. Amilum diubah menjadi glukosa dan fruktosa melalui proses metabolisme dengan bantuan enzim-enzim.

Perubahan utama yang terjadi pada pematangan daging buah pisang yaitu berkurangnya pati dan bertambahnya kadar gula total dalam bentuk glukosa, fruktosa, dan sukrosa. Degradasi amilum menjadi kadar gula ini disebabkan oleh enzim-enzim yang berperan dalam penimbunan sukrosa di sitosol. Kenaikan akumulasi sukrosa berkorelasi dengan aktivitas enzim sukrosa fosfat sintase, enzim sukrosa sintase dan enzim invertase.

Elektroforesis merupakan metode pemisahan untuk karakterisasi makromolekul, berat molekul, dan penetapan kemurnian protein. Teknik ini didasarkan atas pergerakan molekul- molekul seperti DNA, RNA, dan protein yang bermuatan dalam suatu medan listrik. SDS-PAGE merupakan salah satu teknik ektroforesis yang menggunakan poliakrilamida sebagai bahan pemisahan. Prinsip kerja dari teknik SDS-PAGE yaitu membuat sampel analisis bermuatan sama sehingga muatan tidak memengaruhi pergerakan komponen sampel dalam gel. Pemisahan sampel dilakukan dengan memasukkan sampel dalam sumur gel dan akan melewati matriks gel berdasarkan berat molekulnya dalam suatu medan listrik. - Beaker Glass 150 mL 4 buah - Beaker glass 1000 mL 1 buah - Sentrifuge

- Pipet Tetes 3 buah

- Ball pipet 1 buah

- Corong 1 buah

- Erlenmeyer 150 mL 2 buah - Erlenmeyer 50 mL 1 buah - Erlenmeyer 1000 mL 1 buah - pH meter

- Wadah botol atau tabung eppendrof 3 buah - Aparatus elektroforesis horizontal 1 set - Cetakan gel 20x16x1 cm3 1 buah - Pembungkus plastik setengah matang dengan kulit buah kuning dan teksturnya keras, dan matang dengan warna kulit buah kuning dan tekstur lunak

- Ammonium Sulfat - Larutan NaCl 5% - Aquades

- Aquademin

- Larutan Buffer Tris-HCl pH 7 - Larutan 2M Buffer Tris-HCl pH 8,8 - Larutan 1M Buffer Tris-HCl pH 6,8 - Larutan SDS 10%

- Amonium persulfat (senyawa radikal yang mempolimerisasi gel poliakrilamid)

- Larutan sigmacote atau vaselin - Larutan Comassie gel staining 1 Liter - Larutan Comassie blue gel staining 1 Liter - Larutan Resolving gel/gel bawah

- Larutan Stacking gel/ gel atas

4.3 Metode Percobaan

Metode percobaan yang dilakukan pada praktikum bioreaksi protein pada pemasakan daging buah pisang ambon ini antara lain:

a. Penyiapan bahan

b. Penyiapan dan perlakuan sampel c. Pemisahan enzim

d. Pengukuran BM enzim dengan elektroforesis

a. Penyiapanbahan 1. Pemilihan bahan

Buah pisang yang dipilih adalah buah pisang yang mentah dengan tekstur keras, setengah matang dengan kulit buah kuning dan teksturnya keras, dan matang dengan warna kulit buah kuning dan tekstur lunak

2. Membuat larutan 600 mL NaCl 5%. Selanjutnya diletakkan dalam lemari es.

3. Membuat 500 ml larutan buffer Tris-HCL. a. Pengenceran Tris

- Ditimbang 0,6 gr Tris lalu dimasukkan ke dalam beker glass. - Diencerkan menjadi 50 mL dengan aquades.

b. Pengenceran HCl

- Diambil 1,98 mL HCl 12,6 M. - dimasukkan ke dalam beker glass.

- Diencerkan menjadi 250 mL dengan aquades. c. Pembuatan Buffer

- Ditambahkan dengan larutan HCl 0,1 M sampai menunjukkan pH yang diinginkan yaitu pH 7.

b. Penyiapan sampel dan perlakuan sampel

1. Buah pisang dikupas dan dipisahkan dari kulit buah pisang. 2. Diambil daging buah pisang secukupnya

3. Daging buah dipotongkecil dan ditambahkan larutan NaCl 5% dingin dengan perbandingan (1:9) kemudian diblender sampai mencair dan halus. Proses ini perlu dijaga jangan sampai suhu meningkat diatas 10o_C.

4. Cairan hasil blender, didiamkan sampai terbentuk dua fase (bagian endapan dan larutan).

5. Larutan dari slory di sentrifuse kecepatan max 4000 rpm selama max 20 menit.

c. Pemisahan enzim

1. Pemisahan enzim berdasarkan BM

Pemisahan enzim didasarkan BM yang mengendap dalam medium amonium sulfat.

2. Pemisahan enzim dalam medium (NH4)2SO4 18%, dilakukan dengan cara sentrifugasi supernatan (kecepatan 8000rpm selama20 menit). 3. Pelet 1 yang dihasilkan dicuci dengan buffer Tris-HCl.

4. Supernatan 1 dipindahkan kedalam tabung dan ditambah lagi (NH4)2SO4 menjadi 28% kemudian disentrifugasi kembali (kecepatan 8000rpm selama 20 menit).

5. Pelet 2 yang dihasilkan dicuci dengan buffer Tris-HCL.

d. Analisis enzim dengan elektroforesis A. Menyiapkan Bahan Kimia

a. Preparasi2M Tris-HCl (pH 8,8)

 Campurkan ke dalam beaker glass 24,2 gramTris dan 50 mL aquademin.

 Masukkan dalam gelas beaker dan ukur pH larutan dengan pH meter sambil diaduk dengan stirrer.

 Tambahkan beberapa mL HCl sampai pH larutan sama dengan 8,8.

 Campurkan ke dalam beaker glass 12,1 gramTris dan 50 mL aquademin.

 Masukkan dalam gelas beaker dan ukur pH larutan dengan pH meter sambil diaduk dengan stirrer.

 Tambahkan beberapa mL HCl sampai pH larutan sama dengan 6,8.

c. Larutan akrilamida

 Campurkan ke dalam beaker glass 29,2 gram akrilamida dan 0,8 bis akrilamida.

 Larutkan dengan menambahkan aquademin sampai total volumenya 100 mL.

d. Larutan B (separating gel buffer)

 Campurkan 75 mL 2M tris-HCl (pH 8,8), 4 mL 10% SDS

 Campurkan 3 gram tris, 14,4 gram glisin, dan 1 gram SDS

 Larutkan dengan menambahkan aquademin sampai total volumenya 1 mL.

g. Buffer untuk sampel

 Campurkan 0,6 mL 1M tris HCl (pH 6,8), 5 mL gliserol, 2 mL SDS, 0,512 mercapthenol, dan 1 mL 1% bromfenol blue

 Larutkan dengan menambahkan aquademin sampai total volumenya 10 mL.

h. Comassie gel staining

 Larutkan 1 gram comassie, 450 mL methanol, 450 aquademin, dan 100 mL asam asetat hingga diperoleh total volume1 L.

i. Comassie blue gel destain

 Campurkan 100 mL methanol, 100 mL asam asetat, dan 800 mL hingga diperoleh total volume1 L.

 Campurkan aquademin 1,67 mL, 1,25 mL larutan tris-HCl (pH 8,8) (larutan B), 0,05 mL 10% SDS, 2mL akrilamida bis (larutan A), 50 µL 10 % ammonium persulfat, dan 5 µL TEMED

k. Stacking gel/gel atas

 Campurkan aquademin 1,525 mL, 0,625 mL larutan tris-HCl (pH 6,8) (larutan C), 0,325 mL akrilamida (larutan A), 0,025µL 10% SDS, 50 µL 10 % ammonium persulfat, dan 5 µL TEMED

B. Preparasi Sampel

a. Larutan sampel dilarutkan dalam Tris-HCl buffer yang mengandung SDS sesuai dengan kebutuhan.

b. Tambahkan buffer sampel dengan perbandingan sesuai kemampuan sumur (20µL-40µL) per sumur

c. Tunggu selama 10 menit

C. Prosedur Pembuatan Gel Elektroforesis

a. Membersihkan semua peralatan elektroforesis dengan menggunakan etanol, lap dengan tisu jangan sampai ada bekas minyak atau debu yang menempel

b. merangkai alat elektroforesis serta mengetes dengan aquades sehingga tidak terjadi kebocoran

c. Menyiapkan bahan kimia serta sampel yang akan diinjekkan

d. Mencampur sampel dengan buffer sampel yang telah disiapkan dengan konsentrasi persampel 20µL-40µL

e. Membuat resolving gel (gel bawah) dengan komposisi yang telah ditetapkan

f. Menunggu gel bawah sampai benar-benar kering dan kuat selama ±30 menit

g. Setelah gel bawah terbentuk, dilanjutkan dengan membuat gel atas dengan komposisi seperti diatas

h. Menunggu selama ±30 menit agar gel atas terbentuk i. Setelah gel atas dan bawah terbentuk isi sumur

j. Menginjek sumur-sumur dengan sampel dan standar yang telah diketahui kadar proteinnya dengan volume 20µL-40µL

k. Memasukkan buffer elektroforesis ke dalam tendon secara hati-hati sehingga sumur terisi buffer elektroforesis

m. Menjaga agar selama proses running sampel tidak sampai hanyut ke dalam buffer elektroforesis

n. Menghentikan proses running, melepas sumber arus listrik, mengeluarkan buffer elektroforesis, dan membongkar peralatan o. Melepas gel dari kaca secara hati-hati dengan memasukkan ke

dalam aquades

p. Melakukan pewarnaan gel dengan commasie blue staining selama 3-5 menit

q. Mencuci dengan aquademin 2-3 kali

r. Menghilangkan warna dengan larutan destaining yang telah dibuat selama 2-3 kali

s. Membiarkan gel di dalam larutan destaining selama 24 jam sambil digoyang-goyang

Dipotong kecil-kecil Ditambah larutan NaCl 5% Diblender

Didiamkan Disentrifuse

Supernatan

Pelet

Ditambahkan Ammonium sulfat 18% Disentrifuse

Supernatan 1

Pelet 1

Ditambahkan Ammonium sulfat 28% Disentrifuse

Supernatan 2

Pelet 2 Cara membuktikan:

Daging Buah Pisang

V. Pembahasan

Sampel yang digunakan dalam percobaan ini didasarkan pada perbedaan tingkat kematangan buah pisang yang dapat dilihat dari warna kulit buah pisang. Perbedaan tingkat kematangan akan mengindikasikan perbedaan bioreksi di dalamnya. Pisang yang digunakan adalah pisang gajih mentah (warna kulit buah hijau), setengah matang (warna kulit buah hijau kekuningan), dan matang (warna kulit buah kuning).

Gambar 1. Pisang yang digunakan pada percobaan

Gambar 2. proses pemblenderan buah pisang

Enzim yang terdapat pada buah pisang diisolasi dengan cara sentrifuge. Pada proses sentrifuge akan dihasilkan ekstrak kasar dari enzim. Pemurnian enzim dilakukan melalui fraksinasi bertahap menggunakan ammonium sulfat. Tujuan pemurnian bertahap ini adalah untuk dapat menghasilkan enzim yang tingkat kemurniannya semakin tinggi.

Gambar 3. Proses penyaringan, filtrat yang dihasilkan, dan proses sentrifugasi Proses sentrifugasi menghasilkan pelet dan supernatan. Supernatan ditambahkan amonium sulfat18% sebagai medium pengendap enzim – enzim yang terdapat pada daging buah pisang.Amonium sulfat(NH4)2SO4menyebabkan larutan enzim mengalami peristiwa salting out yaitu daya larut dari protein berkurang sehingga enzim terpisah sebagai endapan.Kemudian larutan disentrifuse kembali dengan kecepatan 8000 rpmselama 20 menit. Sentrifuse akan menghasilkan supernatan 1 dan pelet 1. Supernatan 1 diambil dan disisihkan. Pelet 1 yang ada di dinding tabung sentrifuse diambil dengan cara dikerok dengan spatula dan dilarutkan dalam buffer tris-HCl. Pelet 1 disimpan dalam lemari es agar enzim tidak rusak dan digunakan untuk analisis selanjutnya. Gambar pelet 1adalah sebagai berikut:

terdispersi. Hasil yang diperoleh yakni supernatan 2 dan pelet 2. Pelet 2 dilarutkan dalam buffer Tris-HCl serta disimpan dalam lemari es untuk analisis selanjutnya.

Gambar 5. Pelet 2 sampel pisang mentah, setengah matang, dan matang Analisis enzim yang terdapat dalam buah pisang dilakukan dengan teknik elektroforesisSDS-PAGE (SodiumDodecyl Sulfate–PolyacrylamidaGel

Electrophoresis). Prinsip dasar dari metode ini yaitu pemisahan protein melalui

gel poliakrilamida dengan menyeragamkan muatan protein terlebih dahulu sehingga migrasi protein tidak dipengaruhi besarnya muatan, namun didasarkan pada ukuran dan berat molekulnya.

Gambar 6. Proses preparasi sampel

Langkah awal dari karakterisasi ini adalah membuat gel elektroforesis. Gel elektroforesis befungsi sebagai matriks penyangga untuk mencegah terjadinya difusi akibat timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Gel poliakrilamida dibuat dari polimerisasi acrilamida dan bis-akrilamida. Bis-akrilamida berperan sebagai cross-linking agent sehingga larutan akrilamida membentuk gel. Besarnya pori-pori gel bergantung pada konsentrasi akrilamida dan bis akrilamida yang digunakan. Semakin besar konsentrasi bis-akrilamida maka semakin kecil ukuran pori-pori gel. Perbandingan konsentrasi ini merupakan perbandingan yang standar dan sesuai antuk analisis protein enzim.

Gel poliakrilamida (PAGE) yang sudah dibuat dicampur dengan suatu detergen anion sodium dodesil sulfat (SDS). Penggunaan poliakrilamida mempunyai keunggulan dengan gel lainnya, karena tidak bereaksi dengan sampel dan tidak membentuk matrik dengan sampel, sehingga tidak menghambat pergerakan sampel yang memungkinkan pemisahan protein secara sempurna, selain itu mempunyai daya pemisahan yang cukup tinggi.

Gel elektroforesis terdiri dari gel atas (stacking gel) dan gel bawah

(resolving gel). Stacking gel terletak pada bagian atas, digunakan untuk mencetak

akrilamida. Gel bawah ditambah bis akrilamida yang berfungsi sebagai

cros-linking agent pada gel dan memiliki komposisi akrilamida yang lebih banyak. Gel

poliakrilamidadibuat menggunakan cetakan gel membentuk lembaran segiempat dengan ketebalan tertentu.

Gambar 7. Proses pembuatan gel poliakrilamida

Sampel protein dimasukkan pada sumur-sumur di gel bagian atas, menggunakan pipet mikro dengan volume injeksi 20-40 µL. Penginjeksian sampel harus dilakukan pada posisi tengah agar sampel tidak masuk pada sumur disebelahnya.

Gambar 8. Proses penginjekkan sampel

Gambar 9. Proses penambahan buffer

Selanjutnya dilakukan proses running untuk memulai proses elektroforesis.

Gambar 10. Proses running

dilepas,mengeluarkan buffer elektroforesis, dan membongkar peralatan. Selanjutnya melepas gel dari kaca secara hati-hati dengan memasukkan ke dalam aquades.

Gambar 11. Proses

pelepasan gel dari

kaca

Gel yang telah

dilepaskan selanjutnya

dilakukan pewarnaan

menggunakan commasie blue staining selama 3-5 menit. Tujuan penambahan commasie blue stainingadalah untuk memvisualisasi enzim hasil elektroforesis.Commassieblue stainingakan terikat pada protein dan membuat bagian gel yang berisi fraksi protein akan berwarna biru. Gel tersebut direndam dalam larutan pewarna selama 3-5 menit sambil digoyang-goyang:

Gambar 12. Proses pewarnaan gel

Gambar 13. Proses pencucian warna pada gel dan proses penggoyangan Setelah 24 jam dilakukan perendaman, tahapan terakhir adalah melakukan pembacaan pita protein yang tampak (menandakan sub unit atau fraksi protein).

Hasil percobaan menunjukkan spot yang terlihat jelas adalah spot dari sampel BSA. Hasil ini kurang sesuai dengan yang diharapkan karena spot untuk sampel dari pelet daging pisang dan beberapa sampel protein (putih telur dan glisin) tidak dapat terdeteksi. Indikasi ketidaksesuaian hasil percobaan adalah pada gel yang digunakan. Hal ini dikarenakan, sampel menunjukkan hasil uji

positif terhadap reagen biuret.

Gambar 14. Hasil pengujian dengan biuret

karena menentukan besar pori-pori matriks gel, makin tinggi konsentrasi gel maka pori yang terbentuk semakin kecil.

Gambar 15. Spot BSA pada gel poliakrilamida

Komposisi akrilamida dan bis-akrilamida sangat mempengaruhi besarnya pori-pori gel poliakrilamida yang terbentuk. Berdasarkan hasil spot yang diperoleh, dapat diketahui bahwa komposisi akrilamida dan bis-akrilamida yang digunakan kurang sesuai untuk sampel yang digunakan. Hal ini dikarenakan, tidak terbentuk spot pemisahan dari sampel ekstrak enzim daging pisang dan sampel

yang mengandung protein (putih telur dan glisin). Apabila diamati dari kondisi sekitar sumur, terdapat warna biru di dasar sumur. Hal ini menunjukkan bahwa terdapat sampel protein di tempat masuknya sumur. Spot sampel tidak terdapat dalam gel karena ukuran pori-pori gel terlalu kecil sehingga sampel protein tidak dapat menembus pori dari del poliakrilamida. Ukuran BSA yang kecil (berat molekul 66 kDa) menyebabkan BSA dapat masuk ke dalam dan membentuk spot dalam gel. Dengan demikian, diperlukan komposisi akrilamid dan bis-akrilamida yang sesuai dengan ukuran dari sampel yang akan di analisis agar spot yang terbentuk dapat diidentifikasi dan dibedakan dengan jelas.

VI. Kesimpulan

Beberapa kesimpulan yang diperoleh dalam percobaan ini diantaranya:

1) Pemurnian enzim pada buah pisang dilakukan dengan fraksinasi bertingkat pada medium amonium sulfat.