I. Tujuan Menentukan berat molekul protein dengan fraksinasi (NH 4 ) 2 SO 4 Teori Dasar

I. Tujuan

Menentukan berat molekul protein dengan fraksinasi (NH4)2SO4

II. Teori Dasar

Penamabahan garam pada konsentrasi rendah dapat meningkatkan kelarutan protein (salting in). tetapi protein akan mengalami presipitasi garam pada konsentrasi tinggi (salting out). Garam yang biasa digunakan adalah ammonium sulfat, sodium sulfat, dan sodium klorida, pada peristiwa salting out protein akan mengalami dehidrasi akibat ppenambahan garam. Ion garam akan menarik molekul air yang melarutkan protein sehingga protein menjadi tidak larut. Pada percobaan ini akan dilakukan pemisahan protein dengan cara penambahan garam ammonium sulfat jenuh. SDS-PAGE merupakan suatu teknik elektroforesis yang menggunakan polyacrylamide sebagai bahan pemisah. SDS-PAGE banyak digunakan dalam praktikum biologi molekuler, genetik, biokimia, dan biomedik. SDS-PAGE biasanya digunakan untuk memisahkan protein berdasarkan sifat electrophoretic mobility (pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasi dan berat molekulnya (BM) dalam sebuah medan listrik). Protein yang dipisahkan dengan SDS-PAGE dapat dikarakterisasi berdasarkan berat molekulnya dengan satuan Kilo Dalton (kDa). Satu dalton sama dengan satu hidrogen molekul. SDS-PAGE merupakan teknik purifikasi skala kecil yang menghasilkan pemisahan suatu protein berdasarkan berat molekulnya dalam band (pita) spesifik yang tampak pada gel polyacrylamide. Teknik purifikasi dalam skala besar kita dapatkan degnan menggunakan chromatography. Gel acrylamide alam SDS-PAGE diletakkan diantara dua plat kaca. Ada dua macam gel yang digunakan, yaitu main atai separating gel dan stacking gel. Main gel merupakan gel yang komposisinya paling banyak dan terletak dibagian bawah alat. Main gel berfungsi untuk memisahkan protein berdasarkan berat molekulnya. Stacking gel terletak pada bagian atas, digunakan untuk mencetak sumuran (sekat pemisah untuk penempatan sempel). Protein tertarik ke bagian bawah oleh arus listrik. Protein yang memiliki berat molekul paling kecil bergerak cepat sehingga tertarik sampai bagian bawah gel, sedangkan protein yang memiliki berat molekul paling besar akan berada pada bagian atas dari gel. Protein marker digunakan sebagai standart untuk menentukan berat molekul dari sampel

III. Data Pengamatan

a. Komposisi gel elektroforesis  Stacking gel 5 % H2O 1,452 mL 40% akrilamid 255 µL 1,5 M Buffer tris pH 250 µL 10% SDS 20 µL 10 % APS 20 µL 5 % TEMED 3 µL

 Separating gel 10 % H2O 2,325 mL 40% akrilamid 1,275 mL 1,5 M Buffer tris pH 8,8 1,3 mL 10% SDS 50 µL 10 % APS 50 µL 5 % TEMED 5 µL b. Marker

Berat (kDa) Jarak tempuh(cm)

14.4 8 18.4 7 25 6 35 5 45 5 66.2 3 116 2

c. Gel jarak tempuh (cm) (fraksi 0-20%) jarak tempuh(cm) (fraksi 20-50%) jarak tempuh(cm) (fraksi 50-70%) 1.4 1.4 6.4 2.73 2.1 4.5 3.3 4.7 4 6.3 6.3 IV. Perhitungan a. Marker MARKER

kDa logkDa jarak tempuh(cm)

14.4 1.158362 8 18.4 1.264818 7 25 1.39794 6 35 1.544068 5 45 1.653213 4 66.2 1.820858 3 116 2.064458 2

b. Berat setiap fraksi

Dari persamaan y = -0.1459x + 2.2873 maka akan didapatkan berat dari tiap fraksi, dengan mensubtitusi jarak tempuh (x) kedalam persamaan tersebut.

FRAKSI 0-20% FRAKSI 20-50 % FRAKSI 50-70% jarak

tempuh

log kDa massa kDa jarak tempuh

logkDa massa kDa jarak tempuh

log kDa massa kDa 1.4 2.08304 121.0709639 1.4 2.08304 121.0709639 6.4 1.35354 22.570439 2.73 1.888993 77.44493151 2.1 1.98091 95.699573 4.5 1.63075 42.7316832 3.3 1.80583 63.9484467 4.7 1.60157 39.95489558 4 1.7037 50.54753714 6.3 1.36813 23.34156655 6.3 1.36813 23.34156655 V. Pembahasan

Elektroforesis merupakan suatu proses bergeraknya molekul yang bermuatan didalam suatu medan listrik dimana molekul yang bergerak ini tergantung pada muatan yang dimiliki, bentuk dan ukurannya. Sehingga dengan elektroforesis ini dapat digunakan untuk separasi makromolekul seperti asam nukleat dan protein. SDS-PAGE merupakan salah satu teknik elektroforesis yang banyak digunakan saat ini untuk memisahkan suatu protein berdasarkan berat molekul dan muatan yang dimilikinya karena pelaksanaannya mudah dan relatif tidak mahal. SDS-PAGE menggunakan polyacrylamide gel. Polyacrylamide dibentuk dari polimerisasi dari dua compound, acrylamide dan bis. Bis merupakan cros-linking agent untuk gel. Polimerisasi diawali dengan penambahan ammonium persulfat dengan TEMED. Gel bermuatan netral, hydrofilik, tridimensional network dari hidrokarbon yang dicros-link dengan methylen.

Pada percobaan ini digunakan garam (NH4)2SO4,karena metoda fraksinas ini didasarkan pada berat molekul dengan penambahan garam yang memiliki kelarutan dan kekuatan ion tertentu. Dan pada praktikum ini dilakukan sentrifugasi dimana garam ini akan mempengaruhi dari kelarutan protein. Komponen yang paling berat akan mengendap paling pertama dan fraksi yang paling ringan akan mengendap paling terakhir dan

y = -0.1459x + 2.2873 R² = 0.9835 0 0.5 1 1.5 2 2.5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 LOG kDa JARAK TEMPUH (CM)

KURVA KALIBRASI MARKER UNSTAINED 12%

Tris Glycine

penambahan garam ini adalah untuk memfraksinasi komponen tersebut. peristiwa dimana dengan penambahan garam yang mengakibatkan kelarutan protein berkurang sehingga menggumpal di sebut salting out. Jadi Ion garam akan menarik molekul air yang melarutkan protein sehingga protein menjadi tidak larut. Pergerakan dari protein di dalam gel mengikuti persamaan Rf = 1 / BM (berat molekul) dimana Rf adalah mobility. Oleh

karena itu kecepatan migrasi / mobility dari protein berbanding terbalik dengan berat molekulnya. Semakin berat maka akan semakin lambat pergerakannya atau dengan kata lain berada pada posisi atas dari gel. Selain itu pergerakan protein juga mengikuti persamaan Rf = (Z x V) / f. Z merupakan muatan yang ada pada protein, V adalah kuat arus

listrik, dan f adalah fraction pada gel. Fraksi pada gel bergantung pada besarnya pori-pori di dalam gel. Makin kecil pori-pori maka fractionnya makin besar. Sodium dodecyl sulfat atau disebut juga SDS merupakan detergen yang dapat memecah molekul hidrofobik tetapi juga memiliki muatan negatif yang dihubungkan dengan hal tersebut. Oleh karena itu jika sel diinkubasi dengan SDS maka membran akan dihancurkan dan seluruh protein akan soluablized oleh detergen dan seluruh protein akan dilindungi dengan banyak muatan negatif seperti pada gambar. yang menghasilkan dua hal penting yaitu seluruh protein akan dalam struktur primer dan seluruh protein memiliki muatan negatif yang banyak.

Sumber http://www.bio.davidson.edu/

Pori-pori di dalam gel bergantung pada konsentrasi acrylamide dan cros-linker. Semakain tinggi konsentrasi acrylamide maka diameter pori-pori akan semakin kecil. Apabila protein berukuran besar atau memiliki berat molekul yang besar, maka memerlukan gel dengan konsentrasi acrylamide yang kecil.

Sumber Hempelmann E (2008)

Dan elektroforesisnya dilakukan seperti gambar di bawah ini:

Sumber Hempelmann E (2008)

Pada praktikum ini dilakukan pembuatan dua jenis gel berbeda, yaitu separating gel dan stacking gel. Separating gel ini berfungsi untuk memisahkan atau menseparasi protein berdasarkan berat molekulnya, bahan yang digunakan dalam praktikum yaitu akrilamid 40 % sebagai bahan untuk membentuk pori-pori dalam gel agar protein dapat terpisah berdasarkan ukurannya, tris pH 8.8 untuk menstabilkan. pH buffer agar muatan dari protein tidak berubah, aquades digunakan sebagai pelarut polar dan sebagai media polar untuk aliran listrik dalam gel, SDS digunakan untuk memutuskan ikatan disulfida dari protein agar menjadi unfolding dan menyelubungi protein dengan muatan negatif. Intrepetasi dari SDS-PAGE dapat dibaca dengan membuat persamaan regresi linier dari pita marker sebagai standart acuan Setelah mendapatkan persamaan regresi linier dari marker, karena marker hasil percobaan tidak diperoleh pita maka digunakan jarak tempuh yang berada pada referensi. Kita dapat menghitung berat molekul dari sampel dengan cara memasukkan pada persamaan tersebut. Persamaan regresi linier dari marker : y = -0.1459x + 2.2873. Y menunjukkan panjang jarak dari bagian atas gel samapai pita protein yang akan diukur. Sedangkan x menunjukkan berat molekul.

Di lakukan pewarnaan dari hasil elektroforesis ini dengan larutan staining 0.1% Coomassie brilliant blue R250, 10% asam asetat, 40% methanol, Coomassie brilliant blue ini sensitif

terhadap protein yang memiliki ukuran yang beriksar antara 0,5 hingga 20 mikrogram. Setelah itu dilakukan penggoyangan dengan the belly dancer selama satu malam agar reaksi staining berjalan optimal, kemudian dicuci dengan aquades untuk menghilangkan sisa larutan staining. Lalu dilakukan destaining dengan 20% methanol, 10% asam asetat. Destaining ini dilakukan untuk menghilangkan Coomassie brilliant blue yang tersisa dan memperjelas band protein yang terbentuk serta untuk menghilangkan coomassie brilliant blue yang tidak berada pada band protein.

Hasil yang didapatkan dari fraksi 0-20 % yaitu terdapat 5 garis yang teramati dan pada fraksi 20-50% pun teramati 5 garis pula. Namun pada fraksi 50-70% hanya teramati 1 garis. Dengan munculnya beberapa pita kita dapat menyimpulkan bahwa dalam sampel tersebut terdapat beberapa protein. Dan jika muncul satu pita bukan berartikita hanya memiliki 1 protein murni tapi ada kemungkinan terdapat dua atau lebih jenis protein yang berbeda namun memiliki perbedaan berat molekul yang tidak begitu jauh.perbedaan akan terlihat jelas jika jarak migrasinya cukup jauh.

VI. Kesimpulan

Dari hasil percobaan diperoleh berat tiap-tiap fraksi yaitu :

FRAKSI 0-20% FRAKSI 20-50 % FRAKSI 50-70% jarak

tempuh

massa kDa jarak tempuh

massa kDa jarak tempuh massa kDa 1.4 121.0709639 1.4 121.0709639 6.4 22.570439 2.73 77.44493151 2.1 95.699573 4.5 42.7316832 3.3 63.9484467 4.7 39.95489558 4 50.54753714 6.3 23.34156655 6.3 23.34156655

VII. Daftar pustaka

 Janson, J.C, L.Ryden. 1998. Protein Purification Principles, High-Resolution Methods and Applications. Second Edition. John Wiley & Sons, Inc. Canada.  http://www.bio.davidson.edu/COURSES/GENOMICS/method/SDSPAGE/SDSPA

GE.html

 Schägger H, von Jagow G (Nov 1987). "Tricine-sodium dodecyl

sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa". Anal Biochem 166 (2): 368–379.

 Hempelmann E (2008). "SDS-Protein PAGE and protein detection by silverstaining and immunoblotting of Plasmodium falciparum proteins".

 Moll K, Ljungström J, Perlmann H, Scherf A, Wahlgren M (eds) Methods in Malaria Research, 5th edition: 263–266.

 Raymond S, Weintraub L. (1959). "Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis.". Science 130 (3377)