DAFTAR ISI
Halaman
SAMPUL DALAM ... i
PERSYARATAN GELAR ... ii
LEMBARAN PENGESAHAN ... iii
PENETAPAN PANITIA PENGUJI ... iv
UCAPAN TERIMA KASIH ... v
ABSTRAK ... vi ABSTRACT... vii RINGKASAN ... viii DAFTAR ISI ... ix DAFTAR TABEL ... x DAFTAR GAMBAR . ... xi
DAFTAR SINGKATAN DAN LAMBANG ... xii
DAFTAR LAMPIRAN ... xiii
BAB I PENDAHULUAN ... 1
1.1 Latar Belakang ... 1
1.2 Rumusan Masalah ... 6
1.3 Tujuan Penelitian ... 7
1.4 Manfaat Penelitian. ... 7
BAB II TINJAUAN PUSTAKA ... 8
2.1 Morfologi dan Taksonomi Cendana ... 8
2.2 Habitat dan Penyebaran Cendana ... 10
2.3 Manfaat Cendana ... 11
2.4 Metabolit Sekunder Pada Cendana ... 12
2.5 Radikal Bebas ... 13
2.6 Antioksidan ... 16
2.6.1 Penggolongan antioksidan ... 16
2.6.2 Sumber antioksidan ... 18
2.6.3 Mekanisme kerja antioksidan ... 19
2.6.4 Uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH ... 20
2.7 Senyawa Fenolik ... 22
2.7.1 Penentuan total fenol ... 24
2.8 Artemia Salina Leach. ... 27
2.8.1 Klsifiksi Artemia Salina Leach. ... 27
2.8.2 Morfologi Artemia Salina Leach. ... 27
2.8.3 Sifat ekologi dan fisiologi Artemia salina L. ... 30
2.8.4 Pengujian toksisitas terhadap Artemia Salina L. ... 32
2.9 Teknik Isolasi Senyawa Metabolisme Sekunder ... 33
2.9.1 Ekstraksi ... 33
2.9.2 Partisi ... 35
2.10 Metode Identifikasi Senyawa Bahan Alam ... 36
2.10.1 Fitokimai ... 35
BAB III KERANGKA BERPIKIR DAN KONSEP PENELITIAN... 44
3.1 Kerangka Penelitian ... 44
3.2 Konsep Penelitian ... 47
3.3 Hipotesis Penelitian ... 49
BAB IV METODE PENELITIAN ... 50
4.1 Rancangan Penelitian ... 50
4.2 Lokasi dan Waktu Penelitian ... 50
4.3 Ruang Lingkup Penelitian ... 51
4.4 Penentuan Sumber Data ... 51
4.5 Variabel Penelitian ... 52
4.6 Bahan dan Alat Penelitian ... 52
4.7 Prosedur Penelitian ... 53
4.7.1 Pengumpulan dan preparasi sampel. ... 53
4.7.2 Pembuatan ekstrak daun cendana . ... 54
4.7.3 Partisi ekstrak methanol daun cendana. ... 54
4.7.4 Identifikasi senyawa aktif. ... 55
4.7.5.1 Uji fitokimia ... 55
4.7.5 Penentuan kandungan total fenol ... 56
4.7.8 Uji aktivitas antioksidan dengen metode DPPH ... 59
4.7.9 Uji toksisitas dengan metode BSLT ... 62
4.8 Analisa Data ... 64
BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN ... 65
5.1 Hasil Penelitian ... 65
5.2 Pembahasan ... 77
BAB VI SIMPULAN DAN SARAN ... 91
6.1 Simpulan ... 91
6.2 Saran ... 92
DAFTAR PUSTAKA ... 93
DAFTAR TABEL
Halaman
2.1 Kelas Terpenting Senyawa Fenolik Pada Tumbuhan ... 23 5.1 Hasil Uji Fitokimia Ekstrak Kasar Metanol Daun
Cendana (Santalumalbum L ... 67 5.2 Hasil Partisi Ekstrak Kasar Metanol Daun Cendana ... 68 5.3 Hasil Uji Fitokimia Fraksi n-Heksan, Klorofom dan n-Butanol... 69 5.4 Kandungan total fenol ekstrak kasar metanol,
fraksi n-heksan, fraksi klorofom, dan fraksi n-butanol ... 70 5.5 Nilai IC50 Ekstrak Kasar Metanol, Fraksi n-Heksana,
Kloroform, dan n-Butanol Daun Cendana. ... 71 5.6 Hasil Uji Toksisitas Ekstrak Kasar Metanol, Fraksi n-Heksana,
Kloroform, dan n-Butanol Daun Cendana ... 72 5.7 Dugaan senyawa-senyawa aktif yang berpotensi sebagai antioksidan
dan antikanker yang teridentifikasi dalan fraksi kloroform daun
cendana hasil analisis GC-MS ... 74
DAFTAR GAMBAR
Halaman
2.2 Tegakan Cendana ... 9
2.2 Daun,bunga, buah dan biji cendana ... 10
2.3 Struktur DPPH ... 21
2.4 Struktur Fenol Sederhana ... 22
2.5 Struktur Asam Galat ... 26
2.6 Morfologi Nauplius. ... 28
2.7 Morfologi Artemia salia Leach ... 29
2.8 Siklus hidup Artemia salina Leach ... 31
2.9 Struktur Senyawa Alkloid... 37
2.10 Struktur Dasar Terpenoid ... 38
2.11 Struktur Dasar Steroid ... 39
2.12 Senyawa Saponin ... 40
2.13 Golongan Senyawa Fenol Sederhana ... 41
2.14 Struktur Dasar Flavonoid, isoflavonoid, neoflavonoid ... 42
3.1 Bagan konep penelitian ... 48
DAFTAR SINGKATAN DAN LAMBANG SINGKATAN
DPPH : Dyphenil Picrylhydrazil BSLT : Brine Shrimp Lethality Test KLT : Kromatografi Lapis Tipis LC50 : Lethal Consentration IC50 : Inhibition Consentration ppm : part per milion atau mg/L
dkk : dan kawan-kawan
et al : et alii
dpl : di atas permukaan laut ROS : reactive oxygen species DNA : asam deoksiribonukleat BHA : butil hidroksi anisol BHT : butil hidroksi toluen
PG : propil galat
TBHQ : tert-butil hidroksi quinon HOCl : hipoklorat
SOD : superokxide dismutase
N : Nitrogen µL : mikroliter mL : mililiter g : gram kg : kilogram mg : miligram cm : sentimeter mm : milimeter LAMBANG % : Persen
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1. Tabel Uji Fitokomia Ekstrak Metanol dan Fraksi
Hasil Patisi (n-heksan, klorofom dan n-butanol) ... 119 Lampiran 2. Penentuan Kandungan Total Fenol ... 110 Lampiran 3. Perhitungan Konsentrasi dan Kadar Total Fenol ... 121 Lampiran 4. Perhitungan Pembuatan Larutan Asam Galat, Larutan DPPH,
dan Larutan Uji Sampel Untuk Pengujian Aktivitas
Antioksidan ... 222 Lampiran 5. Pengukuran Aktivitas Antioksidan (Nilai IC50) ... 226 Lampiran 8. Pembuatan Larutan Untuk Uji Toksisitas
Terhadap Larva Artemia salina Leach. ... 228 Lampiran 9. Perhitungan nilai LC50 Ekstrak Kasar Metanol Daun Cendana ... 229 Lampiran 10. Perhitungan nilai LC50 Ekstrak n-heksan ... 231 Lampiran 11. Perhitungan nilai LC50 Ekstrak klorofom ... 237 Lampiran 12. Perhitungan nilai LC50 Ekstrak n-butanol... 238 Lampiran 13. Hasil Kromatogram Fraksi Klorofom Daun Cendana
ABSTRAK
SKRINING FITOKIMIA, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN
DAN UJI TOKSISITAS EKSTRAK DAUN CENDANA (Santalum album L.) TERHADAP Artemia salina Leach
Cendana (Santalum album L.), merupakan salah satu tanaman obat berkhasiat di Indonesia. Penelitian ini bertujuan untuk menentukan kandungan fitokimia, total fenol, aktivitas antioksidan, dan toksisitas ekstrak metanol daun S. album. Skrining fitokimia dilakukan seacara kualitatif dengan uji fitokimia. Total fenol diukur dengan metode spektrofotometer menggunakan reagen
Follin-Ciocalteu. Aktivitas antioksidan ditentukan menggunakan metode DPPH (1,1-diphenyl-2- picrylhidrazyl) dan uji toksisitas dilakukan dengan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT).
Hasil penelitian menunjukkan ekstrak kasar metanol S. album mengandung alkaloid, terpenoid, steroid, fenol, dan flavonoid. Fraksi n-heksan mengandung senyawa terpenoid, fraksi klorofom mengandung senyawa alkaloid, steroid, dan fenolik sedangkan fraksi n-butanol mengandung senyawa terpenoid dan flavonoid. Kandungan total fenol fraksi klorofom tertinggi yaitu 12,83±0,92 mg eq. asam galat/100g sampel, diikuti fraksi n-butanol 7,06±1,68, ekstrak kasar metanol 5,64±0,31, dan fraksi n-heksana 2,62±0,57mg eq asam galat /100g sampel. Aktivitas antioksidan tertinggi dengan nilai IC50 520 ±6,66 ppm juga ditunjukkan fraksi kloroform yang secara statistik berbeda nyata (p<0,05) dengan nilai IC50 fraksi n-butanol 1493±55.6 ppm, ekstrak kasar metanol 1516.6 ± 318ppm, dan fraksi n-heksan 2900 ± 206,6 ppm. Dari hasil uji toksisitas, ekstrak metanol dan fraksi hasil partisinya bersifat toksik terhadap larva A.salina dengan nilai LC50<1000 ppm. Analisis statistik menunjukkan nilai LC50 untuk ektrak kasar metanol dan fraksi hasil partisinya tidak berbeda secara nyata (p>0,05). Nilai LC50 fraksi kloroform 44,84±12.16 ppm, ekstrak kasar metanol 77,99±6,93 ppm, fraksi n-heksana 150, 39±18,33 ppm, dan fraksi n-butanol 127,5±67,19 ppm.
Identifikasi fraksi aktif klorofom dengan GC-MS menunjukan adanya 5 senyawa utama yaitu 2-Butoksi-etanol; Metil-dodekanoat; Loliolide; Metil-heksadekanoat; dan Metil-9-oktadekenoat.
ABSTRACT
PHYTOCHEMICAL SCREENING, ANTIOXIDANDT ACTIVITIES AND TOXICITY TEST OF LEAF CENDANA (Santalum album L.) EXTRACT ON Artemia
salina Leach
Cendana (Santalum album L.) is one of the Indonesian traditional medicinal plants. This study aimed to determine phytochemical constituents, total phenolic contents, antioxidant activity, and toxicity of S. album leaves extract. Phytochemical constituents were screened qualitatively using phytochemical reagents, total phenolic content was measured by spectrophotometer method using Follin-Ciocalteu reagent, antioxidant activity was determined using DPPH (1,1-diphenyl-2 picrylhidrazyl) method and toxicity test was conducted using Brine Shrimp Lethality Test (BSLT).
Phytochemical screening result showed crude methanol extract of S. album constituted of alkaloids, terpenoids, steroids, phenols and flavonoids while n-hexane fraction contained terpenoids, chloroform fraction constituted of alkaloids, steroids, and phenolic, and n-buthanol fraction constituted of terpenoids and flavonoids compounds. The highest total phenolic content 12.83 ± 0.92 mg eq. gallic acid/100g sample was found in the chloroform fraction, followed by n-buthanol fraction 7.06 ± 1,68, crude methanol extract 5, 64 ± 0.31, and n-hexane fraction 2.62 ± 0,57 mg eq. gallic acid /100g sample. The chloroform fraction also gave the highest antioxidant activity with IC50 of 520 ± 6,66 ppm. Statistical analysis revealed that the IC50 values of the chloroform fraction was significantly differences (p <0.05) to n-butanol fraction with IC50 value of 1493.3 ± 55.6 ppm, methanol crude extract with IC50 value of 1516.6 ± 318ppm, and n-hexane fraction with IC50 value of 2900 ± 206.6 ppm. The toxicity testing result indicated that both crude methanol extract and its fractions were toxic to artemia salina L with LC50 value <1000 ppm. The LC50 value of the crude methanol extract, chloroform, n-buthanol, and n-hexane fractions was 77,99 ± 6,93ppm; 44, 84 ± 12.16 ppm , 127,5 ± 18.33 ppm, and 150.39 ± 67.19 respectively. Identification of chloroform active fraction by GC-MS showed 5 majors compounds which tentatively identified as 2-buthoxy-ethanol; Methyl-dodecanoic, Loliolide, Methyl-hexadecanoic, and methyl-9-octadecenoic.
Keywords: Santalum album L., Antioxidant Activity, Total phenol, BSLT, GC-MS
BAB I PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Indonesia merupakan salah satu negara yang memiliki hutan tropis yang luas dengan tingkat biodiversitasnya yang tinggi. Tingkat biodiversitas yang tinggi pada hutan tropis Indonesia, merupakan sumber daya yang sangat potensial dikembangkan untuk menunjuang pembangunan nasional (Achmad, 1995). Indonesia memiliki sekitar 25.000 spesies tumbuhan endemik, dan 2000 spesies diantaranya secara etnobotani memiliki kegunaan sebagai bahan pangan, sandang, papan dan sekitar 900 spesies tumbuhan tersebut telah digunakan sebagai obat tradisional untuk mengobati berbagai macam penyakit (Heyne, 1987).
Pengembangan obat tradisional yang berasal dari tumbuh-tumbuhan, didukung oleh berkembangnya pola hidup masyarakat di dunia untuk back to nature dalam memanfaatkan bahan-bahan alami sebagai obat-obatan, pengawetan makanan, serta untuk perawatan kecantikan. Peningkatan penggunaan obat tradisional dikalangan masyarakat, dapat dilihat dari peningkatan jumlah industri obat-obatan di Indonesia. Saat ini ada 199 perusahaan farmasi yang beroperasi di Indonesia, dan 10 perusahaan diantaranya merupakan perusahaan farmasi yang umumnya didominasi oleh perusahaan lokal. Hal ini memberi pengaruh kepada peningkatan industri obat-obatan terutama obat-obatan yang berbahan dasar tumbuh-tumbuhan (Dharmadewi, 2013).
Bahan kimia tumbuhan berupa produk metabolit sekunder dihasilkan oleh tumbuhan dan dibagi kedalam beberapa golongan utama yaitu alkaloid, fenolik, flavonoid, terpenoid dan terbentuk melalui empat jalur biosintesis yaitu asam sikimat, asam malonat, poliketida dan asam mevalonat (Saleh, 2008). Pada umumnya senyawa antioksidan alami adalah senyawa polifenol yang dapat berupa golongan flavonoid, turunan asam sinamat, kumarin, tokoferol,
dan asam-asam organik polifungsional. Senyawa metabolit sekunder pada tanaman terutama golongan flavonoid dan polifenolik ternyata mempunyai aktivitas biologis, diantaranya sebagai antioksidan (Winarsi, 2007).
Flavonoid merupakan salah satu kelompok senyawa golongan fenol yang disintesis oleh tumbuhan dan tidak dapat disintesis oleh tubuh manusia. Senyawa fenol yang terdiri atas flavonoid, tanin, antosianin, dan asam fenolat merupakan suatu senyawa aromatik yang mempunyai beberapa gugus hidroksil yang dapat berperan sebagai senyawa antioksidan. Semakin besar total fenol dalam suatu sampel maka semakin besar pula aktivitas antioksidan. Senyawa yang berperan sebagai antioksidan merupakan senyawa polifenol yang dapat menghambat radikal bebas penyebab suatu penyakit degeratif seperti kanker (Winarsi, 2007). Berbagai penelitian tentang aktivitas antioksidan dari senyawa flavonoid sudah banyak dilakukan dan telah terbukti bahwa flavonoid yang merupakan kelompok senyawa fenolik ini dapat dijadikan sebagai sumber antioksidan eksogen. Senyawa fenolik memiliki potensi sebagai senyawa antioksidan karena memiliki gugus hidroksil yang terikat pada karbon cincin aromatik sehingga dapat berfungsi sebagai pengikat radikal bebas, dengan menyumbangkan atom hidrogen untuk menstabilkan senyawa radikal bebas (Hamid et al., 2010).
Kemajuan teknologi yang terjadi pada era globalisasi saat ini memicu terbentuknya pola hidup masyarakat yang lebih modern. Namun penggunaan berbagai teknologi yang modern tersebut, justru dapat mengakibatkan timbulnya efek negatif berupa pencemaran. Sumber pencemaran dapat berasal dari kendaraan bermotor, pembuangan industri, asap rokok, pendingin ruangan, kebakaran hutan serta pola hidup yang tidak sehat. Banyaknya pencemaran akan memicu terbentuknya radikal bebas sebagai hasil samping dari prosses metabolisme tubuh (Romansyah, 2011).
Radikal bebas adalah atom atau molekul yang tidak stabil dan sangat reaktif karena mengandung satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan pada orbital terluarnya. Untuk mencapai kestabilan atom atau molekul, radikal bebas akan bereaksi dengan molekul disekitarnya untuk memperoleh pasangan elektron. Reaksi ini akan berlangsung secara terus-menerus dalam tubuh atau reaksi berantai, dan apabila tidak dihentikan maka akan terjadi stres oksidatif sehingga dapat menimbulkan berbagai macam penyakit seperti kanker, jantung, katarak, penuaan dini serta penyakit degeneratif lainnya. Oleh karena itu tubuh memerlukan suatu substansi penting berupa antioksidan yang mampu mengikat radikal bebas sehingga tidak dapat menginduksi suatu penyakit (Muhilal, 1991).
Antioksidan sebenarnya sudah ada dalam tubuh manusia, namun saat pasokan radikal bebas terlalu banyak didalam tubuh, maka antioksidan dari luar sangat dibutuhkan (Romansyah, 2011). Antioksidan yang paling banyak digunakan saat ini adalah antioksidan sintetik seperti butylated hydroxyanisole (BHA), butylated hydroxytoluene (BHT), tertbutylhydroquinone (TBHQ), dan propyl gallate (PG). Efek samping dari antioksidan sintetik adalah karsinogenik sehingga permintaan akan antioksidan alami terus meningkat dari waktu ke waktu (Heo et al., 2006).
Tanaman cendana mengandung senyawa seskuiterpena. Senyawa-senyawa ini merupakan komponen penyusun minyak atsiri pada cendana. Seskuiterpena yang terbanyak adalah α-santalol dan β-santalol. Senyawa santalol mempunyai aktivitas antibakteri dan bersifat sedatif (Christenson at al., 1981). Senyawa steroid dilaporkan terdapat dalam daun cendana yaitu β- sitosterol dan dalam kulit batang cendana yaitu amirin palmitat (triterpenoid ester). β- sitosterol mempunyai aktivitas antidiabetik sedangkan amirin palmitat mempunyai aktivitas insektisida melawan Atteva fabriciella, Eligama norcissu, dan Eupterote geminata (Malavadhani, 2004).
Secara tradisional tanaman cendana (Santalum album L.), dimanfaatkan sebagai obat untuk menyembuhkan beberapa penyakit seperti sakit perut, asma, sakit kulit, infeksi ginjal, berbagai peradangan, obat penenang, anti kanker, anti bakteri, dan aroma terapi (Rahayu dkk., 2002). Saleh (2011) berhasil mengisolasi senyawa steroid (clionasterol), pada akar cendana yang mempunyai aktivitas hipkoglikemik. Simanjuntak (2003) berhasil mengidentifikasi senyawa bioaktif antibakteri dari ekstrak metanol kayu cendana yaitu senyawa α-santalol, β-santalol, dan epi-β-santalen.
Antioksidan berpotensi dikembangkan dalam bidang industri farmasi, kecantikan, dan pengawetan makanan serta diduga mempunyai efek antikanker (Winarsi, 2007). Potensi ekstrak suatu tanaman yang diduga mempunyai efek antikanker dapat dideteksi dengan uji toksisitas menggunakan metode BSLT (Brine Shrimp Lethality Test), karena merupakan salah satu metode untuk skrining awal atau penapisan aktivitas farmakologis pada tanaman obat dan mendeteksi toksisitas ekstrak suatu tanaman. Uji toksisitas dengan metode BSLT (Brine Shrimp Lethality Test), sering dikaitkan dengan potensi suatu ekstrak tanaman sebagai antikanker dengan menggunakan Artemia salina Leach sebagai hewan uji dan secara teknis metode BSLT ini pelaksanaannya relatif cepat, mudah, murah, tidak membutuhkan kondisi yang aseptis, reagen yang dibutuhkan sedikit, dan dapat dipercaya (Meyer et al., 1982). Artemia salina Leach digunakan dalam metode BSLT karena memiliki kesamaan tanggapan/respon dengan mamalia misalnya DNA dependent RNA polimerase. Sebagaimana fungsi yang dimiliki DNA - dependent RNA polimerase yaitu untuk pembentukan protein dan protein merupakan komponen utama semua sel maka ketika RNA polimerase dihambat maka DNA tidak dapat mensintesisi RNA dan RNA tidak dapat terbentuk sehingga sintesis protein juga dihambat. Protein merupakan komponen utama sel yang berfungsi sebagai unsur struktural, hormon, imunoglobulin, dan berperan dalam transport oksigen. Jika protein tidak terbentuk maka metabolisme sel terganggu dan pada akirnya dapat menyebabkan kematian
sel. Apabila suatu senyawa mengganggu kerja sistem pada A. salina dan menyebabkan kematian, maka senyawa tersebut bersifat toksik dan dapat mematikan sel mamalia. A. .salina memiliki respon stres yang sama dengan manusia yaitu respon prilaku dan fisiologis terhadap stresor lingkungan (Ajrina, 2013).
Dari hasil uji pendahuluan skrining fitokomia, daun cendana positif mengandung senyawa alkaloid, steroid, flavonoid, dan fenol. Senyawa golongan fenol dan flavonoid mempunyai aktivitas antioksidan karena mampu mendonorkan atom H pada radikal bebas sehingga dapat mencegah stres oksidatif (Hamid et al., 2010).
Pemanfaatan daun cendana di Indonesia belum optimal karena yang dimanfaatkan sebagai bahan baku obat adalah minyak atsiri yang berasal dari akar dan batang kayu cendana. Dari penelusuran beberapa literatur, sedikit sekali diperoleh informasi ilmiah tentang bioaktivitas daun cendana yang digunakan sebagai bahan obat di Indonesia. Hal ini membuka peluang bagi peneliti untuk melakukan penelitian tentang senyawa bioaktif pada daun cendana sebagai antioksidan dengan metode DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazil) dan menguji toksisitasnya dengan menggunakan larva Artemia salina Leach.
1.2 Rumusan Masalah
Rumusan masalah dari usulan penelitian ini adalah
1. Berapakah kandungan total fenol pada ekstrak daun cendana (Santalum album L.)?. 2. Apakah ekstrak daun cendana (Santalum album L.) memiliki sifat antioksidan?.
3. Apakah ekstrak daun cendana (Santalum album L.) bersifat toksik terhadap Artemia salina Leach.?.
4. Senyawa aktif apa saja yang terdapat dalam ekstrak daun cendana yang bersifat antioksidan dan toksik terhadap Artemia slaina Leach?
1.3 Tujuan Penelitian
1. Untuk mengetahui kandungan total fenol ekstrak daun cendana (Santalum album L.) 2. Untuk mengetahui aktivitas antioksidan ekstrak daun cendana (Santalum album L.)
dengan metode DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazil)
3. Untuk mengetahui toksisitas ekstrak daun cendana (Santalum album L.) terhadap Artemia salina L.
4. Untuk mengetahui senyawa aktif yang terdapat dalam ekstrak daun cendana yang bersifat antioksidan dan toksik terhadap Artemia slaina Leach.
1.4 Manfaat Penelitian
1. Memberikan informasi mengenai kandungan senyawa metabolit sekunder pada daun cendana dan dapat melengkapi database potensi pemanfaatan cendana (Santalum album L.), sehingga dapat digunakan sebagai pedoman dalam pengembangan bioteknologi khususnya dalam bidang farmakologi.
2. Memberikan informasi mengenai potensi daun cendana (Santalum album L.) sebagai senyawa antioksidan alami sehingga dapat meningkatkan optimalisasi pemanfaatan dan nilai ekonomi dari daun cendana (Santalum album L.)
