KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT) I. TUJUAN
1. Menentukan komposisi eluen yang tepat dengan metode cincin terkonsentrasi.
2. Menentukan nilai Rf dari zat warna pada tanaman dengan menggunakan pelat KLT.
II. DASAR TEORI
Kromatografi adalah suatu metode pemisahan fisik, dimana komponen-komponen yang dipisahkan didistribusikan diantara 2 fasa, salah satu fasa tersebut adalah suatu lapisan stasioner dengan permukaan yang luas, yang lainnya sebagai fluida yang mengalir lembut di sepanjang landasan stasioner. Pada dasarnya Kromatografi Lapis Tipis ( KLT ) sangat mirip dengan kromatografi kertas, terutama pada cara melakukannya. Perbedaannya terlihat pada media pemisahannya, yakni digunakan lapisan tipis adsorben yang halus yang tersangga pada papan kaca, aluminium atau plastik sebagai pengganti kertas. (Soebagio, 2000:85).
Dasar pemisahan pada KLT adalah perbedaan kecepatan migrasi di antara fasa diam yang berupa padatan dan fasa gerak yang merupakan campuran solven ( eluen ) yang juga dikenal dengan istilah pelarut pengembang campur. Jenis eluen yang digunakan tergantung jenis sampel yang akan dipisahkan. Eluen yang menyebabkan seluruh noda yang ditotolkan pada pelat naik sampai batas atas pelat tanpa mengalami pemisahan, dikatakan terlalu polar. Sebaliknya, apabila noda yang ditotolkan sama sekali tidak bergerak, berarti eluen tersebut kurang polar. Sampel yang biasanya berupa campuran senyawa organik diteteskan di dekat salah satu sisi lempengan dalam bentuk larutan dengan jumlah kecil, biasanya beberapa mikroliter berisi sejumlah mikrogram senyawa.
Cara termudah untuk memilih jenis eluen yang tepat adalah dengan menggunakan metode cincin terkonsentrasi. Hasil pengamatan akan nampak sebagai noda-noda berwarna pada kertas dengan jarak yang berbeda-beda dari garis awal. Perembesan eluen dihentikan setelah eluan hampir mencapai ujung kertas. Pada tahap identifikasi atau penampakan noda, jika noda sudah berwarna dapat langsung diperiksa dan ditentukan Rf-nya.
Pada identifikasi suatu kandungan tumbuhan, setelah kandungan itu diisolasi dan dimurnikan, pertama-tama yang harus kita tentukan dahulu golongannya, kemudian barulah ditentukan jenis senyawa dalam golongan tersebut. Sebelum itu, keserbasamaan senyawa tersebut harus diperiksa dengan cermat, artinya senyawa harus membentuk bercak tunggal dalam beberapa system KLT dan/atau KKt. Golongan senyawa biasanya dapat ditentukan dengan uji warna, penentuan kelarutan, bilangan Rf, dan ciri spektrum UV. Identifikasi lengkap dalam golongan senyawa bergantung pada pengukuran sifat atau ciri lain, yang kemudian dibandingkan dengan data dalam pustaka. (Harborne, 1987:20).
Deteksi noda KLT terkadang lebih mudah dibandingkan dengan kromatografi kertas karena dapat digunakan teknik-teknik umum yang lebih banyak. Kerapkali, noda tidak berwarna atau tidak berpendar jika dikenai sinar ultra violet dapat ditampakkan dengan cara mendedahkan papan pengembang pada uap iod. Uap iod akan berinteraksi dengan komponen-komponen sampel baik secara kimia atau berdasarkan kelarutan membentuk warna-warna tertentu. (Soebagio, 2000:87).
Analisis dengan KLT yaitu 1. Persiapan pelat
Untuk pengujian cincin terkonsentrasi, pelat diberi tanda titik dengan pensil untuk tempat menotolkan noda dan tiap titik memiliki jarak yang sama panjangnya satu sama lain. Dan untuk penentuan Rf, pelat
diberi tanda garis sebagai dengan pensil yang berjarak 1 cm dari bagian bawah dan 0,5 cm dari bagian atas. Pada pemberian tandadan garis ini tidak menggunakan tinta melainkan menggunkan pensil karena jika menggunakan tinta nanti tintanya bisa ikut berpendar atau memancarkan warna sebab tinta terdiri dari berbagai macam warna.
2. Pemilihan pelarut pengembang (eluen)
Pemilihan eluen tergantung pada jenis analit yang akan dipisahkan. Eluen yang menyebabkan seluruh noda yang ditotolkan pada pelat naik sampai batas atas pelat (solvent front) tanpa mengalami pemisahan berarti eluen terlalu polar. Sebaliknya jika noda yang ditotolkan sama sekali tidak bergerak berarti eluen kurang polar. Hasil kromatografi yang didapat dari penggunaan eluen yang kurang polar, polar dan eluen yang sesuai adalah
3. Persiapan “Chamber”
Chamber yang digunakan dapat berupa bejana, gelas, atau botol dari kaca dengan dasar rata. Bagian dalam chamber dilapisi dengan kertas saring sampai seluruh dinding chamber tertutup oleh kertas saring tetapi bagian atas chamber tidak tertutup kertas saring sekitar 2 –3 cm. Kemudian eluen yang digunakan dimasukkan kedalam chamber sebanyak 5 mL untuk menjenuhi kertas saring dengan uap eluen tersebut dan selama proses penjenuhan chamber harus ditutup dengan pelat kaca sampai kertas saring basah seluruhnya. Kertas saring tidak boleh melebihi tinggi gelas karena uapnya dapat keluar melalui kertas saring yang berada di luar gelas sehingga chamber tidak jenuh lagi dan noda tidak naik. Jika kertas saring terlalu kecil maka chamber tidak akan jenuh semuanya sehingga noda sulit naik atau berkembang.
4. Tahap penotolan dan tahap pengembangan
Untuk pengujian cincin terkonsentrasi, pada sebuah pelat ditotolkan beberapa noda sampel yang sama kemudian setiap noda
ditotolkan eluen yang berbeda. Sedangkan untuk penentuan Rf, pada sebuah pelat ditotolkan beberapa noda yang sama di batas bawah pelat. Kemudian pelat dimasukkan ke dalam chamber yang telah dijenuhkan. Penempatan pelat dilakukan dengan hati-hati sehingga lapisan tipis fasa diam pelat tidak bersentuhan dengan kertas saring di dalam chamber dan noda yang ditotolkan tidak terkena pelarut. Setelah pelat diletakkan dengan benar, chamber ditutup dan dibiarkan eluen merambat naik secara kapiler. Setelah eluen mencapai batasatas pelat, maka pelat segera diangkat dan noda yang terbentuk ditandai dengan pensil, kemudian diukur Rf-nya. Jika tidak ada noda yang terlihat maka pelat disemprot dengan pereaksi penimbul warna seperti ditizon, ninhidrin, kalium kromat, amonium sulfida, dan sebagainya. Atau dengan cara menyinari pelat dengan lampu ultra violet atau menjenuhkan pelat dengan uap iodium. III. ALAT DAN BAHAN
Alat Bahan Bejana KLT (chamber) + tutup Plat silica Pipakapiler Sinar UV Beaker glass Batang pengaduk
Ekstrak daun rambutan Methanol
Heksana Etilasetat Anilin H2SO4 pekat
IV. CARA KERJA
a. Siapkan alat dan bahan.
b. Ambil sedikit ekstrak, kemudian larutkan dengan pelarut yang sesuai. c. Siapkan pelarut dengan perbandingan 3:7 (Etil Asetat : n-heksana). d. Siapkan plat KLT, kemudian totolkan sampel yang telah dilarutkan, masukkan kedalam chamber yang telah berisi pelarut. Jangan sampai pelarut merendam sampel yang telah ditotolkan pada plat.
f. Akan terlihat pola pemisahan senyawa. g. Semprot dengan anilin dan H2SO4 pekat. h. Lihat pola pemisahan dibawah sinar UV. i. Hitung nilai Rf.
V. DATA DAN HASIL PENGAMATAN
Panjang Plat KLT = 5 cm
Menggunakan Sinar Biasa (tanpa UV)
Spot ke- Letak spot 1 1,1 cm - 1,4 cm 2 1,7 cm – 2 cm 3 2,8 cm – 3 cm 4 3,6 cm - 3,8 cm
Menggunakan Sinar UV dengan ʎ = 365 nm Spot Ke- Letak Spot
1 1,1 cm – 1,4 cm 2 1,6 cm – 2 cm 3 2,7 cm – 3,1 cm 4 3,6 cm – 4 cm PERHITUNGAN
Menggunakan Sinar Biasa (tanpa UV) = 0,28
Menggunakan Sinar UV dengan ʎ = 365 nm
j. PEMBAHASAN
Kromatografi lapis tipis adalah suatu metode analisis yang digunakan untuk memisahkan suatu campuran senyawa secara cepat dan sederhana. Prinsipnya didasarkan atas partisi dan adsorpsi. Komponen bergerak dengan kecepatan yang berbeda-beda mengikuti naiknya eluen, karena daya serap adsorben pada komponen-komponen tidak sama, maka komponen bergerak dengan kecepatan berbeda dan hal inilah yang menyebabkan terjadinya pemisahan. Tujuannya adalah untuk memisahkan campuran senyawa sehingga dapat dilakukan identifikasi terhadap golongan senyawa tersebut dari nilai Rf nya. Dalam praktikum kali ini digunakan etil asetat : hexane 3:7 yang menjadi fase gerak dan plat silica yang berfungsi sebagai fasa diam. Sampel yang digunakan adalah ekstrak metanol. Setelah chamber dijenuhkan, plat yang telah ditotolkan sampel dimasukkan kemudian chamber ditutup hingga seluruh eluen naik, kemudian dilakukan penyemprotan dengan anilin dan H2SO4 pekat yang berfungsi untuk menampakkan bercak,. Plot yang timbul dilihat tanpa menggunakan sinar UV dan dengan menggunakan sinar UV.
Perbandingan kecepatan permukaan dari pelarut dengan jarak yang ditempuh oleh senyawa terlarut merupakan dasar untuk mengidentifikasi komponen-komponen yang terdapat dalam ekstrak atau campuran senyawa tersebut yang disebut dengan nilai Rf. Nilai ini spesifik untuk setiap golongan dari senyawa yang membuatnya dapat mengidentifikasi kandungan dalam senyawa tersebut. Dengan menggunakan sinar UV akan terlihat jarak yang berfungsi menghitung nilai Rf nya, jika tanpa sinar UV jarak tersebut juga terlihat, maka nilai Rf yang akan dihitung berdasarkan masing-masing jarak keduanya, sehingga didapatkan dua nilai Rf.
Rumus menghitung Rf adalah :
Dari hasil yang diperoleh, didapatkan nilai Rf 0.28, 0.4, 0.6 dan 0.76 (tanpa menggunakan sinar UV) dan nilai Rf 0.28, 0.4, 0.62 dan 0.8 (menggunakan sinar UV) yang akan dibandingkan dengan nilai yang didapatkan dari referensi nilai Rf terhadap ekstrak daun rambutan. Pada referensi yang kami dapatkan, nilai Rf yang didapatkan dari ekstrak butanol daun rambutan adalah 0.22, 0.35, 0.39 dan 0.44. Berdasarkan hasil perbandingan tersebut terjadi pergeseran yang mungkin disebabkan oleh perbedaan pelarut yang digunakan untuk mengestraksi. Namun dalam referensi yang kami jadikan acuan tidak dijelaskan senyawa apa yang timbul pada Rf tersebut.
k. KESIMPULAN
a. Nilai Rf spot 1, 2, 3, dan 4 yang tidak menggunakan sinar UV berturut-turut adalah 0.28, 0.4, 0.6 dan 0.76
b. Nilai Rf spot 1, 2, 3, dan 4 yang menggunakan sinar UV berturut-turut adalah 0.28, 0.4, 0.62 dan 0.8
c. Perbandingan eluen yang digunakan adalah etil asetat : hexane 3:7.
Spot 2 Spot 3
Spot 4
DAFTAR PUSTAKA
Harborne, J.B. 1987. Metode Fitokimia. Bandung: ITB Bandung .
Ismiarni. 2010. Kromatografi (Dasar). Alam learning.blogspot.com/search/label/ chromatography. Diakses pada 25 April 2012.
