Nova Nurfauziawati VI. PEMBAHASAN

VI. PEMBAHASAN

Mutu mokrobiologis dari suatu produk makanan ditentukan oleh jumlah dan jenis mikroorganisme yang terdapat dalam bahan pangan. Mutu mikrobiologis ini akan menentukan ketahanan simpan dari produksi tersebut ditinjau dari kerusakan oleh mikroorganisme, dan keamanan produk dari mikroorganisme ditentukan oleh jumlah spesies patogenik yang terdapat. Jadi kemampuan untuk mengukur secara tepat jumlah mikroorganisme yang umum terdapat dalam bahan pangan dan jumlah organisme spesifik yang berada dalam produk pangan merupakan dasar yang penting bagi mikrobiologi pangan (Buckle dkk, 1985).

Anaisis kuantitatif mikrobiologi pada bahan pangan penting dilakukan untuk mengetahui mutu bahan pangan dan menghitung proses pengawetan yang akan diterapkan pada bahan pangan tersebut. Beberapa cara yang dapat digunakan untuk menghitung atau mengukur jumlah jasad renik di dalam suatu suspensi atau bahan, yang dapat dibedakan atas beberapa kelompok yaitu:

A. Perhitungan jumah sel 1. Hitungan mikroskopis 2. Hitungan cawan

3. MPN (Most Probable Number) B. Perhitungan massa sel secara langsung

1. Volumetrik 2. Gravimetrik

3. Kekeruhan (turbidimetri)

C. Perhitungan massa sel secara tidak langsung

1. Analisis komponen sel (protein, DNA, ATP dan sebagainya)

2. Analisis produk katabolisme (metabolit primer atau sekunder, panas) 3. Analisis konsumsi nutrien (karbon, nitrogen, oksigen, asam amino,

mineral, dan sebagainya) (Fardiaz, 1992).

Pertumbuhan mikroorganisme dapat kita lihat dalam kurva semi-log yang juga menunjukkan beberapa fase dalam pertumbuhan mikrorganisme.

Pertumbuhan mikroorganisme dibagi dalam beberapa fase yaitu :

 Fase adaptasi

 Fase pertumbuhan awal

 Fase logaritmik

 Fase pertumbuhan lambat

 Fase pertumbuhan tetap (statis)

 Fase menuju kematian

 Fase kematian (Fardiaz, 1992)

Pertumbuhan mikroorganisme juga dipengaruhi oleh beberapa faktor termasuk keadaan lingkungan dan jumlah awal inokulum yang di isolasi pada medium. Pada praktikum kali ini dilakukan dua metode perhitungan mikroorganisme, yaitu metode Petroff-Hausser dan metode MPN (Most Probable Number).

A. Metode Petroff-Hauser

Penghitungan secara langsung dapat dilakukan secara mikroskopis yaitu dengan menghitung jumlah bakteri dalam satuan isi yang sangat kecil. Alat yang digunakan adalah Petroff-Hauser Chamber atau Haemocytometer. Jumlah cairan yang terdapat antara cover glass dan alat ini mempunyai volume tertentu sehingga satuan isi yang terdapat dalam satu bujur sangkar juga tertentu.

Ruang hitung terdiri dari 9 kotak besar dengan luas 1 mm². Satu kotak besar di tengah, dibagi menjadi 25 kotak sedang dengan panjang 0,2 mm. Satu kotak sedang dibagi lagi menjadi 16 kotak kecil. Dengan demikian satu kotak besar tersebut berisi 400 kotak kecil. Tebal dari ruang hitung ini adalah 0,1 mm. Tinggi contoh yang terletak antara gelas objek dengan gelas penutup adalah 0,02 mm (Fardiaz, 1992). Sel bakteri yang tersuspensi akan memenuhi volume ruang hitung tersebut sehingga jumlah bakteri per satuan volume dapat diketahui.

Gambar 1. Metode Petroff Hauser (eknom-saurus, 2011)

Gambar 2. Metode Petroff-Hauser (eknom-saurus, 2011)

Pada praktikum kali ini, sampel yang digunakan adalah bakteri Lactobacillus bulgaricus. Langkah-langkah dalam praktikum ini diantaranya Petroff-Hauser Counting Chamber atau Haemocytometer dibersihkan dengan alkohol 70 %. Pembersihan ini bertujuan agar Petroff- Hausser steril. Alkohol 70% merupakan dosisi yang cocok untuk sterilisasi alat sebelum digunakan untuk praktikum. Kemudian mengeringkannya dengan tissue, dalam proses pengeringan ini, tissue hanya ditekan-tekankan saja tidak diperkenankan untuk menggosok- gosokan. Apabila tissue digosok-sosokan khawatir garis-garis kotak yang

terdapat pada Petroff-Hausser akan terhapus dan menyulitkan dalam perhitungan jumlah bakteri ketika di amati dibawah mikroskop. Langkah selanjutnya adalah mengambil sampel bakteri menggunakan jarum suntik dan meneteskannya di atas Petroff-Hausser. Sampel bakteri akan menyebar dengan sendirinya karena adanya kapilaritas. Setelah itu membiarkannya sejenak sehingga sampel bakteri diam di tempat dan tidak terkena efek kapilaritas. Kemudian mengamatinya di bawah mikroskop dengan perbesaran 40/0,65. Bakteri di amati dan di hitung pada lima titik yang berbeda, yakni pada titik di setiap ujung dan titik di bangian tengah-tengah. Selanjutnya, bakteri di hitung dengan menggunakan persamaan:

Ruang hitung = 9 kotak besar; L = 1 mm² 1 kotak besar  25 kotak sedang; P = 0,2 mm 1 kotak sedang  16 kotak kecil

1 kotak besar  400 kotak kecil Tebal ruang hitung 0,1 mm.

Luas kotak sedang = S x S = 0,2 x 0,2 = 0,04 mm² Volume kotak = p x l x t

= 0,2 mm x 0,2 mm x 0,1 mm

= 4 x 10^-3 mm³

= 4 x 10^-6 cm³

= 4 x 10^-6 ml Sel/ml = jumlah sel/4x10^-6 ml

= (jumlah sel/4) x 10⁶

= jumlah sel x (¼) x 10⁶

= jumlah sel x 2,5 x 10⁵

Kotak sedang : Jumlah sel/ml = jumlah sel x 2,5 x 10⁵

= jumlah sel x 0,25 x 10⁶

Dengan perhitungan yang sama maka diperoleh rumus untuk:

Kotak kecil : Jumlah sel/ml = jumlah sel x 4 x 10⁶

Jumlah mikroorganisme (kotak sedang) = jumlah sel x 0,25 x 10⁶

Hasil pengamatan bakteri Lactobacillus bulgaricus di bawah mikroskop dengan metode Petroff-Hausser tampak seperti berikut:

Berdasarkan pengamatan di atas, dapat dihitung bahwa jumlah bakteri adalah:

Sel/ml = jumlah sel/4x10^-6 ml

= (jumlah sel/4) x 10⁶

= jumlah sel x (¼) x 10⁶

= jumlah sel x 2,5 x 10⁵

Kotak sedang : Jumlah sel/ml = jumlah sel x 2,5 x 10⁵

Jumlah mikroorganisme (bakteri) = jumlah rata-rata bakteri x 0,25 x 10⁶ Jumlah bakteri = ¹²

5 = 2,4 x 0,25 x 10⁶

= 6 x 10⁶ bakteri per milimeter.

Bakteri Lactobacillus bulgaricus yang dapat dihitung menggunakan metode Petroff-Hauser pada praktikum ini adalah 6 x 10⁶ bakteri per milimeter. Metode Pertoff-Hausser merupakan metode

miskropkopik dan juga merupakan metode yang cepat dan murah, tetapi memiliki beberapa kelemahan. Kelemahan tersebut diantaranya:

1. Sel-sel yang telah mati tidak dapat dibedakan dari sel-sel hidup. Oleh karena itu, keduanya akan terhitung.

2. Sel-sel yang berukuran sangat kecil sukar dilihat di bawah mikroskop, sehingga kadang-kadang tidak terhitung.

3. Untuk mempertinggi ketelitian, jumlah sel di dalam suspensi harus cukup tinggi, misalnya untuk bakteri minimal 10⁶ sel/ml. Hal ini disebabkan karena setiap bidang pandang yang diamati harus terdapat sejumlah sel yang dapat dihitung.

4. Tidak dapat digunakan untuk menghitung sel jasad renik di dalam bahan pangan yang banyak mengandung debris atau ekstrak makanan, karena hal ini akan mengganggu dalam perhitungan sel (Fardiaz, 1992).

B. Metode MPN (Most Probable Number)

Most Probable Number dalam bidang kesehatan masyarakat dari mikrobiologi pangan, dipergunakan secara luas untuk menghitung jumlah bakteri yang ada dalam bahan pangan. Media ini banyak digunakan untuk menghitung bakteri patogenik dalam jumlah sedikit yang terdapat dalam bahan pangan. Metoda ini berdasarkan atas pengenceran. Apabila suatu larutan yang mengandung sel-sel mikroorganisme diencerkan terus- menerus, akhirnya akan diperoleh suatu larutan dimana tidak dijumpai sel lagi yaitu dikatakan steril (Buckle dkk, 1985).

Metode MPN digunakan medium cair di dalam tabung reaksi, dimana perhitungan dilakukan berdasarkan pada jumlah tabung yang positif yaitu yang ditumbuhi oleh jasad renik setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu. Pengamatan tabung yang positif dapat dilihat dengan mengamati timbulnya kekeruhan, atau timbulnya gas di dalam tabung kecil (tabung Durham) yang diletakkan pada posisi terbalik, yaitu untuk jasad renik pembentukan gas. Untuk setiap pengenceran pada umumnya digunakan tiga tau lima seri tabung. Lebih banyak tabung yang digunakan

menunjukkan ketelitian yang lebih tinggi, tetapi alat gelas yang digunakan juga lebih banyak. (Fardiaz, 1992).

Pada praktikum kali ini menggunakan tiga seri tabung, yakni untuk sampel sebanyak 10 ml ditumbuhkan pada media NBDS (Natrium Broth Double Stregth) yang memiliki komposisi Beef extract (3 gr), peptone (5 gr), natrium (10 gr) dan Bromthymol Blue (0,2 %) per liternya. Untuk sampel 1 ml dan 0,1 ml dimasukkan pada media LBSS (Natrium Broth Single Stregth) yang berkomposisi sama tapi hanya kadar natrium setengah dari LBDS yaitu 5 gr.

Pada praktikum kali ini, sampel yang digunakan yaitu ABC Mr.

Juice Jambu, Tekita, ABC Jambu dan Teh Gelas. NBDS sebanyak 10 ml dimasukkan ke dalam tiga tabung pertama kemudian di beri label seri A, NBSS sebanyak 1 ml dimasukkan kedalam tiga tabung kedua kemudian diberi label seri B dan NBSS dimasukkan ke dalam tiga tabung terakhir sebanyak 0,1 ml lalu diberi label seri C. Kemudian tabung durham dimasukkan tabung durham ke dalam masing-masing tabung. Setelah itu sampel dimasukkan ke dalam media tanpa dilakukan pengenceran terlebih dahulu. Perlu diperhatikan ketika menyuntikkan media pada tabung durham tidak boleh terbentuk gas karena akan mengganggu hasil pengamatan.

Gambar 3. Metode Petroff Hauser (eknom-saurus, 2011)

Pengamatan pada semua tabung dilakukan setelah inkubasi selama dua hari. Pertumbuhan mikroorganisme dapat diamati melalui adanya kekeruhan, terdapatnya endapan dan terbentuknya gelembung gas pada tabung durham. Hasil pengamatan MPN dapat dilihat pada tabel 1.

Tabel 1. Pengamatan Pertumbuhan Mikroorganisme

Sampel Tabung MPN

Seri A Seri B Seri C

ABC Mr. Juice Jambu

 Terdapat kekeruhan

 Terdapat endapan berwarna orange

 Terdapat gelembung

 Positif = 3

 Terdapat endapan

 Tidak terdapat kekeruhan

 Terdapat gelembung pada tabung durham

 Positif = 3

 Tidak terdapat endapan

 Tidak terdapat kekeruhan

 Terdapat gelembung pada tabung durham

 Positif = 3 Tekita  Terdapat

kekeruhan

 Berwarna kuning kecokelatan

 Positif = 3

 Tedapat kekeruhan

 Berwarna kuning kecokelatan

 Positif = 3

 Tidak terdapat kekeruhan

 Berwarna kuning

 Positif = 3

ABC Jambu  Berwarna kuning orange

 Terdapat kekeruhan

 Terdapat endapan

 Positif = 1

 Terdapat kekeruhan

 Terdapat endapan kemerahan

 Tidak terdapat gelembung

 Positif = 0

 Berwarna bening

 Terdapat sedikit endapan

 Positif 1

Teh Gelas  Terdapat kekeruhan

 Terdapat gelembung

 Berwarna putih keruh

 Positif = 3

 Terdapat kekeruhan

 Terdapat gelembung

 Berwarna putih keruh

 Positif = 3

 Tedapat kekeruhan

 Berwarna cokelat

 Terdapat gelembung

 Positif = 1

Berdasarkan hasil pengamatan di atas, perhitungan mikroorganisme dengan metode MPN dapat dilihat pada tabel 2.

Tabel 2. Perhitungan Mikroorganisme dengan Metode MPN

Sampel Tabung MPN Nilai MPN

Seri A Seri B Seri C

ABC Mr.

Juice Jambu

3 3 3 > 24.00 ¹

10⁻²

Tekita 3 3 3 > 24.00 ¹

10⁻²

ABC Jambu 1 0 1 7

Teh Gelas 3 3 1 46

Sampel terendah untuk pertumbuhan mikroorganisme terdapat pada ABC Jambu yakni pada seri B karena tidak terdapat gelembung gas yang terbentuk pada tabung durham. Sedangkan sampel tertinggi untuk pertumbuhan mikroorganisme terdapat pada ABC Mr. Juicce Jambu dan Tekita. Pada keduanya, terdapat gelembung gas yang terbentuk pada tabung durham pada setiap seri.

Keuntungan dari metode MPN ini adalah (Buckle dkk, 1985) : 1. Dapat dibuat sangat peka dengan penggunaan volume inokulum

contoh yang lebih besar dari 1,0 mL/tabung.

2. Bahan-bahan dapat dipersiapkan untuk tugas lapangan.

3. Media pertumbuhan selektif dapat digunakan untuk menghitung jenis mikroorganisme yang diharapkan di antara jenis-jenis lainnya yang ada dalam bahan pangan tersebut.

Kerugiannya adalah dibutuhkannya banyak ulangan untuk diperoleh hasil yang teliti dan sehubungan dengan hal tersebut banyak biaya dan waktu yang dibutuhkan untuk persiapannya (Buckle dkk, 1985).

VII. KESIMPULAN

 Metode Petroff-Hauser menghasilkan hasil yang lebih akurat dibandingkan dengan metode MPN. Hal ini dikarenakan pada metode petroff hauser jumlah koloni dihitung secara langsung. Selain itu, pertumbuhan bakteri bisa diketahui melalui data yang diolah menjadi grafik pertumbuhan mikroorganisme. Hal ini tidak seperti metode MPN yang jumlah koloni hanya ditentukan dari jumlah tabung yang positif.

 keuntungan metode Petroff-Hauser : Murah dan Cepat.

 Kelemahan metode Petroff-Hauser :

o Sel mati tidak dapat dibedakan dengan sel hidup (terhitung semuanya).

o Sel-sel berukuran sangat kecil sukar dilihat di bawah mikroskop sehingga kadang-kadang tidak terhitung.

o Untuk mempertinggi ketelitian maka jumlah sel dalam suspense harus cukup tinggi, misalkan bakteri = 10⁶ sel/ml

o Tidak boleh digunakan untuk menghitung mikroorganisme di dalam makanan, banyak mengandung ekstrak makanan.

 Keuntungan metode MPN:

o Dapat dibuat sangat peka dengan penggunaan volume inokulum o Bahan-bahan dapat dipersiapkan untuk tugas lapangan.

o Media pertumbuhan selektif dapat digunakan untuk menghitung jenis mikroorganisme yang diharapkan di antara jenis-jenis lainnya yang ada dalam bahan pangan tersebut.

 Kerugian metode MPN: dibutuhkannya banyak ulangan untuk diperoleh hasil yang teliti.

DAFTAR PUSTAKA

Buckle, K.A., Edwards, G.H. Fleet, dan H. Wooton. 1985. Ilmu Pangan (Terjemahan). Universitas Indonesia : Jakarta

Fardiaz, Srikandi. 1992. Mikrobiologi Pangan I. PT Gramedia Pustaka Utama:

Jakarta.

Sukarminah, Een dkk. 2010. Mikrobiologi Pangan. Penerbit jurusan TIP (FTIP) : Jatinangor.

Anonim. 2008. Menentukan jumlah ukuran mikroba. http://ekmon- saurus.blogspot.com/2008/11/bab-6-menentukan-jumlah-ukuran-

mikroba.html (diakses tanggal 19 Maret 2011).