BAB V
HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN
5.1 Uji Pendahuluan
5.1.1 Ekstraksi spons genus Haliclona Grant, 1836
Metode ekstraksi yang digunakan dalam penelitian ini adalah maserasi. Maserasi dipilih karena merupakan metode yang paling sederhana dengan peralatan yang relatif mudah untuk didapatkan. Maserasi dilakukan tanpa adanya tahap pemanasan sehingga dapat menghindari terjadinya kerusakan komponen senyawa-senyawa pada spons yang tidak tahan panas.
Maserasi dilakukan dengan sesekali pengadukan yang bertujuan untuk meratakan konsentrasi larutan di luar butir sampel sehingga dengan perlakuan tersebut derajat perbedaan konsentrasi yang sekecil-kecilnya antara larutan di dalam dengan di luar sel tetap terjaga.
Hasil ekstraksi 100 gram spons Genus Haliclona Grant, 1836 masing-masing menggunakan etanol dan metanol memberikan perolehan ekstrak kasar etanol 4,24 gram dan ekstrak kasar metanol 3,87 gram. Kedua ekstrak kasar (etanol dan metanol) diuji toksisitasnya menggunakan larva Artemia salina Leach.
5.1.2 Uji toksisitas ekstrak etanol dan metanol terhadap larva Artemia salina Leach.
Ekstrak pekat etanol dan metanol dari spons Haliclona Grant, 1836 diuji toksisitasnya terhadap larva Artemia salina L. menggunakan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). BSLT merupakan praskrining terhadap senyawa-senyawa
dihitung nilai LC50 dari setiap ekstrak.
LC50 merupakan konsentrasi yang dapat menyebabkan kematian 50 %
pada larva Artemia salina L. Nilai ini digunakan untuk menentukan tingkat toksisitas suatu zat. Semakin besar nilai LC50 menunjukkan toksisitas semakin
kecil. Hasil uji ekstrak etanol dan metanol spons genus Haliclona Grant, 1836 terhadap larva Artemia salina L. dapat dilihat pada Tabel 5.1.
Tabel 5.1.
Hasil Uji Ekstrak Etanol dan Metanol Spons
Genus Haliclona Grant, 1836 terhadap Larva Artemia salina L.
Konsentrasi % Mortalitas
Ekstrak etanol Ekstrak metanol
0 0 0
10 20 23,33
100 70 83,33
1000 100 100
Log konsentrasi pada 50
% mortalitas 1,67 1,51
LC50 (ppm) 101,67= 46,77 101,51 = 32,36
Keterangan : LC50 = konsentrasi yang menyebabkan 50 % kematian
0 ppm = kontrol
Berdasarkan hasil uji toksisitas yang dilakukan pada ekstrak etanol dan ekstrak metanol spons genus Haliclona Grant, 1836, diperoleh nilai LC50 ekstrak
etanol dan metanol berturut-turut sebesar 46,77 ppm dan 32,36 ppm. Perhitungan pembuatan larutan dapat dilihat pada Lampiran 2 dan perhitungan LC50 pada
Lampiran 3. Menurut Meyer (1982) suatu zat dikatakan aktif atau toksik bila nilai LC50 < 1000 ppm untuk ekstrak dan < 20 ppm untuk senyawa. Dengan demikian,
LC50 < 1000 ppm. Akan tetapi dari kedua ekstrak ini yang bersifat lebih toksik
adalah ekstrak metanol. Setelah diperoleh hasil bahwa ekstrak metanol lebih toksik, 3000 gram spons genus Haliclona Grant, 1836 dimaserasi dengan 5 L metanol sehingga diperoleh 16,84 gram ekstrak kental metanol. Ekstrak kental ini selanjutnya digunakan dalam penelitian.
5.2 Partisi Ekstrak Metanol Spons Genus Haliclona Grant, 1836
Partisi dilakukan dengan cara menambahkan pelarut pengekstrak yang tidak saling bercampur kemudian dilakukan pengocokan sehingga terjadi distribusi zat terlarut di antara kedua pelarut (Khopkar, 2003). Pengocokan yang dilakukan bertujuan untuk memperluas area permukaan kontak di antara kedua pelarut. Pelarut yang digunakan dalam partisi ekstrak metanol yaitu n-heksana dan kloroform. Sebelum dilakukan partisi menggunakan n-heksana dan kloroform, ekstrak kental metanol dilarutkan terlebih dahulu dengan 250 mL air.
Partisi dari 16,84 gram ekstrak metanol menunjukkan perolehan ekstrak n-heksana (EH) sebanyak 1,64 gram; 1,72 gram ekstrak kloroform (EK) dan ekstrak air (EA) sebanyak 13,62 gram. Hasil partisi menunjukkan perbedaan daya larut senyawa pada ekstrak metanol terhadap pelarut n-heksana, kloroform dan air. Senyawa pada ekstrak metanol spons genus Haliclona Grant, 1836 lebih banyak terlarut pada pelarut air dibandingkan dalam n-heksana maupun kloroform. Hal ini menunjukkan senyawa yang terkandung dalam spons genus Haliclona Grant, 1836 sebagian besar bersifat polar.
terhadap Larva Artemia salina L.
Hasil pengujian toksisitas ekstrak n-heksana, kloroform dan air ekstrak spons genus Haliclona Grant, 1836 ditunjukkan pada Tabel 5.2. Hasil uji toksisitas menunjukkan ketiga ekstrak hasil partisi (n-heksana, kloroform dan air) tergolong toksik. Perhitungan LC50 disajikan pada Lampiran 4.
Tabel 5.2.
Hasil Uji Toksisitas Ekstrak n-Heksana, Kloroform dan Air terhadap Larva Artemia salina L.
Konsentrasi % Mortalitas
Ekstrak n-Heksana Ekstrak Kloroform Ekstrak air
0 0 0 0 10 3,33 6,67 6,67 100 13,33 76,67 46,67 1000 70 90 90 Log konsentrasi pada 50 % mortalitas 2,63 1,81 2,05 LC50 (ppm) 102,63 = 426,58 101,81 = 64,57 102,05 = 112,20
Keterangan : LC50 = konsentrasi yang menyebabkan 50 % kematian
0 ppm = kontrol
Nilai LC50 ketiga ekstrak hasil partisi menunjukkan penurunan jika
dibandingkan dengan nilai LC50 ekstrak metanol sebelum dipartisi yaitu 32,36
ppm. Hal ini menunjukkan bahwa senyawa-senyawa toksik yang terkandung dalam masing-masing ekstrak bekerja sinergis sehingga menyebabkan ekstrak metanol yang belum dipartisi memiliki toksisitas lebih tinggi dibandingkan toksisitas masing-masing ekstrak hasil partisi.
Berdasarkan data hasil uji toksisitas terhadap larva Artemia salina L., diperoleh bahwa ekstrak kloroform bersifat paling toksik yaitu memiliki nilai LC50 sebesar 64,57 ppm sedangkan ekstrak air dan n-heksana masing-masing
memiliki nilai LC50 sebesar 112,20 ppm dan 426,58 ppm. Hasil uji ini
mengindikasikan bahwa senyawa-senyawa yang memiliki toksisitas tinggi dan berpotensi sebagai antikanker pada spons genus Haliclona Grant, 1836 bersifat semipolar. Selanjutnya terhadap ekstrak kloroform dilakukan pemisahan dengan kromatografi kolom.
5.4 Pemisahan dan Pemurnian Ekstrak Kloroform Spons Genus Haliclona Grant, 1836
Pemisahan dan pemurnian ekstrak kloroform dilakukan dengan cara kromatografi kolom. Untuk menentukan eluen yang paling baik pada proses kromatografi kolom, dilakukan dengan cara kromatografi Lapis Tipis (KLT).
Proses KLT bertujuan untuk melihat pola pemisahan senyawa pada ekstrak dan untuk menentukan fase gerak yang paling sesuai pada kromatografi kolom. Fase gerak yang digunakan adalah berbagai campuran pelarut dengan polaritas yang berbeda. Fase gerak terbaik adalah yang menghasilkan jumlah noda terbanyak dengan jarak pisah yang baik. KLT yang dilakukan menggunakan silika gel GF254 (1 x 10 cm) sebagai fase diam. Hasil kromatografi lapis tipis dengan
beberapa jenis campuran eluen disajikan pada Tabel 5.3, kromatogram KLT dan perhitungan harga Rf dicantumkan pada Lampiran 5 dan 6.
Pendeteksian noda pada KLT dilakukan menggunakan lampu UV 254 nm dan 366 nm. Berdasarkan data pada Tabel 5.3 dapat diketahui eluen terbaik yang memberikan jumlah noda yang terbanyak dengan pemisahan terbaik adalah etil asetat : n-heksana (2 : 8) yaitu dengan jumlah noda 4 buah berbentuk bulat. Menurut Still (1978), pemilihan sistem eluen dengan KLT sebaiknya harus
digunakan pada pemisahan menggunakan kromatografi kolom. Tabel 5.3
Harga Rf Hasil Kromatografi Lapis Tipis Ekstrak Kloroform Pengembang Jumlah noda Harga Rf (cm) Etil asetat : n-heksana
1 : 9 4 0,035; 0,059; 0,094; 0,153
2 : 8 4 0,235; 0,447; 0,518; 0,576
3 : 7 4 0,047; 0,435; 0,565; 0,659
8 : 2 2 0,847; 0,953
9 : 1 2 0,894; 0,965
Etanol : etil asetat
7 : 3 1 0,941
8 : 2 1 0,906
Etil asetat : kloroform
2 : 8 3 0,176; 0,612; 0,671 3 : 7 2 0,176; 0,647 5 : 5 2 0,847; 0,965 6 : 4 2 0,624; 0,929 7 : 3 3 0,612; 0,729; 0,941 8 : 2 2 0,106; 0,946 9 : 1 2 0,765; 0,941 Kloroform : n-heksan 5 : 5 3 0,059; 0,188; 0,412 6 : 4 2 0,141; 0,353 7 : 3 3 0,024; 0,200; 0,329 8 : 2 4 0,047; 0,259; 0,318; 0,388 9 : 1 4 0,047; 0,200; 0,282; 0,353
Pada proses kromatografi kolom, fase diam yang digunakan adalah silika gel 60 sebanyak 60 gram. Ekstrak kloroform yang digunakan sebanyak 1,5 gram. Kecepatan alir fase gerak adalah 1 mL/menit. Senyawa yang terelusi terlebih dahulu adalah senyawa yang bersifat kurang polar. Hal ini disebabkan senyawa yang terelusi dengan silika gel (fase diam) memiliki interaksi yang lemah, sedangkan senyawa yang terelusi terakhir memiliki sifat yang lebih polar karena
memiliki interaksi yang kuat dengan silika gel dan tertahan lebih lama pada fase diam. Eluat ditampung setiap 3 mL sehingga dihasilkan 126 botol eluat.
Setelah tertampung 126 botol masih terdapat ekstrak yang belum terpisah dengan baik, hal ini terlihat dari masih adanya komponen berwarna coklat di bagian atas kolom. Oleh karena itu, proses pemisahan dilanjutkan dengan cara kromatografi kolom gradien. Eluen yang digunakan adalah etil asetat dan etanol. Masing-masing eluat ditampung sebanyak 25 ml per botol, dengan total volum 75 ml, sehingga terdapat 3 botol untuk masing-masing eluen. Pemisahan tersebut menghasilkan 6 botol, yaitu nomor 127 sampai 132 seperti tercantum pada Tabel 5.4.
Tabel 5.4
Hasil Pemisahan dengan Kromatografi Kolom Gradien
Botol No. Fase Gerak Warna Fraksi
127, 128, 129 Etil asetat Coklat muda
130, 131, 132 Etanol Coklat tua
.
Seluruh eluat hasil kolom selanjutnya dilihat nodanya dengan cara KLT. Dalam hal ini, KLT dilakukan dengan tujuan pengelompokan lebih lanjut terhadap fraksi-fraksi yang diperoleh berdasarkan kesamaan profil kandungan kimia dari bercak KLT yang terbentuk. Berdasarkan kesamaan pola nodanya diperoleh lima fraksi yaitu F1 – F5. Terdapat beberapa botol eluat pada hasil
kromatografi kolom tidak dapat dimasukkan ke dalam fraksi karena eluat-eluat tersebut tidak menampakkan noda pada KLT. Data lengkap kromatogram dan perhitungan Rf dicantumkan pada Lampiran 7 dan 8.
Harga Rf Eluat Hasil Kromatografi Kolom Berdasarkan KLT Penggabungan
Fraksi (botol ke-) Jumlah Noda Rf Warna
Fraksi 1 (1 - 15) 1 0,506 Kuning pucat
Fraksi 2 (16 - 40) 1 0,447 Kuning pucat
Fraksi 3 (41 - 49) 1 0,294 Kuning pucat
Fraksi 4 (50 - 126) 2 0,176; 0,235 Kuning pucat
Fraksi 5 (127 + 128) 1 0,090 Coklat muda
Pemisahan dengan kromatografi kolom didasarkan pada perbedaan interaksi analit terhadap fase diam dan fase gerak. Kromatografi kolom dengan fase diam silika gel menggunakan fase gerak pelarut organik atau campuran pelarut organik. Fase gerak berfungsi membawa komponen sampel lewat pada silika gel dengan memindahkan analit dari partikel-partikel fase diam. Molekul analit bebas untuk berpindah bersama pelarut, jika molekul analit tidak berikatan dengan permukaan silika gel. Golongan polar pelarut dapat bersaing dengan analit untuk menempatkan ikatan pada permukaan silika gel. Oleh karena itu, jika pelarut yang digunakan terlalu polar akan berinteraksi kuat dengan permukaan silika gel dan akan meninggalkan tempat fase diam dengan membebaskan ikatan dengan analit tersebut. Kemudian analit bergerak cepat pada fase diam. Dengan cara yang sama, gugus polar pelarut dapat mengikat kuat dengan gugus polar pada analit dan menghalangi interaksi analit dengan permukaan silika gel.
Partisi zat terlarut berlangsung di pelarut yang turun (fasa mobil) dan pelarut yang teradsorbsi oleh adsorben (fasa stationer). Selama perjalanan turun zat terlarut akan mengalami proses adsorpsi dan partisi berulang-ulang. Laju penurunan berbeda untuk masing-masing zat terlarut dan bergantung pada
koefisien partisi masing-masing zat terlarut. Akhirnya, zat terlarut akan terpisahkan membentuk beberapa lapisan.
Fraksi kloroform ekstrak spons genus Haliclona Grant, 1836 setelah dipisahkan dengan kromatografi kolom menghasilkan lima fraksi yang berbeda. Masing-masing fraksi selanjutnya diuji toksisitasnya terhadap larva Artemia salina L.
5.5 Uji Toksisitas Fraksi-fraksi Hasil Pemisahan Kromatografi Kolom Ekstrak Kloroform terhadap Larva Artemia salina L.
Hasil uji toksisitas fraksi hasil kromatografi kolom terlihat pada Tabel 5.6 dan perhitungan LC50 dicantumkan pada Lampiran 9. Berdasarkan data pada
Tabel 5.6 menunjukkan bahwa semua fraksi bersifat toksik. Diantara semua fraksi yang diujikan, fraksi satu memiliki toksisitas paling tinggi terhadap larva Artemia salina L. dengan nilai LC50 sebesar 70,79 ppm. Nilai LC50 dari ekstrak kasar
metanol, ekstrak partisi kloroform dan isolat toksik F1 berturut-turut sebesar 32,36
ppm; 64,57 ppm dan 70,79 ppm. Nilai LC50 ini menunjukkan kecenderungan yang
menurun. Hal ini kemungkinan disebabkan senyawa-senyawa toksik yang terkandung dalam ekstrak spons genus Haliclona Grant, 1836 bekerja sinergis sehingga ketika dipartisi ataupun dimurnikan dengan kromatografi kolom, toksisitasnya cenderung menurun.
Uji Toksisitas Fraksi Hasil Kromatografi Kolom terhadap Larva Artemia salina L.
Fraksi Konsentrasi (ppm)
% Mortalitas
Log Konsentrasi pada 50 % Mortalitas LC50 (ppm) F1 0 0 1,85 101,85= 70,79 10 20 100 63,33 1000 80 F2 0 0 2,11 102,11= 128,82 10 6,67 100 43,33 1000 86,67 F3 0 0 2,33 102,33= 213,79 10 6,67 100 36,67 1000 73,33 F4 0 0 2,51 102,51= 323,59 10 6,67 100 46,67 1000 90 F5 0 0 2,76 102,76= 575,44 10 13,33 100 16,67 1000 63,33
Fraksi satu (F1) menunjukkan satu spot dengan nilai Rf paling besar yaitu
sebesar 0,506 dibandingkan spot pada fraksi lainnya. Hal ini mengindikasikan bahwa senyawa yang terkandung dalam fraksi satu sangat lemah teradsorpsi pada silika gel sehingga muncul paling awal. Fraksi satu selanjutnya diuji aktifitasnya sebagai antikanker terhadap sel HeLa dan diidentifikasi kandungan senyawanya dengan KG-SM.
5.6 Uji Kemurnian Isolat Toksik (F1)
Kemurnian isolat toksik F1 diuji dengan menggunakan metode KLT
dimana eluen yang digunakan adalah campuran pelarut dengan tingkat kepolaran yang berbeda-beda. Hasil KLT kemurnian memperlihatkan bahwa dari semua eluen yang digunakan memberikan noda tunggal. Jadi fraksi tersebut dapat dikatakan sebagai fraksi yang relatif murni secara kromatografi lapis tipis. Hasil selengkapnya dapat dilihat pada Tabel 5.7.
Tabel 5.7
Hasil Uji Kemurnian F1 dengan Metode KLT
Fase Gerak Penampak Noda Lampu UV Harga Rf (cm) 254 nm 366 nm
Etil asetat : n-heksana (7 : 3) Coklat Ungu 0,824 Etil asetat : n-heksana (1 : 9) Coklat Ungu 0,412 Kloroform : n-heksana (1 : 1) Coklat Ungu 0,353 Etanol : n-heksana (7 : 3) Coklat Ungu 0,918
5.7 Uji Antikanker secara in vitro terhadap Sel HeLa
Berdasarkan uji sitotoksisitas dengan MTT diperoleh nilai optical density (OD), kemudian nilai rata-rata OD tersebut dikonversi menjadi % daya hambat. Hasil pengamatan absorbansi dan perhitungan persen daya hambat pada sel HeLa setelah diberi isolat toksik (F1) ekstrak kloroform spons genus Haliclona Grant,
Data Optical Density (OD) Isolat Toksik (F1)
Ekstrak Spons Haliclona Grant, 1836 terhadap Sel HeLa Sampel
µg/ml
Ulangan Rerata % Daya
hambat
ODI ODII ODIII
1000 0,246 0,249 0,281 0,259 31,51 500 0,328 0,275 0,288 0,297 21,36 250 0,314 0,292 0,327 0,311 17,65 125 0,281 0,302 0,316 0,300 20,65 62,5 0,316 0,310 0,295 0,307 18,71 31,25 0,319 0,303 0,312 0,311 17,56 15,52 0,333 0,280 0,294 0,302 19,95 7,81 0,314 0,319 0,356 0,330 12.71 3,90 0,338 0,357 0,340 0,345 8,65 1,95 0,322 0,31 0,350 0,327 13.33 Kontrol Sel 0,376 0,378 0,379 0,378 0,00
Berdasarkan data pada Tabel 5.8 dapat dibuat grafik hubungan antara % daya hambat vs konsentrasi fraksi yang digunakan untuk perhitungan IC50.
Adapun grafik penentuan IC50 digambarkan pada Gambar 5.1.
Gambar 5.1.
Grafik % Daya Hambat Fraksi Satu Ekstrak Spons Genus Haliclona Grant, 1836 terhadap Sel HeLa
y = 0.016x + 15.00 R² = 0.703 0 5 10 15 20 25 30 35 0 200 400 600 800 1000 1200 % Daya ham b at Konsentrasi F1(µg/ml)
Mitokondrial reduktase
MTT (Kuning) (Kristal biru keunguan) Formazan Pengujian dengan menggunakan MTT didasarkan pada pemecahan garam tetrazolium yang berwarna kuning dan larut dalam air menjadi kristal biru keunguan (formazan) yang tidak larut dalam air. Pemecahan MTT terjadi pada mitokondria sel yang hidup oleh suksinat hidrogenase. Reaksi menggunakan MTT ini melibatkan piridin nukleotida kofaktor NADH dan NADPH yang hanya dikatalisis oleh sel hidup, sehingga jumlah formazan yang terbentuk proporsional dengan jumlah sel yang hidup (Doyle dan Griffiths, 2000).
Warna ungu formazan dapat dibaca absorbansinya dengan microplate reader pada panjang gelombang 595 nm. Intensitas warna ungu yang terbentuk berbanding langsung dengan jumlah sel yang aktif melakukan metabolisme, sehingga absorbansi menggambarkan jumlah sel hidup. Semakin kuat intensitas warna ungu yang terbentuk, absorbansi akan semakin tinggi, hal ini menunjukkan bahwa semakin banyak MTT yang diabsorbsi ke dalam sel hidup. MTT dipecah melalui reaksi reduksi oleh enzim reduktase dalam rantai respirasi mitokondria. Gambar 5.2 memperlihatkan reaksi reduksi MTT menjadi formazan.
Gambar 5.2.
Reaksi Reduksi MTT Menjadi Formazan N N N N S N CH3 CH3 Br N NH N N S N CH3 CH3
daya hambat sel HeLa dengan meningkatnya konsentrasi F1 yang diberikan. Daya
hambat tertinggi pada konsentrasi 1000 ppm dengan persen daya hambat 31,51 sedangkan daya hambat terendah pada konsentrasi 3,90 ppm dengan persen daya hambat 8,65. Menurut Iradjajanegara dan Priyo Wahyudi (2010), kecenderungan semakin tinggi konsentrasi ekstrak ceplukan (Physalis angulata) semakin banyak kandungan senyawa yang terdapat pada ekstrak tersebut sehingga semakin tinggi pula efek sitotoksik terhadap sel T47D. Perbedaan kadar sitotoksik pada setiap konsentrasi juga disebabkan adanya faktor biochemical uncoupling yaitu zat-zat yang terkandung di dalam ekstrak akan mempengaruhi sintesis molekul ATP tanpa mempengaruhi transfor electron (normal) dapat menyebabkan liberasi energy sehingga menghasilkan panas (Priyanto, 2007). Peningkatan dosis konsentrasi akan meningkatkan jumlah zat yang terkandung di dalamnya, efek biochemical uncoupling pun semakin banyak sehingga efek toksik akan semakin besar.
Hubungan antara konsentrasi F1 dengan persen daya hambat mengikuti
model persamaan y = 0,016x + 15,00, dengan y adalah % daya hambat dan x adalah konsentrasi F1 (ppm). Setelah nilai y disubstitusikan sama dengan 50,
maka diperoleh nilai IC50 adalah 2187,5 ppm. Perhitungan IC50 dapat dilihat pada
Lampiran 14.
Nilai IC50 menunjukkan nilai konsentrasi yang menghasilkan hambatan
proliferasi sel sebesar 50 % dari populasi. Klasifikasi aktivitas sitotoksik ekstrak terhadap sel kanker dapat digolongkan kategori sangat aktif jika nilai IC50 < 10
μg/mL, kategori aktif jika nilai IC50 10 – 100 μg/mL dan kategori cukup aktif jika
nilai IC50 100 - 500 μg/mL (Weerapreeyakul et al., 2012). Menurut Cao (1998),
senyawa murni digolongkan sangat aktif apabila memiliki nilai IC50 < 5 μg/mL, aktif 5-10 μg/mL, sedang 11-30 μg/mL dan tidak aktif >30 μg/mL. Berdasarkan klasifikasi tersebut, isolat F1 spons genus Haliclona Grant, 1836 mempunyai
aktivitas menghambat sel Hela dengan nilai IC50 2187,5 ppm (μg/mL), akan tetapi
tidak berpotensi untuk dikembangkan sebagai obat antikanker.
Nilai LC50 ekstrak kasar, partisi dan isolat toksik dengan metode BSLT
tidak menunjukkan adanya hubungan positif dengan nilai IC50 terhadap sel kanker
serviks HeLa dengan metode MTT. Penelitian lain juga menunjukkan hal yang serupa. Penelitian Carballo et al. (2002) dilaporkan senyawa isopropanol dari ekstrak spesies invertebrata dan makroalga laut menunjukkan korelasi yang rendah antara sitotoksisitas dengan BSLT dan sitotoksisitas terhadap sel kanker paru-paru (A-549) serta sel kanker usus (HT-29).
5.8 Identifikasi Isolat Toksik (F1)
Identifikasi isolat toksik dilakukan dengan uji fitokimia dan Kromatografi Gas-Spektroskopi Massa (KG-SM).
5.8.1 Uji fitokimia
Fraksi (F1) spons genus Haliclona Grant, 1836 diuji kandungan
fitokimianya. Adapun prosedur pembuatan larutan dan pengujian fitokimia masing-masing golongan disajikan pada Lampiran 12. Hasil skrining fitokimia fraksi disajikan pada Tabel 5.9.
Uji Fitokimia Fraksi Satu (F1) Hasil Kromatografi Kolom Ekstrak Kloroform
Uji Fitokimia Pereaksi Perubahan Warna Kesimpulan
Alkaloid Mayer Tidak ada perubahan -
Dragendrof Tidak ada perubahan -
Flavonoid Bate-Smith Tidak ada perubahan -
Triterpenoid/Steroid
Lieberman-Burchard Biru +
Polifenol FeCl3 1 % Tidak ada perubahan -
Saponin Uji busa/Froth +
HCl 2 % Tidak ada perubahan -
Berdasarkan hasil uji di atas mengindikasikan bahwa fraksi toksik (F1)
spons genus Haliclona Grant, 1836 mengandung senyawa golongan steroid.
5.8.2 Identifikasi isolat toksik (F1) dengan kromatografi gas-spektroskopi
massa (KG-SM)
Fraksi F1 dianalisis komponen senyawa yang terkandung di dalamnya
dengan menggunakan GC-MS. Kromatogram hasil analisis fraksi tersebut memperlihatkan 8 puncak seperti yang ditunjukkan pada Gambar 5.3. Masing-masing puncak diidentifikasi lebih lanjut dengan spektrometer massa, dimana setiap senyawa mempunyai pola fragmentasi massa yang spesifik.
Gambar 5.3.
Kromatogram Hasil Analisis Fraksi 1
1 2 3
4
Waktu Retensi (menit) Intensitas
Identifikasi dilakukan dengan membandingkan spektrum massa masing-masing puncak dengan senyawa-senyawa yang telah diketahui dan terprogram dalam database GC-MS, sehingga dapat diduga senyawa-senyawa penyusun Fraksi F1. Jumlah puncak pada kromatogram GC adalah 8 puncak, namun hanya 4
puncak (puncak 1, 2, 3, dan 4) yang dapat dianalisis berdasarkan data base MS. Sedangkan 4 puncak lainnya (puncak 5, 6, 7, dan 8) belum dapat dianalisis karena memiliki nilai kemiripan rendah dengan data base library MS, sehingga diperlukan beberapa identifikasi lanjutan seperti H-NMR dan C-NMR. Hasil analisis spektrum massa dari kromatogram F1 spons genus Haliclona Grant, 1836
dan perkiraan senyawa berdasarkan data base dapat dilihat pada Tabel 5.10. Tabel 5.10.
Senyawa-senyawa yang diduga dari Masing-masing Puncak pada Kromatogram Fraksi 1 Spons Genus Haliclona Grant, 1836
Puncak M+ Waktu Retensi
(menit) % Area Senyawa yang diduga
1 214 11,901 3,91 Metil dodekanoat
2 270 16,414 2,60 Metil heksadekanoat
3 320 17,419 6,85 Dekil metil ptalat
4 278 21,929 26,67
Mono(2-etilheksil)-1,2-Benzenadikarboksilat
Hasil spektrometer massa masing-masing puncak secara lengkap disajikan pada Lampiran 16.
1) Identifikasi senyawa pada puncak 1 dengan tR = 11,901 menit (3,91%)
Spektrum massa senyawa pada puncak 1 dan spektrum massa senyawa yang identik berdasarkan data base NIST08s. LIB dapat dilihat pada Gambar 5.4.
m/z m/z K el im p ah an re la ti f K el im p ah an re la ti f Gambar 5.4.
(a) Spektrum massa senyawa pada puncak 1, (b) Spektrum massa senyawa metil dodekanoat
Berdasarkan data dari library NIST08s. LIB senyawa metil dodekanoat mempunyai rumus molekul C13H26O2 dengan berat molekul 214. Oleh karena itu
ion molekul (M+) senyawa pada puncak 1 adalah m/z 214 dengan puncak dasar pada m/z 74. Pola pemenggalan spektrum massa pada senyawa puncak 1 dinyatakan seperti pada Tabel 5.11.
a)
Tabel 5.11
Kemungkinan Fragmen yang Hilang dari Senyawa Metil Dodekanoat
m/z Pemenggalan Penggalan 214 M+ C13H26O2+ 183 M+ - OCH3 C12H23O+ 171 M+ - C3H7 C10H19O2+ 157 M+ - C3H7 – CH2 C9H17O2+ 143 M+ - C3H7 – CH2 - CH2 C8H15O2+ 129 M+ - C3H7 – CH2 - CH2 - CH2 C7H13O2+ 115 M+ - C3H7 – CH2 - CH2 - CH2 - CH2 C6H11O2+ 101 M+ - C3H7 – CH2 - CH2 - CH2 - CH2 - CH2 C5H9O2+ 87 M+ - C3H7 – CH2 - CH2 - CH2 - CH2 - CH2 - CH2 C4H7O2+ 74 M+ - C3H7 – CH2 - CH2 - CH2 - CH2 - CH2 - CH2 - CH C3H6O2+ 57 M+ - C9H17O2 C4H9+ 41 M+ - C9H17O2 – CH4 C3H5+ 27 M+ - C9H17O2 – CH4 - CH2 C2H3+
Berdasarkan berat molekul dan pola fragmentasi dari pendekatan NIST08s. LIB, maka diduga senyawa puncak 1 identik dengan senyawa metil dodekanoat yang strukturnya terlihat pada Gambar 5.5.
Gambar 5.5.
Struktur senyawa metil dodekanoat
Fragmentasi yang terjadi pada senyawa metil dodekanoat sesuai dengan spektrum massa di atas ditunjukkan pada Gambar 5.6.
O
-OCH3 (-31) -C3H7 (-43) Chemical Formula: C10H19O2+ m/z: 171 -CH2 (-14) Chemical Formula: C9H17O2+ m/z: 157 -CH2 (-14) Chemical Formula: C8H15O2 + m/z: 143 -CH2 (-14) Chemical Formula: C7H13O2+ m/z: 129 -CH2 (-14) Chemical Formula: C6H11O2+ m/z: 115 Chemical Formula: C5H9O2+ m/z: 101 -CH2 (-14) Chemical Formula: C4H7O2+ m/z: 87 -CH (-13) Chemical Formula: C3H6O2+ m/z: 74 O Chemical Formula: C13H26O2 + m/z: 214 -e O O O Chemical Formula: C12H23O+ m/z: 183 H2C O O H2C O O H2C O O H2C O O H2C O O H2C O O H2C O O H2C O O HC O O H O O H H H O O H H H
-C9 H17O2 (-14) -CH4 (-16) -CH2 (-14) m/z m/z K el im p ah an re la ti f K el im p ah an re la ti f Fragmentasi 2 Gambar 5.6.
Pola Fragmentasi Senyawa Metil Dodekanoat
2) Identifikasi senyawa pada puncak 2 dengan tR = 16,414 menit (2,60 %)
Spektrum massa senyawa pada puncak 2 dan spektrum massa senyawa yang identik berdasarkan data base WILEY7. LIB dapat dilihat pada Gambar 5.7.
Gambar 5.7.
(a) Spektrum Massa Senyawa pada Puncak 2, (b) Spektrum Massa Senyawa Metil Heksadekanoat
Berdasarkan data dari library WILEY7. LIB senyawa metil heksadekanoat mempunyai rumus molekul C17H34O2 dengan berat molekul 270. Oleh karena itu
O O Chemical Formula: C13H26O2+ m/z: 214 CH2 Chemical Formula: C4H9 + m/z: 57 CH Chemical Formula: C3H5+ m/z: 41 CH H2C Chemical Formula: C2H3+ m/z: 27 a) b)
pada m/z 74. Pola pemenggalan spektrum massa pada senyawa puncak 1 dinyatakan seperti pada Tabel 5.12.
Tabel 5.12
Kemungkinan Fragmen yang Hilang dari Senyawa Metil Heksadekanoat
m/z Pemenggalan Penggalan 270 M+ C17H34O2+ 239 M+ - OCH3 C16H31O+ 227 M+ - C3H7 C14H27O2+ 213 M+ - C3H7 – CH2 C13H25O2+ 199 M+ - C3H7 – CH2 - CH2 C12H23O2+ 185 M+ - C3H7 – CH2 - CH2 - CH2 C11H21O2+ 171 M+ - C3H7 – CH2 - CH2 - CH2 - CH2 C10H19O2+ 157 M+ - C3H7 – CH2 - CH2 - CH2 - CH2 - CH2 C9H17O2+ 143 M+ - C3H7 – CH2 - CH2 - CH2 - CH2 - CH2 - CH2 C8H15O2+ 129 M+ - C3H7 – CH2 - CH2 - CH2 - CH2 - CH2 - CH2 – CH2 C7H13O2+ 115 M+ - C3H7 – CH2 - CH2 - CH2 - CH2 - CH2 - CH2 – CH2 – CH2 C6H11O2+ 101 M+ - C3H7 – CH2 - CH2 - CH2 - CH2 - CH2 - CH2 – CH2 – CH2 – CH2 C5H9O2+ 87 M+ - C3H7 – CH2 - CH2 - CH2 - CH2 - CH2 - CH2 – CH2 – CH2 – CH2 – CH2 C4H7O2+ 74 M+ - C3H7 – CH2 - CH2 - CH2 - CH2 - CH2 - CH2 – CH2 – CH2 – CH2 – CH2 - CH C3H6O2+ 69 M+ - C12H25O2 C5H9+ 41 M+ - C12H25O2 – CH2 – CH2 C3H5+
Berdasarkan berat molekul dan pola fragmentasi dari pendekatan WILEY7.LIB, maka diduga senyawa puncak 2 identik dengan senyawa metil heksadekanoat yang strukturnya terlihat pada Gambar 5.8.
Gambar 5.8.
Struktur Senyawa Metil Heksadekanoat
Fragmentasi yang terjadi pada senyawa metil heksadekanoat sesuai dengan spektrum massa di atas ditunjukkan pada Gambar 5.9.
O O
-OCH3 (-31) -C3H7 (-43) -CH2 (-14) -CH2 (-14) -CH2 (-14) -CH2 (-14) -CH2 (-14) -CH2 (-14) -CH2 (-14) -CH2 (-14) Chemical Formula: C5H9O2+ m/z: 101 -CH2 (-14) -CH2 (-14) Chemical Formula: C4H7O2 + m/z: 87 -CH (-13) Chemical Formula: C3H6O2+ m/z: 74 Fragmentasi 1 O O Chemical Formula: C17H34O2+ m/z: 270 -e O O O Chemical Formula: C16H31O+ m/z: 239 H2C O O Chemical Formula: C14H27O2+ m/z: 227 H2C O O Chemical Formula: C13H25O2+ m/z: 213 H2C O O Chemical Formula: C12H23O2+ m/z: 199 H2C O O Chemical Formula: C11H21O2+ m/z: 185 H2C O O Chemical Formula: C10H19O2 + m/z: 171 Chemical Formula: C9H17O2+ m/z: 157 H2C O O H2C O O Chemical Formula: C8H15O2+ m/z: 143 H2C O O Chemical Formula: C7H13O2+ m/z: 129 H2C O O Chemical Formula: C6H11O2 + m/z: 115 H2C O O H2C O O HC O O H O O H H H O O H H H
9 17 2 (-14) -C2H4 (-28) m/z m/z K el im p ah an re la ti f K el im p ah an re la ti f Gambar 5.9.
Pola Fragmentasi Senyawa Metil Heksadekanoat
3) Identifikasi senyawa pada puncak 3 dengan tR = 17,419 menit (6,85 %)
Spektrum massa senyawa pada puncak 3 dan spektrum massa senyawa yang identik berdasarkan data base NIST08. LIB dapat dilihat pada Gambar 5.10
.
Gambar 5.10.
(a) Spektrum Massa Senyawa pada Puncak 3, (b) Spektrum Massa Senyawa Dekil Metil Ptalat
O O H H CH H2C H Chemical Formula: C17H34O2+ m/z: 270 Chemical Formula: C5H9+ m/z: 69 CH2 H2C CH2 H2C Chemical Formula: C3H5+ m/z: 41 a) b)
O O
O O
Berdasarkan data dari library NIST08. LIB senyawa dekil metil ptalat mempunyai rumus molekul C19H28O4 dengan berat molekul 320. Oleh karena itu
ion molekul (M+) senyawa pada puncak 3 adalah m/z 320 dengan puncak dasar pada m/z 163. Tidak terlihatnya M+ pada m/z 320 kemungkinan disebabkan tidak stabilnya M+ dan segera melepaskan C10H20. Pola pemenggalan spektrum massa
pada senyawa puncak 3 dinyatakan seperti pada tabel 5.13. Tabel 5.13.
Kemungkinan Fragmen yang Hilang dari Senyawa Dekil Metil Ptalat
m/z Pemenggalan Penggalan 320 M+ C19H28O4+ 180 M+ - C10H20 C9H8O4+ 163 M+ - C10H20 - OH C9H7O3+ 149 M+ - C10H20 – OH - CH2 C8H5O3+ 121 M+ - C10H20 – OH - CH2 - CO C7H5O2+ 104 M+ - C10H20 – OH - CH2 – CO - OH C7H4O+ 57 M+ - C15H19O4 C4H9+ 41 M+ - C15H19O4 – CH4 C3H5+ 27 M+ - C15H19O4 – CH4 – CH2 C2H3+
Berdasarkan berat molekul dan pola fragmentasi dari pendekatan NIST08. LIB, maka diduga senyawa puncak 3 identik dengan senyawa dekil metil ptalat yang strukturnya terlihat pada Gambar 5.11.
Gambar 5.11.
Struktur Senyawa Dekil Metil Ptalat
Fragmentasi yang terjadi pada senyawa dekil metil ptalat sesuai dengan spektrum massa di atas ditunjukkan pada Gambar 5.12.
O O O O -C10H20 (-140) O O O O C H2 H -OH (-17) Chemical Formula: C19H28O4+ m/z: 320 -e O OH O O Chemical Formula: C9H8O4+ m/z: 180 O O O GH2 H Chemical Formula: C9H7O3 + m/z: 163 -CH2 (-14) Chemical Formula: C8H5O3+ m/z: 149 O OH O Chemical Formula: C7H5O2+ m/z: 121 Chemical Formula: C7H4O+ m/z: 121 Chemical Formula: C19H28O4+ m/z: 320 -C15H19O4 (-263) Chemical Formula: C4H9+ m/z: 57 -CH4 (-16) Chemical Formula: C3H5+ m/z: 41 -CH2 (-14) Fragmentasi II Gambar 5.12.
Pola Fragmentasi Senyawa Dekil Metil Ptalat
-CO (-28) OH O -OH (-17) C O O O O O H2C CH CH H2C Chemical Formula: C2H3+ m/z: 27
m/z m/z K el im p ah an re la ti f K el im p ah an re la ti f
4) Identifikasi senyawa pada puncak 4 dengan tR = 21,929 menit (26,67 %)
Spektrum massa senyawa pada puncak 4 dan spektrum massa senyawa yang identik berdasarkan data base NIST08. LIB dapat dilihat pada Gambar 5.13
Gambar 5.13.
(a) Spektrum Massa Senyawa pada Puncak 4, (b) Spektrum Massa Senyawa mono(2-etilheksil)-1,2-Benzenadikarboksilat
Berdasarkan data dari library NIST08. LIB senyawa mono(2-etilheksil)-1,2-Benzenadikarboksilat mempunyai rumus molekul C16H22O4 dengan berat
molekul 278. Oleh karena itu ion molekul (M+) senyawa pada puncak 4 adalah m/z 278 dengan puncak dasar pada m/z 149. Puncak dasar dengan m/z 149 umumnya mengindikasi golongan senyawa turunan benzene 1,2-dikarboksilat (Silverstein, et al. 1986). Pada kedua spektra massa di atas terlihat bahwa pada NIST08. LIB dan spektra massa sampel puncak m/z 278 tidak muncul. Sedangkan spektra puncak yang muncul adalah pada m/z 279. Puncak pada m/z 279
a)
pada senyawa puncak 4 dinyatakan seperti pada Tabel 5.14. Tabel 5.14.
Kemungkinan Fragmen yang Hilang dari Senyawa mono(2-etilheksil)-1,2-Benzenadikarboksilat m/z Pemenggalan Penggalan 278 M+ C16H22O4+ 167 M+ - C8H15 C8H7O4+ 149 M+ - C8H15 – H2O C8H5O3+ 71 M+ - C11H11O4 C5H11+ 57 M+ - C11H11O4 – CH2 C4H9+ 41 M+ - C11H11O4 – CH2 – CH4 C3H5+ 27 M+ - C11H11O4 – CH2 – CH4 – CH2 C2H3+
Berdasarkan berat molekul dan pola fragmentasi dari pendekatan NIST08. LIB, maka diduga senyawa puncak 4 identik dengan senyawa mono(2-etilheksil)-1,2-Benzenadikarboksilat yang strukturnya terlihat pada Gambar 5.14.
Gambar 5.14.
Struktur Senyawa mono(2-etilheksil)-1,2-Benzenadikarboksilat
Fragmentasi yang terjadi pada senyawa mono(2-etilheksil)-1,2-Benzenadikarboksilat sesuai dengan spektrum massa di atas ditunjukkan pada Gambar 5.15.
O OH
O O
-e Chemical Formula: C16H22O4 + m/z: 278 -C8H15 (-111) Chemical Formula: C8H7O4+ m/z: 167 -H2O (-18) Chemical Formula: C8H5O3 + m/z: 149 Chemical Formula: C16H22O4+ m/z: 278 -C11H11O4 (-207) Chemical Formula: C5H11+ m/z: 71 -CH2 (-14) Chemical Formula: C4H9 + m/z: 57 -CH4 (-16) Chemical Formula: C3H5 + m/z: 41 -CH2 (-14) Fragmentasi 1 Fragmentasi 2 Gambar 5.15.
Pola Fragmentasi Senyawa mono(2-etilheksil)-1,2-Benzenadikarboksilat
O OH O O O OH O O O OH O C O CH2 H H O OH O H O H O OH O H O H O OH O H O H OH O O O OH O C O H H2C H2C CH CH H2C Chemical Formula: C2H3+ m/z: 27
menunjukkan bahwa fraksi satu spons genus Haliclona Grant, 1836 mengandung empat komponen senyawa yang diidentifikasi sebagai metil dodekanoat, metil heksadekanoat, dekil metil ptalat, dan mono(2-etilheksil)-1,2-benzenadikarboksilat.
Berdasarkan beberapa penelitian yang telah dilakukan diketahui senyawa metil heksadekanoat dan turunan asam benzenadikarboksilat memiliki sifat toksik. Hasil penelitian Kumar et al. (2010) dan Maruthupandian dan Mohan (2011) melaporkan bahwa metil heksadekanoat terbukti memiliki aktivitas sebagai antioksidan. Senyawa mono(2-etilheksil)-1,2-benzenadikarboksilat merupakan senyawa ester turunan asam karboksilat C16 – C18. Dalam penelitian Rizwan et al. (2012) dilaporkan senyawa mono(2-etilheksil)-1,2-benzenadikarboksilat yang diisolasi dari Agave attenuate dikatakan memiliki aktivitas antimikroba. Chairman et al. (2012) menyatakan senyawa bis(etil heksil) ptalat yang diisolasi dari Streptomyces bangladeshiensis menunjukkan aktivitas antimikroba, selain itu senyawa 2-etil heksil ptalat yang diisolasi dari Alchorneya cordifolia memiliki aktivitas inflamasi.
Sudha dan Masilamani (2012) menyatakan bahwa senyawa bis-2-metilpropilbenzendikarbosilat dan isooktil ptalat yang diisolasi dari Streptomyces avidinii strain SU4 memiliki aktivitas antikanker. Yoke et al. (2012) mengisolasi dinonil-1,2-benzenedikarboksilat dari Clinachantus nutans Lidau yang memiliki efektivitas antioksidan dan antiproliferasi. Berdasarkan ulasan dari beberapa
penelitian di atas, maka senyawa yang diisolasi dari spons genus Haliclona Grant, 1836 memiliki sifat toksik.
