22
BAB IV
METODE PENELITIAN
4.1 Rancangan Penelitian
Penelitian ini dilakukan menggunakan metode penelitian eksperimental, yaitu mengetahui pengaruh variasi kadar Centella asiatica sebagai bahan aktif dalam sediaan gel peel off mask kombinasi ekstrak pegagan (Centella asiatica) dengan niacinamida 4% terhadap pertumbuhan bakteri Propionibacterium acne.
Selanjutnya dilakukan pengujian aktivitas antibakteri menggunakan metode sumuran.
4.2 Tempat dan Waktu Penelitian 4.2.1 Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Teknologi Sediaan Farmasetika, Program Studi Farmasi, Fakultas Ilmu Kesehatan dan Laboratorium Biomedik, Fakultas Kedokteran, Universitas Muhammadiyah Malang.
4.2.2 Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan pada bulan Juni sampai dengan bulan Agustus 2020
4.3 Identifikasi Variabel 4.3.1 Variabel Bebas
Variabel bebas pada penelitian ini adalah penggunaan kadar bahan aktif ekstrak Centella asiatica pada konsentrasi 1,25%, 2,5% dan 5%.
4.3.2 Variabel Tergantung
Variabel tergantung pada penelitian ini adalah diameter zona hambat dari propionibacterium acne yang dihasilkan pada media agar plate metode sumuran.
4.4 Alat dan Bahan Penelitian 4.4.1 Alat Penelitian
Adapun alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi:
pH meter Basic, Neraca analitikal digital, Steroglass hot plate, tabung reaksi, cawan petri, jarum ose, mikropipet, label, autoclave, toples kaca, lilin, incubator dan Laminar Air Flow (LAF).
4.4.2 Bahan Penelitian
Bahan- bahan yang digunakan dalam penelitian ini menggunakan: ekstrak Pegagan (Centella asiatica), Niacinamida, PVA, Propilen glikol, Carbomer, TEA, Metil paraben, BHT dan aquadest.. Adapun untuk melakukan uji aktivitas bakteri dibutuhkan bakteri Propionibacterium acne dan Clindamycin sebagai kontrol positif.
4.5 Metode Kerja
Gambar 4.1 Bagan Alur Kerja Penelitian
Sebelum dilakukan penelitian, terlebih dahulu dilakukan uji karakterisasi dari bahan aktif Centella asiatica. Pengujian dilakukan dengan cara mengamati
Analisis data
Identifikasi ekstrak pegagan (Centella asiatica) dengan dilakukan pengujian organoleptis dan uji aktivitas antibakteri terhadap pertumbuhan Propionibacterium acne.
Pembuatan sediaan gel peel off mask dari Centella asiatica dengan kadar (1,25%, 2,5%, dan 5%) niacinamid 4% menggunakan gelling agent Carbomer dan pembentuk film
PVA.
Formula 2 dengan kadar Centella asiatica 2,5%
Formula 3 dengan kadar Centella asiatica 5%
Formula 1 dengan kadar Centella asiatica 1,25%
Evaluasi Sediaan Uji antibakteri terhadap Propionobacterium acne
organoleptis dari warna dan bau, kemudian dilakukan uji aktivitas antibakteri terhadap pertumbuhan Propionibacterium acne. Pembuatan sediaan gel peel off mask ekstrak pegagan (Centella asiatica) dengan kadar 1,25%, 2,5% dan 5%, Niacinamid 4% menggunakan gelling agent carbomer dengan kadar 0,5% dan pembentuk lapisan film PVA dengan kadar 10%. Terdapat 3 formula gel peel off mask yang akan diuji karakteristiknya meliputi karakeristik fisika (organoleptis, viskositas, penetapan daya sebar), kimia (pH), dan uji aktivitas antibakteri terhadap Propionibacterium acne dengan metode sumuran.
Masing-masing formulasi dilakukan replikasi produksi sebanyak tiga kali dengan bobot sediaan 100 g. Setelah itu dilakukan pengujian pada sediaan gel peel off mask dari Centella asiatica kombinasi niacinamid yang telah jadi. Bagan alur kerja penelitian dapat dilihat pada Gambar 4.1 diatas.
4.5.1 Formulasi Gel Peel off Mask Centella asiatica
Dalam penelitian ini dibuat gel peel off mask dari Centella asiatica kombinasi niacinamid sebanyak tiga formula dengan perbedaan pada variasi kadar Centella asiatica yaitu FI= 1,25%, FII= 2,5%, FIII= 5% dan masing-masing formula dilakukan replikasi produksi sebanyak tiga kali. Berikut adalah rancangan formula dari tiga formula yang akan dibuat:
Tabel IV.1 Formula Peel off Mask Centella asiatica kombinasi Niacinamid
Nama Bahan Fungsi Berat dalam %
FI FII FIII F0
Ekstrak Pegagan
Bahan aktif 1,25% 2,5% 5% -
Niacinamid Bahan aktif 4% 4% 4% -
PVA Pembentuk lapisan
film
10% 10% 10% 10%
Carbomer Gelling agent 0,5% 0,5% 0,5% 0,5%
TEA Alkalizing agent 1,5% 1,5% 1,5% 1,5%
Propilen glikol Humektan 5% 5% 5% 5%
Metil Paraben Pengawet 0,2% 0,2% 0,2% 0,2%
BHT Antioksidan 0,5% 0,5% 0,5% 0,5%
Aquadest Pelarut 100 g 100 g 100 g 100g
Berikut merupakan skema kerja pembuatan sediaan gel peel off mask, dapat dilihat pada Gambar 4.2 dibawah ini :
Gambar 4.2 Skema Kerja Pembuatan Gel Peel off Mask Centella asiatica
4.5.2 Uji Aktivitas Antibakteri
Metode yang dipilih untuk pengujian antibakteri pada sediaan gel peel off mask Centella asiatica adalah metode sumuran, Tahapan prosedur dilakukan berdasarkan penelitian Prayoga (2013) dengan modifikasi sebagai berikut:
1. Pembuatan Media MHA (Mueller Hinton Agar)
Pembuatan medium Muller Hinton Agar (MHA) media MHA ditimbang sebanyak 12,16 gram kemudian dimasukkan ke dalam Erlenmeyer 500 mL, kemudian dilarutkan dengan 320 mL aquades steril, dipanaskan sampai mendidih. MHA yang telah dibuat dituang ke dalam tabung reaksi steril masing-masing sebanyak 20ml kemudian ditutup kertas aluminium dan disterilkan dalam autoklaf 15 menit dengan suhu 121ºC. kemudian media
Disiapkan alat dan bahan
Ditimbang masing-masing bahan yang dibutuhkan pada setiap formula
Metil paraben, Niacinamid dan BHT dilarutkan kedalam Propilen glikol aduk ad larut kemudian tambahkan ke campuran A gerus ad homogen (campuran
C)
Kembangkan PVA kedalam air panas pada suhu 80oC dan diaduk hingga homogen (campuran B)
Sediaan yang sudah homogen, lakukan cek pH kembali.
(Campuran B) masukkan ke dalam (Campuran C) di dalam mortir kemudian masukkan ekstrak Centella asiatica dan gerus sampai homogen.
Kembangkan carbomer dengan aquades dan tambahkan TEA 1,5%, gerus hingga menjadi bentuk gel (campuran A)
disimpan dilemari es. Media dapat digunakan dengan cara dipanaskan kembali sampai mendidih dan dituangkan kedalam cawan petri (Zahro &
Agustini, 2013).
2. Kultur bakteri
Pembuatan stok bakteri ini dilakukan untuk memperbanyak dan meremajakan bakteri, dengan cara menginokulasikan 1 oce biakan murni bakteri Propionibacterium acne ke dalam MHA kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam didalam inkubator.
3. Pembuatan Mc Farland
Larutan H2SO4 0,36 N sebanyak 99,5 ml dicampurkan dengan larutan BaCL2.2H20 1,175% sebanyak 0,5 ml dalam erlenmayer. Kemudian dikocok sampai terbentuk larutan yang keruh. Kekeruhan ini dipakai sebagai standar kekeruhan suspensi bakteri uji (Prayoga, 2013).
4. Pembuatan Suspensi Bakteri
Bakteri uji diambil sebanyak 1 ose dengan kawat ose steril lalu disuspensikan kedalam tabung yang berisi 2 ml larutan NaCl 0,9% sehingga diperoleh kekeruhan yang sama dengan standar kekeruhan larutan Mc.
Farland (Susanto dkk.,2012)
5. Tahap pengujian daya hambat bakteri
Diambil 1 tabung media MHA (20ml) kemudian dipanaskan hingga mendidih, setelah media dalam kondisi hangat dituangkan ke dalam cawan petri yang telah diberi suspensi bakteri sebanyak 1ml, campuran ini dihomogenkan dengan cara digoyang-goyang kemudian ditutup dan dibiarkan memadat
Buat lubang di media MHA yang telah diinokulasikan bakteri menggunakan cork borer dengan dimeter lubang 7mm sebanyak 5 lubang
Kemudian masukan sediaan peel off mask, kontrol (+) dan kontrol (-) menggunakan mikropipet masing-masing sebanyak 50 µL ke dalam setiap lubang dimedia MHA
Dimasukan kedalam toples kaca kemudian diberi lilin kecil,tutup rapat dan diinkubasi ke dalam inkubator pada suhu 37oC selama 24 jam
Amati dan ukur diameter zona terang (clear zone) yang terbentuk disekitar lubang
Gambar 4.3 Desain Penempatan Lubang Sumuran Keterangan : A : Kontrol + ( Clindamycin)
B : Kontrol – ( Formula tanpa kandungan bahan aktif) C : Formula I
D : Formula II E : Formula III 6. Pengukuran diameter zona hambat
Pengamatan dilakukan dengan cara mengukur zona terang (clear zone) yang terbentuk menggunakan jangka sorong dengan cara mengukur secara horizontal dan vertical sehingga dapat disebut dengan zona hambat.
Menurut (Susanto & Ruga, 2012) kategori zona hambat dapat diketahui pada Tabel 3.
Tabel IV.2 Kategori Diameter Zona Hambat Diameter Kekuatan daya hambat
≤ 5 mm Lemah
6-10 mm Sedang
11-20 mm Kuat
≥21 mm Sangat kuat
B
E
D A C
4.6 Metode Analisis
Data yang diperoleh dari uji antibakteri dianalisa secara statistik menggunakan software SPSS (Statistical Product and Service Solution) dengan menggunakan metode one way anova untuk mengetahui perbedaan dari masing- masing kelompok perlakuan dengan taraf kepercayaan 95% atau α = 0,05. Untuk mengetahui formula mana yang terdapat perbedaan yang bermakna dapat dilihat dari nilai P signifikasi. Apabila P signifikasi yang didapat lebih besar dari derajat kemaknaan 0,05 maka tidak ada perbedaan yang bermakna, dan sebaliknya jika nilai P signifikasi lebih kecil dari derajat kemaknaan 0,05 maka menunjukan ada perbedaan yang bermakna. Dilanjutkan dengan uji Tukey HSD (Honestly Significant Difference) untuk mengetahui formula mana yang berbeda.
