shikyu keibu shuyo ni okeru p16INK4a tanpakushitsu kajo hatsugen no kaiseki

Title Sub Title Author Publisher Publication year Jtitle Abstract Notes Genre URL. Powered by TCPDF (www.tcpdf.org). 子宮頸部腫瘍におけるp16INK4a 蛋白質過剰発現の解析 石川, 光也(Ishikawa, Mitsuya) 慶應医学会 2005 慶應医学 (Journal of the Keio Medical Society). Vol.82, No.2 (2005. 6) ,p.T67- T80 学位論文 Journal Article http://koara.lib.keio.ac.jp/xoonips/modules/xoonips/detail.php?koara_id=AN00069296-20050601 -0067.

慶應 医 学 ・82(2):T67∼T80,2005. 学位論文. 子 宮 頸 部 腫 瘍 に お け るp161NK4a蛋. 白質 過 剰 発 現 の解 析. 慶應義塾大学医学部産婦人科学教室 (指導:野 澤志朗教授) 石. 川. 光. 也. (平 成16年7月26日. Key. Words:p16`NK4a,. uterine. ヒ トパ ピ ロ ー マ ウ イ ル ス(以. cervical. carcinoma,. 下HPVと. 略 す)は. human. 皮膚. 受 付). papillomavirus. の 感 染 者 が ウ イル スを 排 除 で き な い ま ま持 続 感 染 とな り. や粘 膜 に感 染 して乳 頭 腫 を形 成 す る ウイ ル ス で あ る こ と. 発 癌 に 至 る と 考 え ら れ て い る.HPV感. が 知 ら れ て お り,女. る か 否 か は,起. 性 生 殖 器 領 域 に お い て は良 性 疾 患 で. あ る尖 圭 コ ン ジ ロ ー マ か らHPV6型,11型 て い る1).そ. が分離 され. の 後 子 宮 頸 癌 組 織 か らHPV16型. れ た こ と に よ り2),HPVは. ヒ トが ん ウ イ ル ス と して 注. 目 さ れ る よ う に な っ た.さ 伝 子 産 物 で あ るE6,. が分離 さ. E7蛋. 遺 伝 子 産 物 で あ るp53蛋. ら にHPV16型. の ウ イ ル ス遺. 白 質 が,宿. 主 細 胞 の癌 抑 制. 白 質,. Rb蛋. 白 質 と結 合 し て そ. の 機 能 を 抑 制 す る こ と が わ か り3-5),HPV感. 染 と発 癌 の. の か,未. の か は 不 明 で あ る が,正 で あ る 軽 度 異 形 成,中. 程 に お い て,HPV感. HPVは. 約8000塩. 基 対 か ら な る 環 状 二 本 鎖DNAウ. 初 期 遺 伝 子E1,. E2,. E4,. E5,. E6,. E7と,カ. の 反 応 を 指 標 と してHPV感. 染が. 染 に 対 す る宿 主 細 胞 の反 応 の 一 っ と し. 白 質 に 着 目 し た.. p161NK4a蛋. プ シ ド. らに扁 平 上 皮 癌 へ と至 る発 癌 過. イ ク リ ン依 存 性 キ ナ ー ゼ の イ ン ヒ ビ タ ー で あ る. p1G[NK4a蛋. イ ル ス遺 伝 子 の 転 写 や 複 製 に 関 与 し て い る. して. 引 き 起 こ す 発 癌 の 過 程 を 解 明 す る こ と が 可 能 と な る.本. て,サ. イ ル ス で,ウ. 度 異 形 成,そ. 染 に対 す る宿 主 細 胞 の 反 応 を捉 え. る こ と が で き れ ば,そ. 上 の 経 緯 か ら,今. 癌 の 発 癌 因 子 と し て 認 識 さ れ て い る.. 常 の 子 宮 頸 部 上 皮 か ら前 癌病 変 等 度 異 形 成,高. 上 皮 内 癌 へ と 進 行 し,さ. 研 究 で はHPV感. 染 は子 宮 頸 部 扁 平 上 皮. サ ブ タ イ プ に よ り決 ま る. だ 解 明 され て い な い 宿 主 側 の 因 子 によ り決 ま る. メ カ ニ ズ ム を 結 び っ け る こ と が で き る よ う に な っ た.以 日 で はHPV感. 因 す るHPVの. 染者が発癌 に至. 白 質 は 癌 抑 制 遺 伝 子 産 物 で あ るRb蛋. 白質. が リ ン酸 化 を 受 け て 不 活 化 さ れ る 反 応 を 阻 害 す る 活 性 を 有 し,細. 胞 周 期 を 調 節 し て い る 蛋 白 質 で あ る.p161NK4a. と よ ば れ る 殻 を コ ー ド して い る 後 期 遺 伝 子L1,. L2,お. 蛋 白 質 は 重 要 な 癌 抑 制 遺 伝 子 産 物 の一 つ と して 報 告 さ. よ び 遺 伝 子 発 現 調 節 領 域 で あ るLong. Control. Region. れ8),肺. (LCR)か. HPVはL1領. ら構 成 さ れ て い る(第1図).. 域. の 塩 基 配 列 の 相 同 性 か ら サ ブ タ イ プ が 分 類 さ れ,現. 在 で. は 約90種. れ ら. 類 以 上 の サ ブ タ イ プ が 存 在 して い る.そ. 癌 や 白血 病 な ど多 種 の 悪 性 腫 瘍 に お い て. p161NK4a遺. 伝 子 の 異 常 や プ ロ モ ー タ ーの メ チ ル化 な ど に. よ るP161NK4a蛋. 白 質 の 不 活 化 が 認 め ら れ て い る9-II).. 一 方 で,Parryら. の 培 養 細 胞 を 使 っ た 報 告 に よ る と,. は 発 癌 に 対 す る危 険 度 の 点 で ロ ー リス ク 型HPVと. ハ イ. Rb蛋. リ ス ク 型HPVに. 代 表. 正 常 に 機 能 し て い る 細 胞 に 比 べp161NK4a蛋. 分 類 さ れ,ロ. ー リ ス ク 型HPVの. 白 質 が 不 活 化 し て い る 腫 瘍 細 胞 で はRb蛋. 白質が. 白質 が 過 剰 に. 例 は 尖 圭 コ ン ジ ロ ー マ で 検 出 さ れ て い るHPV6型,11. 発 現 し て い る こ と が 判 明 し,p16[NK4a蛋. 型 で あ る.一. 蛋 白 質 の 機 能 と 逆 の 相 関 を 示 して い る こ と が わ か っ. 方 子 宮 頸 癌 組 織 か ら検 出 され た サ ブ タ イプ. は ハ イ リ ス ク 型HPVと HPV. 16型,18型. 定 義 さ れ6)'7),そ. の代 表 例 は. で あ る.. 子 宮 頸 部 へ のHPV感. るRb蛋. 染 は 性 感 染 症 の 一 っ で あ り,多. くの 感 染 者 が 存 在 して い る こ と が 推 測 さ れ る が,現 は 感 染 者 の す べ て が 発 癌 に 至 る わ け で は な く,ご. た'2)・'3).こ の た め,ハ. 実 に く一 部 一T67一. 白 質 の 発 現 はRb. イ リ ス ク型HPV. 白 質 の 不 活 化 はp161NK4a蛋. 白 質 はHPV. E7蛋. 白質 によ. 白質 の 過 剰 な 発 現 を. 導 く こ と が 推 測 さ れ る14-17).す な わ ち,過 p161NK4a蛋. E7蛋. 剰 に発 現 した. 白 質 に よ るRb蛋. 化 の 指 標 と して 解 析 す る こ と が 可 能 で あ る.. 白質 不 活.

慶鷹医学. 82巻2号(平. 成17年6月). E6㍗. 喚.. '. E1. 扁 平 上 皮 系 病 変 に お け るHPV検 出 に 使 用 し た プ ラ イ マ ー-L1領 域:① LIC15'-CGTAAACGTTTTCCCTATITTrfT-3'(nt.5611-5634) LIC25'-TACCCTAAATACTCTGTATTG-3'(nt.5843-5863) 頸 部 腺 癌 に お け るHPV検 HPV16型A:5'-TGTCAAAAG. 出 に 使 用 し た プ ラ イ マ ーE6.E7領 CCACTGTGTCC-3'(nt.419-438)B5'-GAG. 域:② CTGTCA丁rrAATTG. ' CTC-3'(nt.637-656). C:5'-TCGGTGGACCGGTCGATGTA-3'(nt.493-512)D:5'-GATCAGTTGTCTCTGGTTGC-3'(nt.606-625) HPV18型A:5'-TG CCAGAAACCGT丁GAATCC-3'(nt.426-445)B5'-TCTGAGTCGC丁rAATTG C:5'-ATAGCTGGGCACTATAGAG nt:nucleotide. 第1図. HPVの. HPVは. ゲ ノ ム構 造 とPCRプ. 約8000塩. 後 期 遺 伝 子L1,. L2,お. 域 のPCRを. イ ル ス で あ り,初 期 遺 伝 子E1,. よ び遺 伝 子 発 現 調 節 領 域Long 印)を 示 す.本. Control. 研 究 に お け るHPV感. 行 い,頸 部 腺 癌 で は② に示 したE6E7領. 今 日で は,子 宮 頸 癌 組 織 か らハ イ リス ク型HPVが 出 さ れ る こ とか らハ イ リス ク型HPV感. CTC-3'(nt.674-693). D:5'-TGCAATGTTGCCTTAGGTCC-3'(nt.596-615). ライ マ ー の 位 置. 基 対 か らな る環 状2本 鎖DNAウ. 領 域 お よ び 複 製 開 始 点(矢 示 したL1領. G-3'(nt.492-511). 検. 染 は子 宮 頸 癌 の. 発癌 因 子 とさ れ て きた が,本 研 究 で は子 宮 頸 部 扁 平 上 皮 癌 お よ び 前 癌 病 変 に お け るハ イ リス ク 型HPV感. 染と. Region(LCR)か. E2,. E4,. E5,. E6,. E7と,. ら構 成 され て い る.各 遺 伝 子. 染 の 検 出 に際 して は,扁 平 上 皮 系 病 変 で は① に 域 のnested-PCRを. 討 した.さ. 行 った.. らに腺 系 病 変 に お け る病 理 組 織 学 的 な分 類 や. 予 後 因 子 とp161NK4a蛋 白質 過 剰 発 現 頻 度 との 相 関 の 有 無 も検 討 した. 今 回 の 研 究 で は,p161NK4a蛋. 白質 過 剰 発 現 の 解 析 は組. p161NK4a蛋 白質 過 剰 発 現 の 関 連 を検 討 す る こ と に よ り,. 織 検 体 を用 いて 行 い,子 宮 頸 部 腫 瘍 に お いて 病 変 に特 異. 子 宮 頸 部 発 癌 機 構 に お け るハ イ リス ク型HPVの. 的 なp161NK4a蛋 白質 の過 剰 発 現 を検 出 す る こ とが で きた.. 関与 を. しか し子 宮 頸 癌 の ス ク リー ニ ン グ と して現 在 普 及 して い. 分子 生 物 学 的 に裏 付 け る こ とを試 み た. 一 方,子 宮 頸 癌 の 一組 織 型 で あ る子 宮 頸 部 腺 癌 は,子. る細 胞 診 で は,比 較 的 容 易 に かっ 患 者 へ の苦 痛 を伴 わず. 占 め て い た に過 ぎな か うた が 近 年 増. に検 体 を採 取 す る こ とが可 能 で あ る こ とか ら,細 胞 診 検. 加 傾 向 に あ り18)'19),また扁 平 上 皮 癌 に比 べ て 予 後 不 良. 体 を用 い てp161NK4a蛋 白質 の過 剰 発 現 を 検 出す る こ とが. と され て い る こ とか ら,臨 床上 重 要 な疾 患 とな って きて. で きれ ば,組. い る20-22).とこ ろ で,頸 部 腺 癌 に お け るHPV感. 染 の報. 質 の 過 剰 発現 を解 析 す る こ とが 可能 に な る と考 え られ る.. 告 はな され て い る もの の,そ の検 出率 は報 告 に よ り大 き. そ こで本 研 究 で は,細 胞 診 検 体 を用 い た免 疫 細 胞 化 学 染. な違 い が 見 られ,は. 色 を 行 い,p16'NK4a蛋. 宮 頸 癌 の約10%を. た して頸 部 腺 癌 の発 癌 機 構 にHPV. 感 染 が 関 与 して い るの か 否 か は不 明 の ま まで あ る23-28). そ こで 本 研 究 で は,ハ. イ リス ク型HPV感. 染 とp161NK4a. 蛋 白質 過 剰 発 現 との 関 連 を 解 析 す る こ とで,頸 部 腺 癌 発 癌 機 構 に お け るハ イ リス ク型HPV感. 染 の関 与 に つ き検 一T68一. を検 討 した.. 織 検 体 の採 取 を 行 わ な くて もp161NK4a蛋 白. 白質 の過 剰 発 現 が検 出 可 能 か否 か.

石 川:HPV感. 対. 染 とp161NK4a蛋. 象. 白質 の過 剰 発 現. 子 宮 頸 部 擦 過 浮 遊 液10mlを3000 遠 沈 し,沈. 検 体 の 採 取 に あ た って は研 究 内 容 お よ び安 全 性 につ い て 十 分 な説 明 を行 い,患 者 か ら同意 を得 た うえ で行 った.. 渣 を リ ン酸 緩 衝 食 塩 水(以. に て 洗 浄 後,0.2M塩 0.1M. 宮 頸 部 扁 平 上 皮 系 病 変 に お け る ハ イ リ ス ク型. ウ ム(以. HPV感. 染 の 検 出 とp161NK4a蛋 白質 過 剰 発 現 頻 度 の 関 連. 応 さ せ た.煮. 慶 磨 義 塾 大 学 病 院 を受 診 した 軽度 異 形 成 患 者75症 中 等 度 異 形 成 患 者49症 上 皮 内癌 患 者21症. 例,高. 例,お. 度 異 形 成 患 者34症. 例. 染 が検 出 され た症 例 を対 象. Tris-HCI+1mM. に て4時. EDTA. 混 和 さ せ12000rpmに. ｵ1を 混 和 し,12000rpmに. に て5分. 化 学 染 色 の対 照 群 と した.. タ ノ ー ル に て 洗 浄 後50ｵ1のTE(pH8.0)に. glycogen. 1ｵ1,3Mの. 間 遠 沈 し た.沈. 部 腺 癌62症. 例,腺. 扁 平 上 皮 癌9症. てPIGINK4a蛋 白質 過 剰 発 現 の検 出 を 免 疫 組 織 化 学 染 色 に て行 った.ま. ち49症. 例 を対 象 と してHPV16型. お よ び18型. の感 染. L1領. 域 の 約250塩. を 行 っ た30).フ.ロ. に95℃. で1分30秒,48℃. 間 を43サ PCR産. らに頸 部 腺 癌 症 例 の う. イ ク ル,そ. DNAシ. 3。 子 宮 頸 部 擦 過 細 胞 を用 い たp161NK4a蛋 白質 免 疫 細 胞 化学 染 色. nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi). 上 皮 内 癌 患 者13症. 例,高. 例,お. 度 異 形 成 患 者12症. よ び頸 部 腺 癌 患 者14症. Analysis. PRISM. 動. 3100;Applied. 用 い て そ の塩 基 配 列 を 決 定. L 1領 域 の 塩 基 配 列 か らNCBIデ sequences. ー. http://www.ncbi. お よ びSequencing. 3.3 software(Perkin-Elmer. を 用 い てHPVの. 例,. 片 を 得 た 後 に,自. (ABI. メ リ カ)を. ら れ たHPV. の後. ライ マ ー を 用 い て再 増. 基 対 のDNA断. ー ク エ ンサ ー. し た.得. で10分. と設 定 した.. 物 の 一 部 分 をLIC1プ. 幅 し て 約200塩. タ ベ ー ス(GeneBank. 中 等 度 異 形 成 患 者15症. 基 対 を標 的 と した. ト コ ー ル は95℃. の 後70℃10分. Biosystems,ア. 例,. が作 成 し. で1分30秒,70。Cで2分. の有 無 を検 討 した.. 慶 鷹 義 塾 大 学 病 院 を 受 診 した 軽 度異 形 成 患 者12症. 溶 解 した.. ら, Yoshikawaら. PCR法. た正 常 子 宮 頸 管 腺 上 皮7症 例 をp161NK4a蛋. 白質 過 剰 発 現 の対 照 群 と した.さ. 混 和 して12000rpm. た コ ン セ ン サ ス プ ラ イ マ ーLIC1・LIC2(第1図)を 使 用 し てHPV. 例 を対 象 と し. 清 に. 酢 酸 ナ ト リ ウ ム50ｵ1,. 殿 し た ゲ ノ ムDNAを70%エ. 抽 出 し た ゲ ノ ムDNAか. 例,頸. 間遠沈. 間 遠 沈 し た.上. 断 さ れ た 良 性 異 型 患 者7症 例 をplGINK4a蛋 白質 免 疫 組 織. 慶 慮 義 塾 大 学 病 院 に て手 術 を行 った上 皮 内 腺 癌10症. て5分. て5分. イ ソ プ ロ ピ ル ア ル コ ー ル500ｵ1を. の検 出 とp161NK4a蛋 白質 過 剰 発 現 頻 度 の 関連. 和 フェ. 清 に イ ソ ア ミル ア ル コ ー ル 含 有 ク ロ ロ ホ ル ム500. 色 を用 い て行 った.ま た扁 平 上 皮 化 生 や 炎症 性異 型 と診. 染. 間 反 応 さ せ,. pH8.0)飽. 5mg/ml. 宮 頸 部 腺 系 病 変 に お け るハ イ リス ク型HPV感. て一晩反. 性 を 失 活 さ せ た10. え,37℃. と してp161NK4a蛋 白質 過 剰 発 現 の 検 出 を免 疫 組 織 化 学 染. 2.子. pH8.0の. 加 え37。Cに. 沸 処 理 に てDNase活. ノ ー ル500ｵ1と し,上. 染 の 検 出 を行 った.. 略 す). デ シル 硫 酸 ナ ト リ. 略 す)25ｵ1を. RNaseを5ｵ1加. TE(10mM. 例,. よ び扁 平 上 皮 癌 患 者18症. を対 象 と して ハ イ リス ク型HPV感 さ ら にハ イ リス ク型HPV感. 例,. K 2.5ｵ1,10%ド. 下SDSと. mg/ml. 間. チ レ ン ジ ア ミ ン 四 酢 酸)250ｵ1,20. proteinase. 1.子. 下PBSと. 化 ナ ト リ ウ ム250ｵ1,. EDTA(エ. mg/ml. rpmで30分. Corp,ア. メ リ カ). 型 判 定 を 行 っ た.. 例を 2.子. 対 象 と した.. 宮 頸 部 腺 癌 に お け る ハ イ リ ス ク 型HPV感. 染 の検. 出. 方. 法. 前 述 の 対 象 症 例 の 手 術 検 体 パ ラ フ ィ ン包 埋 切 片 か ら病 変 部 分 の み を 切 り 出 し,HPV16型. 1.子 HPV感. 宮 頸 部 扁 平 上 皮 系 病 変 に お け る ハ イ リス ク型 染の検出. p,ア. メ リ カ)に. て回 収 した子 宮 頸 部 擦 過 細 胞 浮 遊 液 を. 用 い て ハ イ リ ス ク 型HPV お,本. キ シ レ ン500ｵ1を. Cor. DNAの. 研 究 で は 多 く の 報 告 で ハ イ リス ク型 と し て 認 識 さ. れ て い るHPV. 16型,18型,31型,33型,35型,45. 型,51型,52型,56型,58型. 薄 切 し,パ. 行 い 上 清 を 捨 て る行 程 を3回. pH8.O. O.1MEDTA. ｵ1,10%SDS フ ェ ノ ー ル,ク. を ハ イ リ ス ク 型HPV. 200ｵ1,20 20ｵ1を. 一T69一. 間 の遠 沈 を. 繰 り返 し た.沈. 渣 を100%. 化 ナ ト リ ウ ム200ｵ1, mg/ml. 加 え37。Cに. proteinase. K 4. て 一 晩 反 応 さ せ た.. ロ ロ ホ ル ム処 理 を 行 っ た 後 に,エ. ル 沈 殿 し50ｵ1のTE(pH8.0)に. と 定 義 し た6)'7).. ラ フ ィ ン除 去 と して. 加 え て3000rpmで5分. エ タ ノ ー ル に て 洗 浄 後,0.2M塩. 検 出 を 行 っ た29).な. 感 染の有無. に つ い て 解 析 を 行 っ た. 手 術 検 体 を15ｵmに. 前 述 の 対 象 症 例 に お い て,ThinPrep法(Cytyc. と18型. 溶 解 し た.. タ ノー.

慶鷹医学. 抽 出 し た ゲ ノ ムDNAか E6E7領. らHPV16型. 域 を 標 的 と し たnested. 法 の プ ラ イ マ ー はHPV16型 の 塩 基 配 列 か ら第1図 陽 性 コ ン トmル. お よ び18型. PCR法. 性 界 面 活 性 剤Tween. 16型. Durst博. Collection. 略 す)検 ation,日. 本)を. 18型DNAの ち43症. 素 と メ タ ノ ー ル に20分. HPV18型 Cytomation,日. 室 温 で10分. PBSに. さ せ た.HPV-wide. ー. て 洗 浄 し,1%過. 酸 化 水 素 に5分. 6.0,95℃,20分. 活 化 を 行 っ た.正 K. 酸化水. E6H4(MTM. た17)32-34).2次 MAX. は ジ ァ ミ ノ ベ ンチ ジ ン を 用 い,ヘ. p161NK4a蛋. Simple. 白 質 免 疫 組 織 化 学 染 色 の 評 価 法 を 第1表. +,+++)に. 染 色 強 度 p161N臨 性,強. ぺ 灘繊. 圏. 鍵 難灘 翻'iI圏. 十十十. 葦. 蛋 白 質 免 疫 組 織 化 学 染 色 の 結 果 を,染 陽 性 に 分 類 し,中. ■. ■■. 色 強 度 と 染 色 頻 度 の 組 合 せ か ら 陰 性 ,弱. 陽 性,中. 陽性 と強陽 性 を過 剰 発 現 と定 義 した.. (1・hik・w・M・t・1:1・t・ 第1表. 50%∼. 轟羅灘騨 撫 纏懸撫熱欝. 十十. ・n・ti・n・1J・u・n・1・f Gynec・1・gical. を 許 可 を 得 て 転 載). 一T70一. に. 分 類 し,病 変 に 占 あ る 染 色 陽 性 細 胞 の 割. 一. 十. 色. 階 の 陽 性(+,+. 染色頻 度(%) ∼50%. Stain. 間 加 え,発. p161NK4a蛋 白 質免 疫組 織 化 学 染 色 評 価 法. ∼5%. 間作 用 させ. マ トキ シ リ ンで 核 染 色. 示 し た 。 染 色 強 度 を 陰 性(一)と3段 ら に50. イ ッ)を200. 本)を30分. を 行 っ た.. spectrumはHPV6型,11型,16. AG,ド. 抗 体 と し てHISTOFINE. 本)を. で一 晩 反 応. 間 作 用 させ 非 特 異. 抗 体 と し て3時. PO(M)(Nichirei,日. て洗. よ る抗 原 賦. 白質 モ ノ ク ロー ナ ル抗 体. Laboratories. 倍 希 釈 し た も の を1次. spectrum,. oi. 間浸 透 させ て. 間)に. 常 ヤ ギ 血 清 を15分. 的 反 応 を 抑 制 し,抗p161NK4a蛋 clone. 間 浸 し,. を 検 出 可 能 な プ ロ ー ブ で あ る.さ. 白. タ ノ ール に反 応 させ た後. の ビ オ チ ン 標 識 プ ロ ー ブ. 第1表. 白質 免 疫 組 織 化 学. 内 因 性 ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ 活 性 を 除 去 し た.PBSに. 型,18型,30型,31型,33型,35型,45型,51型 お よ び52型. シ レ ン と100%工. 浄 後 ク エ ン酸(pH. よ び100%. 用 い て37℃. ア ミノ ベ ンチ ジ ン. 宮 頸 部 腫 瘍 に お け るp161NK4a蛋. 作 成 した.キ. 本)に95℃,40分. 間 反 応 さ せ,95%お. て 洗 浄 後,ジ. 前 述 の 検 体 か ら ホ ル マ リ ン固 定 パ ラ フ ィ ン包 埋 切 片 を. Retrieval. エ タ ノ ー ル に て 脱 水 し風 乾 した.HPV-wide HPV16型,. 滴 下 し,. 質 の 過 剰 発 現 を 免 疫 組 織 化 学 染 色 に て 検 出 した.. に 希 釈 し たproteinase 本)に. 本)を. 識 ス ト レプ トア ビ ジ ン と. 頸 部 腺 系 病 変 に お い て は 手 術 検 体 を 用 い てp161NK4a蛋. Cytom. タ ノ ー ル に よ る 親 水 化 を 行 っ た.タ. Cytomation,日. peroxidase標. 扁 平 上 皮 系 病 変 に お い て は 子 宮 頸 部 生 検 検 体 を 用 い,. 下ISHと. 述 の頸部腺癌 症例 の う. Cytomation,日. 希 釈 した二 次. 染色. 内 因 性 ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ 活 性 除 去 の た め0.3%過. (DAKO. 3.子. シ レ ン に よ る 脱 パ ラ フ ィ ン化,99. 間 浸 し た.6000∼10,000倍 (DAKO. 間. と 設 定 し た.. ゲ ッ ト 遺 伝 子 の 賦 活 化 の た め にTarget Solution(DAKO. 洗 浄 し た.100倍. Cytomation,日. raddish. 液(DAKO. で10分. 例 の 手 術 検 体 か ら ホ ル マ リ ン固 定 パ ラ フ ィ ン包. よ び95%エ. ら成 るTBST溶. イオ ン. に よ る発 色 と ヘ マ トキ シ リ ン に よ る 後 染 色 を 行 っ た.. 用 い て 頸 部 腺 癌 に お け るHPV16型,. 埋 切 片 を 作 成 し,キ %お. horse. 間 洗 浄 し,. 適 プ ロ トコ ー ル. ッ ト(DAKO. 局 在 を 調 べ た.前. 本)で. で20分. 化 ナ ト リ ウ ム,非. 反 応 さ せ た.TBSTに. situ hybridization(以. 出 シ ス テ ムGenPointキ. 20か. Cytomatio. がサ ブク ローニ. で2分. の 後70℃10分. mM塩. 酵 素 試 薬(DAKO. of Research. Solution(DAKO か ら55℃. Tris-HC1,300. Cytomation,日. の 亜 型 が サ ブ ク ロー. の プ ロ ト コ ー ル は,95℃. 感 度in. て,45℃. の. の 後 に94。Cで1分30秒,550Cで2分,72℃. さ ら に,高. 本)に. の 通 り に 設 定 し た6)31).PCR法. り 入 手 し たHPV18型. イ ク ル,そ. n,日. Wash. 50mM. ン グ さ れ て い る プ ラ ス ミ ドを 使 用 し,至. を30サ. 倍 希 釈Stringent. 域. よ びJapanese. を 決 定 し た.PCR法. 成17年6月). のE6E7領. と して,HPV. Bioresourcesよ. の. を 行 っ た. PCR. お よ び18型. ニ ン グ さ れ た プ ラ ス ミ ドPK114/K(Mattis 士 よ り供 与)お. 82巻2号(平. P・th・1・gy. 22:378-385. ,2003の. 陽.

石 川:HPV感. 染 とp161NK4a蛋. 白質 の 過 剰 発 現. 合 か ら染 色 頻 度 を3段 階 に分 類 した.染 色 強 度 と染 色 頻 度 の 組 合 せ か らp161NK4a蛋 白質 免 疫 組 織 化 学 染 色 の結 果. 第2表. 扁 平 上 皮 系 病 変 に お け る ハ イ リス ク型HPV感 ハ イ リス ク型HPV感. を 陰 性,弱 陽 性,中 陽 性,強 陽 性 に分 類 した.こ の うち 中 陽 性 と強 陽 性 をplGINK4a蛋 白質 過 剰 発 現 と定 義 した.. 症 例数. 白質免疫細胞. 化学 染色 前 述 の 症 例 の 子 宮 頸 部 擦 過 細 胞 をThinPrep法 収 し,そ. にて 回. 陽 性(%). 軽度 異形成 中等度 異形 成 高度異 形成 上皮 内癌 扁平 上皮癌. 37(49.3) 39(79.6). 4 1 8 0 0 9一 -. 宮 頸 部 擦 過 細 胞 を 用 い たp161NK4a蛋. 染検 出 率. 5 9 7・ 4. 4.子. 染頻 度. 26(76.5) 18(85.7) 16(88.9}. の 浮 遊 液 か ら擦 過 細 胞 を ス ラ イ ドガ ラ ス に 噴 霧. して モ ノ レ ー ヤ ー 標 本 を作 製 した.標 ル に て 固 定 し,1%過. 本 は100%エ. 酸 化 水 素 に5分. タ ノー. 間 浸 透 させ て 内 因. 性 ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ 活 性 を 除 去 した.以. 後 の 行 程 は免 疫. 組 織 化 学 染 色 と 同 じ手 順 で 行 っ た32-34). p161NK4a蛋. られ,こ. 白 質 免 疫 細 胞 化 学 染 色 に お け る 判 定 は,細. 胞 質 と 核 にplCINK4a蛋. 一 致 して い た .一. の 部 位 に はp16〔NK4a蛋 白 質 へ の 反 応 は 認 め ら れ. な か っ た.ま. 白質 染 色 が 観 察 さ れ た場 合 に陽 性. と した.. 方 で 基 底 膜 下 の 間質 は正 常 細 胞 で 占 め. た 中 等 度 異 形 成 症 例(第2図C.D)で. 上 皮 の う ち 下 層3分 め,同. の2に. 部 位 にp161NK4a蛋. は. 異 常 増 殖 を示 す異 型 細 胞 を認. 白 質 へ の 強 染 色 が 認 め ら れ た.. 本 症 例 で は 病 変 に 連 続 し て 正 常 上 皮 領 域 を 認 あ た が,間 5.統. 計. 質 と共 にP161NK4a蛋. 扁 平 上 皮 系 病 変 の 進 行 とp161NK4a蛋 の 相 関 に っ い て はSpearman順 て 解 析 し た.頸. 白質 過 剰 発 現 頻 度. 位 相 関 係 数 検 定 を用 い. 部 腺 癌 に お け る 各 臨 床 因 子 とp161NK4a蛋. 白 質 の 染 色 は 認 め られ な か っ た.扁. 平 上 皮 癌 症 例(第2図E.F)で p161NK4a蛋. 白 質 の 強 陽 性 を 認 め た が,間. PIGINK4a蛋. 白 質 へ の 反 応 は 認 め な か っ た.対. 白 質 過 剰 発 現 頻 度 の 相 関 に つ い て はKruskal-Wallis検. 良 性 異 型 症 例 で は7例. 定 ま た はMann-Whitney検. た.. 危 険 率p<0.05の. 定 に て 解 析 し た.い. ずれ も. と き 統 計 学 的 に 有 意 差 あ り と 判 定 し た.. ハ イ リ ス ク 型HPV感 過 剰 発 現 頻 度 は,軽. 結. 果. %),中. HPV感. 宮 頸 部 扁 平 上 皮 系 病 変 に お け る ハ イ リス ク 型 染 率 とp161NK4a蛋. 白質 の 過 剰 発 現 頻 度 の関 連. 扁 平 上 皮 系 病 変 に お い てPCR法 ス ク 型HPVサ. よ び58型. 各 病 変 に お け る ハ イ リス ク 型HPV感 表 に 示 し た.軽 %),中. 高 度 異 形 成 症 例 で は34例 症 例 で は21例 18例. 中37例(49.3. 2.子. 中26例(76.5%),上. 中12例(32.4. 中32例(82.1%),高. 中23例(88.5%)で. 度. あ っ た.上. お よ び 扁 平 上 皮 癌 症 例16例. 皮 内. は全 例 が p 161NK4a蛋. に 中 等 度 異 形 成 か ら は 有 意 に 増 加 し て い た(p<. 平上皮癌症例 では. ハ イ リ ス ク型HPVが. 宮 頸 部 腺 系 病 変 に お け るp161NK4a蛋 白質 過 剰 発 現. 頻度 皮 内癌. 検 出 さ. れ た.. 上 皮 内 腺 癌 お よ び頸 部 腺 癌 症 例 にお け るp161NK4a蛋 白 質 免 疫 組 織 化 学 染 色 の 結 果 を第4図 A.Bに. に 示 した.第4図. 示 した 上 皮 内 腺 癌 症 例 に お い て は,同 一 腺 管 内. に正 常 腺 上 皮 と腫 瘍 細 胞 が 隣 接 して い る.腫 瘍 細 胞 で は. 扁 平 上 皮 系 病 変 に お け るplGINK4a蛋 染 色 の 結 果 を 第2図 A.B)で. 度 異 形 成 で は37例. 白質. 0.05).. 中39例(79.6%),. 中18例(85.7%),扁. 中16例(88.9%)で. 染 陽 性 症 例 で のp1GINK4a蛋. 白 質 過 剰 発 現 頻 度 は 病 変 の 進 行 と共 に 増 加 す る傾 向 を 示 し,特. で あ っ た.. 照群 であ る. 染 の 検 出 率 を 第2. 度 異 形 成 症 例 で は75例. 等 度 異 形 成 症 例 で は49例. 癌 症 例18例. 質 部 分 で は. で 弱 陽 性 を 示 した の み で あ っ. p16【NK4a蛋 白 質 過 剰 発 現 を 示 し た(第3図).. で検 出 され た ハ イ リ. ブ タ イ プ は16型,18型,31型,33型,. 35型,51型,52型,56型,お. 中1例. 等 度 異 形 成 で は39例. 異 形 成 で は26例 1.子. は病 巣 に限 局 して. に 示 し た.軽. 白質 免 疫 組 織 化 学. 対 し,正 常 腺 上 皮 細 胞 で はP161NK4a蛋 白 質 の過 剰 発 現 は. 度 異 形 成 症 例(第2図. は上 皮 全 層 を 占 め る異 型 細 胞 に お い て 細 胞 核. お よ び 細 胞 質 にp161NK4a蛋 上 皮 の う ち 下 層3分 認 め,p161NK4a蛋. 白 質 へ の 染 色 を 認 め た.特. の1にp161NK4a蛋. 細 胞 質 と核 にP161NK4a蛋 白質 の強 反 応 が認 め られ た の に. に. 白質 の強 い染 色 を. 白質 の 強 染 色 は 異 常 増 殖 を示 す 領 域 に 一T71一. 認 め られ な か った.ま た 周 囲 の 間 質 に も反 応 が 認 め られ ず,p161NK4a蛋. 白質 の過 剰 発 現 は病 変 に限 局 して観 察 さ. れ た.第4図C.Dに. 示 した 頸 部 腺 癌 症 例 に お い て も,. 腫 瘍 細 胞 で は細 胞 質 と核 にp161NK4a蛋 白質 の 強 反 応 が 認.

慶慮 医 学. 82巻2号(平. 成17年6月). 菖. ioOO. 議驚鞍 灘 80%. 60%. 「. b. " 7 ∫「1夙 ・7. 40%. C. P16'"...蛋 白 質 過 剰発 現の評価 20/. ■灘 性 中陽性 強陽性. ae 軽度異 形成 症 伊1磴[=37. 第3図. 中等 度 異 形 成 ∩=39. 高度異形成 [=26. 土皮内癌 n=18. ハ イ リス ク型HPV感. 零Spearm目n碩 位 相関係数検定. 扁 平上皮癌 n=15. 染 「場 性 症 例 に お け るpl6」'K4". 蛋 白質 過 剰 発 現 頻 度 ハ イ リス ク 型HPV感 お け るp16""""蛋. 染 が 検 出 さ れ た 扁 Ψ 卜皮 系 病 変 に. 白 質 過 剰 発 現 頻 度 を 示 した.病. 変か進. 行 す る に 伴 いpl6【周M凸蛋 白質 過 剰 発 現 頻 度 が 増 加 す る傾 向 が 示 さ れ,特. に軽 度 異形 成 か らIli等度 異 形 成 に 進 行 す. る際 に 有 恵 に増 加 して い た.. 第2図. 扁 平 上 皮 系 病 変 に お け るp161＼Ma蛋. 自質免 疫組織. 化学染色 A,B:軽 F;扁'F上. 度 異 形 成 症 例,. C,. D.中. 皮 癌 症 例,A,GE=ヘ. ジ ン 染 色,B,. D,. 等 度 異 形 成 症 例,. E,. マ トキ シ リン ー エ オ. F=pl6NK4凡. 蛋 白質免疫組 織化 学染色. (す へ て 対 物20倍) A-B,C-D,. E-Fで. 法 を 行 い,同. 一視 野 を 対 比 し た.. は それ ぞ れ連 続 切 片 を用 い て 各 染 色. 第4図. 腺 系 病 変 に お け るp16[、 民繍 蛋 白 質 免 疫 組 織 化 学 染. 色 A,B=⊥. 皮 内 腺 癌 症 例,GD=頸. 部 腺 癌 症 例,A,C:. ヘ マ トキ シ リ ン ー エ オ ソ ン 染 色,B,Dlpl6['楠 免 疫 組 織 化 学 染 色(す A-・B,C-Dで(3そ い,h/-一 Tonal. 385,2003の. 第3表. 症例数 7. の 第2表. M. 2 9 ρ 0. (lshikawa. Q 1. 染 色 態 度 は 第t表. of Gynecological 第1図. M. 陰 性(%). を 許 可 を 得 て 転 載). 蛋 白質 免 疫 組 織 化 学 染 色. 弱「 場性(%). 中 陽 性(%). 強 陽 性(%). 4(57./). 3(429). 0(0). 0〔0). 1(lo.G}. oto>. 4(40.0). ﾟ(129J. 8(/2.9). 1(11.1). 0(0). 13(210). 5(500) 33(53.2). 1(11./). 7〔77.8). に よ る. et. a]:lnternational. tourna]of. を 許 可 を 得 て 転 載). 一T72一. GynecoloSical. Pathology. 22. et al. Pathology. 腺 系 病 変 にお け るp16[」隔 蛋 白 質過 剰 発 現 頻 度 pl61舳. 正常 了宮頸 管腺 」L皮内腺癌 頸部腺癌 腺扁平上皮癌. れ ぞ れ 連 続 切 片 を 用 い て 各 染 色 法 をh. 視 野 を 対 比 し た.(lshikawa. Journal. 蛋 白質. べ て 対 物20倍). 378-385,2003. Internat 22:378….

石川. 第4表. HPV感. 染 とp16【NK4a蛋白質 の過 剰 発 現. 頸 部 腺 癌 に お け る病 理 組 織 学 的 分 類 とp16[NK4a蛋 白 質 過 剰 発 現 頻 度 の 相 関 pl61NK4a蛋. 症例数 8 3. 組織型 粘液性腺癌 類 内膜腺癌 混合型 分類不能 分化度 Gl G2 G3 扁平上皮系病変合併. ρ O F O 1 6 0. 17 10 1. り し あ な. 11 51. 検 定 は,*Kruskal-Wallis検 染 色 態 度 は 第1表 (lshikawa. M. 2表,第3表. 陰 性(%). 弱 陽 性(%). 中 陽性(%). 強 陽 性(%). 6(15.8) 1(6.3) 1(20.0) 0(0). 4(10.5) 3(18.8) oto> 1(33.3). 7(18.4) 3(18.8) 2(40.0) 1(33.3}. 21(55.3) 9(56.3) 2(40.0) 1(33.3). 3(17.6) 2(20.0) 0(0). 1(5.9) 1(10.0) o(o>. 4(23.5) 2(20.0) 0(0). 9(52.9) 5(50.0) 1(100). 1(9.1) 7(13.7). 1(9.1) 7(13.7). 4(36.4) 9(17.6). 定 お よ び**Mann-Whitney検. n.s.*. n.s.*. 5(45.5) 28(54.9)n.s.**. 定 による. による. et al:International. Journal. of Gynecological. Pathology. 22:378-385,2003の. 第. を 許 可 を 得 て 転 載). 第5表. 頸 部 腺 癌 に お け る予 後 因 子 とp161NK4a蛋 白 質 過 剰 発現 頻 度 の 相 関 p161NK4a蛋. 症例数 6 4. 術後進行期分類. ハ 0 2. pTINOMO pTINIMO,1. 5. pT2NOMO. 0. pT2NIMO,1 pT3,4. 1 76 1 4. 再発 あり な し 検 定 は,*Kruskal-Wallis検 染 色 態 度 は 第1表 (Ishikawa 第3表. 白質 免 疫 組 織化 学 染 色. M. 陰 性(%). 白質 免 疫 組 織 化 学 染 色. 弱 陽 性(%). 中陽 性(%). 強 陽性(%). 6(13.0). 5(10.9). 9(19.6). 26(56.5). 0(0). 1(16.7). 4(66.7). 1(16.7). 0(0). 0(0). 0(0). 2(100). 2(40.0). 0(0}. 0(0). 3(60.0). 0(0). 0(0). 0(0). 0(0). 3(27.3). 1(9.1). 3(27.3). 4(8.5). 6(12.8). 9(19.1). 定 お よ び**Mann-Whitney検. 4(36.4)** 28(59.6)n.s.. 定 による. による. et al:lnternational. Journal. of Gynecological. を 許 可 を 得 て 転 載). 一T73一. Pathology. 22:378-385,2003の. n.s.*.

慶 鷹 医学. 第6表. 82巻2号(平. 頸 部 腺 癌 に お け るハ イ リス ク型HPV感. 成17年6月). 染 とp161NK4a蛋 白質 過 剰 発 現 頻 度 の 相 関 p161NK4a蛋. ハ イ リス ク型HPV. 症例数. 陰 性(%). 6 1. 16. HPV. 18. HPV16&18重. 複感染 7 -. 陰性 *検 定 は. ,Mann・Whitney検. 頸 部 腺 癌49症 第1表. 弱 陽 性(%). 0(0) 0(0) 0(0) 6(35.3). 3 3 1■一. HPV. 白質 免 疫 組 織 化 学 染 色. 中陽 性(%). 1(6.3) 0(0) 1(33.3) 2(11.8). 強陽 性(%). 1(6.3) 5(38.5) 1(33.3) 5(29.4). 14(87.5) 8(61.5) 1(33.3) 4(23.5). p<0.01*. 定 による. 例 の う ちHPV. 16型. が16例,18型. が13例,混. 合 感 染 が3例. で 検 出 さ れ た.染. 色態度 は. に よ る.. (Ishikawa. M. et al:International. Journal. of Gynecological. Pathology. 22:378-385,2003の. 第4表. を 許 可 を 得 て 転 載). 第7表. 頸部腺癌 にお けるハ イ リスク型HPV感. 染 の検出 一PCR法 とISH法 の比較 一 単位:症 例数 ISH法. PCR法. 陰性. 陰性. 1玉3晒. HPVI6型. HPV. 0. 9. HPV16型,18型. 重複. HPVI8型. 16型. 藩. 1. .. wide. 1. 1. 0. 登. 、. 塚. 癖 ・1. ,峯. spectrum*. ミ. HPV18型. 6 は,PCR法. HPV. wide. 型,51型. とISH法. 0. ゾ轟. ノ. spectrum*:HPV6型,11型,16型,18型,30型,31型, お よ び52型. 鋸妥. ,. で 結 果 が 一 致 した群 33型,35型,45. を認 識 可能 な プ ロー ブ. あ られ た の に対 し,周 囲 の 間 質 に は反 応 が 認 め られ ず,. 術 後 進 行 期 分 類 や 再 発 の 有 無 と い った各 予 後 因 子 に お い. p161NK4a蛋 白 質 の 過 剰 発 現 は病 変 に 限局 して い た.腺 系. て もp16`NK4a蛋 白質 過 剰 発 現 頻 度 との 相 関 は認 め られ な. 病 変 にお け るp161NK4a蛋 白質 過 剰 発 現 頻 度 を 第3表. か った(第5表).. した.対 照 群7症 を3例. 例 にお い て,p161NK4a蛋. に示. 白質 の 弱 陽 性. に認 め た が 過 剰 発 現 を 示 した 症 例 は な か っ た.. 扁 平 上 皮 癌88.9%で. 宮 頸 部 腺 癌 に お け るp161NK4a蛋. とHPV感. p161NK4a蛋 白質 過 剰 発現 頻 度 は,上 皮 内 腺 癌90.0%,頸 部 腺 癌74.2%,腺. 3.子. あ り,腺 系 病 変. HPV感. に お い て もp161NK4a蛋 白質 は高 率 に過 剰 発 現 して い る こ. HPV16型. とが 判 明 した.. 腺 癌38症. 例(内 頸 部 型37症. 内膜 腺 癌16症. 染 率 の相 関 染 の 検 出 を 行 っ た 頸 部 腺 癌49症 も し く は18型. (65.3%)で. 今 回 検 討 した 頸 部 腺 癌62例. は病 理 組 織 学 的 に粘 液 性 例 お よ び腸 型1症. 例 お よ び混 合 型5症. 例),類. 例 と,組 織 型 分 類 が. 30症. 部 腺 癌 に お け るHPV感. 白 質 過 剰 発 現 の 棺 関 を 第6表. ま た は18型. 例 の うち. が 検 出 さ れ た の は32症. あ っ た.頸. 無 とplCINK4a蛋 HPV16型. 白質 過 剰 発 現 頻 度. 不 能 で あ った3症 例 に分 類 した.こ れ らの組 織 型 分 類 や 分 化 度,扁 平 上 皮 系 病 変 共 存 の 有 無 と い った病 理 組 織 学. 症 例 で は9症. 的分 類 とp161NK4a蛋 白質 過 剰 発 現 頻 度 に相 関 が 認 め られ. が 認 め ら れ,HPV感. る か を検 討 した が,各 分 類 とplGINK4a蛋 白質 の過 剰 発 現. 過 剰 発 現 頻 度 に 有 意 な 差 が 認 め ら れ た(p<0.01).. た 一T74一. 第5図. I 6型,18型. 例(52.9%)でp161NK4a蛋. にHPV16型,18型. 例 の うち. 白質 の過剰 発現 が認 め. ら れ た の に 対 し,HPV. 頻 度 に 有 意 な相 関 は認 め られ な か っ た(第4表).ま. 染 の有. に ま と め た.. が 陽 性 で あ っ た32症. 例(93.8%)でplGINK4a蛋. 例. が 陰 性 で あ っ た17 白質 の過 剰 発現. 染 の 有 無 に よ りp161NK4a蛋. 白質 の. が 陽 性 で あ った 症 例 の へ.

石 川'HPV感. 第5図. 染 とp16【NK"a蛋. 白質の過剰発現. 頸 部 腺 癌 に お け るpl6【NK伯 蛋 白 質 免 疫 組 織 化 学 染 色 とHPV16型,18禦In. A-C;HPV16型. 陽 性 症 例,. D-G. p16【N陥 蛋 白 質 免 疫 組 織 化 学 染 色, HybrldizahQn, A-C,D-Fで. G. l Fの. g HPVI8型. 陽 性 症 例,. C=HPV16型. 黒 枠 内 を 拡 大 し た.(A-F対. A,. 特 異 的in. D:ヘ. situ. Hybndiza50n,. 物40倍). は そ れ ぞ れ 連 続 切 片 を 用 い て 各 染 色 法 を 行 い,同. 一T75一. situ Hybndization. マ ト キ シ リ ン ー エ オ シ ン 染 色,. 一 視 野 を 対 比 し た.. F.HPV18型. B,. 特 異 的1n. E幽 situ.

慶賑医学. B. A. 82巻25(平. 成17年6月). 考. 轡. C. 察. 禽5 鞭. 鞍. '. 熊㌦ 撫 織. サ イ ク リ ン依 存 性 キ ナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ー で あ る pl61NK4"蛋. 遵認. D. 轟 シ. `時 」臥. 転 を 抑 え て い る.し. 等 度 異 形 成 症 例,B:高. 度 異 形 成 症 例,. 常 子 宮 頸 管 腺,. E,. F;頸. C:上. 酸 化 の状 態. 捕 捉 し細 胞 周 期 の 同. か し,Rb蛋. ン 酸 化 型Rb蛋. い,E2Fは. 胞化学染色. 癌 症 例,D:正. 白 質 は 脱IJン. 白質 が サ イ ク リンー サ. イ ク リ ン依 存 性 キ ナ ー ゼ 複 合 体 に よ る リ ン酸 化 を 受 け る. 子 宮 頸 部 擦 過 細 胞 を 用 い たp161医 陥 蛋 白 質 免 疫 細. A:中. 白質 に よ る細 胞 周 期 調 節 機 構 を. で 細 胞 周 期 転 写 因 子 で あ るE2Fを. と,リ 第6図. 白 質 はRb蛋. 制 御 す る 蛋 白 質 で あ る.Rb蛋. 細 胞 周 期 をGl期. 増 殖 が 始 ま る.ま. 皮 内. 部 腺 癌 症 例(す. 白 質 はE2Fと. 結 合す る活性 を失. か らS期. たE2Fは. に進 めて細胞 の. こ の 際 にp161MK4a蛋. 発 現 を 誘 導 す る と 考 え ら れ て い るtsi.誘. 自質 の. 導 さ れ た. べ て 対 物ioo倍) E,F内. の 矢 印 は 正 常 扁 平 上 皮 細 胞 を 示 す.(Ishikawa. et al:International logy. Journal. 22:378-385,2003の. of Gynecological 第2図. pl6【NK4己蛋 白 質 は サ イ ク リ ン ー サ イ ク リ ン 依 存 性 キ ナ ー. M. ゼ 複 合 体 を 阻 害 す る た め,間. Patho-. を 許 可 を 得 て 転 載). 化 を 抑 制 し て い る.こ. 接 的 にRb蛋. の よ う にP161NKGa蛋. 白 質 の リ ン酸 自 質 はRb蛋. 白 質 に よ る細 胞 周 期 調 節 機 構 を 制 御 す る役 割 を 有 して い るiz〕.19)(第7図A), り1993年 マ トキ シ リ ン ー エ オ ジ ン 染 色 とplCINKOa蛋 化 学 染 色 お よ びHPV16型,18型 い たISH法 pl61N楠. う ち12症. 子 の欠 失 や変 異 ま た は プ ロモ ー タ ーの メチ ル化 な どの遺. 変 部 分 に 限 局 して. の 結 果 を 第7表. に 示 し た.. DNAが とISH法. 伝 子 異 常 が 見 い 出 さ れ,以. 来pl61wヨ. 例 の. 点状 の シグナ の 検 出 結 果 は43. 一 方 で,ヒ. p16[NK4a蛋 E7蛋. ト乳 腺L皮. 細 胞 に ハ イ リ ス ク 型HPVと のE7蛋. 白 質 は 脱 リ ン酸 化 型Rb蛋. 宮 頸 部 擦 過 細 胞 を 用 い たpL6【NK4a蛋. 白質 免 疫 細 胞. P16rvKaa蛋. 白 質 免 疫 細 胞 化 学 染 色 の 結 果 を 第6図. す.第6図A.B,. C. E. Fの. 第6図E.F視. 度 異 形 成12症 例 中8症. 増 加 す る,そ. の結 果. 時 にpl6【NK4a蛋 白 質 が 過 乗1]. に 発 現 し て く る と 考 え ら れ る(第7図B).以. 一 ヒの 論 理. 例(53.3%),高. 例(25.0%),中. 腫 瘍 細 胞 にPICIVK4a蛋. 等度 異. 度 異 形 成iz症. よ び 上 皮 内 癌13症. 例 中12症. 例(85.7%)で. 例中. 例全例 において. 白 質 へ の 染 色 を 認 め た.ま. 蛋 白 質 お よ び 細 胞 周 期 に 及 ぼ す 影 響 をp16'""° °蛋 白 質 の 過 剰 発 現 と し て 捉 え る こ とが で き る14㈹32J.そ 究 で は,ハ. 常 の 子 宮 頸 管 腺(第6. 白 質 へ の 染 色 は認 め られ な か っ. 例 中3症. 9症 例(75.0%)お. に お い て は14症. 白. 野 内 の 矢 印 に 認 め られ る 正常 扁. 平 上 皮 細 胞 で はpl61NK4a蛋. 形 成15症. に示. 腫 瘍 細 胞 で はPICIVKJa蛋. 質 へ の 染 色 を 認 め た の に 対 し,正. た.軽. の 活 性 に よ り脱 リ ン酸 化 型. か ら 扁 平 上 皮 癌 の 発 癌 過 程 で ハ イ リ ス ク 型HPVがRb. 化学染色. 図D)や. 白 質 と 結 合 して そ の 機. 白 質 に 結 合 で き な いE2Fが. 細 胞 は異 常 増 殖 を 起 こ し,同 4,子. し. 白質 を導 入 す る と. 白 質 が 過 剰 に 発 現 さ れ る こ と が 報 告 さ れ た%).. 能 を 抑 制 す る活 性 を 有 し,こ Rb蛋. 一 致 して い た.. 蛋 白質 の不 活 化 は. 発 癌 因 子 と し て 注 目 さ れ て き た911,.. て 最 も 代 表 的 なHPV16型. PCR法. が 検 出 さ れ た28症. ル と し て 検 出 さ れ,PCR法 例 中25例(58,1%)で. らに腺 癌 細 胞. 点 状 の シグナ ルが. 例(429%)でHPV. 癌 や 白血. 特 異 的 プ ロ ー ブ を用. の 核 内 にHPV16型,18型DNAの. も し く は18型. に 報 告 さ れ た 蛋 白 質 で あ る が8,,肺. に よ. 病 を は じめ と す る 多 種 の 悪 性 腫 瘍 に お い てp16'""° °遺 伝. 蛋 白 質 の 過 剰 発 現 が 認 め ら れ,さ. に てHPV16型. 白 質 はSerranOら. 自質 免 疫 組 織. の 切 片 を 比 較 し た.病. 認 め ら れ た.ISH法. p1CINKOa蛋. た腺癌. 染 色陽性 で. イ リス ク 型HPVが. こで本 研. 関 与 して い る と 考 え ら れ. て い る 扁 平 上 皮 系 病 変 に お い て,HPV感. 染 とp16[NK4a. 蛋 白 質 過 剰 発 現 の 関 連 を 検 討 し た, 扁 平 上 皮 系 病 変 で のp161NK4a蛋 の 結 果,p16'"""°. 白質免疫組織化学 染色. 蛋 白質 は正 常 細 胞 や 良 性 異 型 細 胞 で は. 過 剰 発 現 を 示 さ な か っ た が,扁. 平 上 皮 系病 変 の 癌細 胞 や. 異形 成 細 胞 で は高 率 に過 剰 発 現 を示 して い た こ とが 判 明 し,免. 疫 組 織 化 学 染 色 を 用 い る こ と に よ り正 常 細 胞 と 腫. 瘍 細 胞 を 容 易 に 鑑 別 す る こ と が 可 能 で あ っ た.さ. あ っ た.. PICINKda蛋. らに. 白質 の過 剰 発 現 頻 度 は 病 変 の進 行 と共 に増 加. し て い く傾 向 が あ り,特. に軽 度 異 形 成 か ら中 等 度異 形 成. に 進 行 す る 際 に 有 意 に 上 昇 し て い る こ と が 判 明 し た. 一T76一.

石 川:HPV感. 染 とp16INK4a蛋. 白質の過剰発現. p161NK4a蛋 白質 の過 剰 発 現 はRb蛋. A. 示 して い る こ とか ら,HPV感 てRb蛋. 灘___篁 1リン靴1. 果 か ら,細 胞 周 期 調 節 機 構 の 破 綻 と い う観 点 に お い て軽. ,抑制1 蘭 と一一L三 」_. 卜. 度 異 形 成 と 中等 度 異 形 成 は異 な る病 態 で あ る こ とが示 唆. 。 轟. 炉 サ イ ク リン依 存性 キナ ーゼ4/6. 染 に よ る発 癌 機 構 に お い. 白質 の不 活 化 は軽 度 異 形 成 か ら中 等 度 異 形 成 に. 進 行 す る際 に高 率 に生 じて い る こ と が判 明 した.こ の結. i國 棚 子 ㊥ →. サ イク リンD. 白質 の 機 能 的 失 活 を. さ れ た.ま た 軽 度 異 形 成 症 例 の うちp16[NK4a蛋 白質 が過. 國. 剰 発 現 を示 す 群 は上 位 病 変 へ 進 行 す る危 険 が高 い群 で あ る と推 測 さ れ るが,我. P161NK4a 蛋 白. 々 の検 討 で は この推 測 を裏 付 け る. 明 確 な 結 論 は未 だ得 られ て い な い 。 今 後,plCINK4a蛋. 白. 質 過 剰 発 現 と い うパ ラメ ー タ ー を応 用 す る こ とで,軽 度 B. 異 形 成 患 者 群 の うち上 位 病 変 へ 進 行 す る危 険性 が高 い症 例 群 を抽 出す る方 法 が導 き 出 さ れ れ ば 臨床 上 きわ め て有 用 な ッ ー ル に な る と思 わ れ る. 一 方,頸 部 腺 系 病 変 に お いて もp161NK4a蛋 白質 の過 剰 発 現 は病 変 に 限局 して 高 頻 度 に 認 め られ た.Riethdorf やMilde-Langoschら. も頸 部 腺 系 病 変 にお け るp161NK4a. 蛋 白 質 の過 剰 発 現 を報 告 して い る36)'37).本研 究 に お い て も彼 等 が使 用 した抗 体 を用 い て免疫 組 織化 学 染色 を行 っ た が,正 常 頸 管 腺 上 皮 へ の非 特 異 的反 応 を認 あ た た め, 至 適 条 件 を見 い 出 せ な か った. 第7図. p161NK4a蛋 白質 の 生 理 活 性 と過 剰 発 現 の メ カ ニ ズ ム. (A)p161NK4a蛋. 頸 部 腺 癌 は発 癌 因 子 や組 織 型 別 の分 子 生 物 学 的差 異 な. 白質 の生 理 活 性 と発現 の し くみ. 脱 リ ン酸 化 型Rb蛋. 白質 は転 写 因 子E2Fと. ど に お い て 明 か に さ れ て い な い点 が多 い.そ の た め頸 部. 結合す る こと. で 細 胞 周 期 の調 節 を行 って い る.サ イ ク リンD一サ イ ク リ. 腺 癌 に お け る組 織 型,分 化 度,扁 平 上 皮 系病 変 の 混 在 の. ン依 存 性 キ ナ ー ゼ4/6の. 有 無 とい っ た病 理 組 織 学 的分 類 とp161NK4a蛋 白質 過 剰 発. す る と,リ す る.フ. ン酸 化 型Rb蛋. 複 合 体 がRb蛋. 白質 を リ ン酸 化. 白 質 は活 性 を失 いE2Fを. リー に な ったE2Fは. 細 胞 周 期 をG1期. 放出. 現頻 度 に相 関 が あ るか を検 討 した.そ の 目的 は組 織 型 の. か らS期. 違 い がHPV感. に進 め,細 胞 の 増 殖 が 始 ま る.こ の 際E2Fはp161NK4a蛋. 染 の 有 無 と関 連 して い る か否 か を 検 討 す. 白 質 の 発 現 を 誘 導 す る.p161NK4a蛋 白質 は サ イ ク リン依 存. る こ とで あ ったが,各 組 織 学 的 分 類 とp161NK4a蛋 白質 過. 性 キ ナ ー ゼ4/6を. 剰 発 現 頻 度 に相 関 は認 め られ ず,組. 抑 制 す る活 性 を有 して お り,Rb蛋. 白. 質 の リ ン酸 化 に歯 止 め を掛 けて い る. (B)HPV E7蛋 カニズム. 感 染 の 有 無 を 結 び 付 け る こ と は出 来 な か っ た.. 白 質 に よ るp161NK4a蛋 白 質 過 剰 発 現 の メ. また 本 研 究 で は術 後 進 行 期 分 類 や 再 発 の 有 無 と い った. ハ イ リス ク型HPVのE7蛋 型Rb蛋. 織 型 の 違 い とHPV. 白質 は宿 主 細 胞 の 脱 リ ン酸 化. 白質 と結合 して そ の 機 能 を抑 制 す る. E7蛋. の存 在 下 で は脱 リ ン酸 化 型Rb蛋. 白 質 はE2Fと. 予 後 因 子 とp161NK4a蛋 白 質 過剰 発 現 頻 度 に相 関 が あ るか. 白質. を 検 討 した.Leeら. 結合で き. はp161NK4a蛋 白質 の過 剰 発 現 が 前 立. 増 加 す る.こ の た め細. 腺 癌 にお け る再 発 予 知 の マ ー カ ー に な り うる こと を報 告. 胞 周 期 の異 常 回 転 が 生 じ,同 時 にnlGINK4a蛋 白質 は過 剰. して い る が38),子 宮 頸 部 腺 癌 に お い て は 各 予 後 因 子 と. な い た め,フ. リー とな っ たE2Fが. に 発 現 す る.Rb蛋. 白質 失 活 の 結 果 と して過 剰 に 発 現 さ. p161NK4a蛋 白 質 過 剰 発 現 頻 度 に相 関 は認 め られ な か った.. れ たp161NK4a蛋 白 質 の 生 理 的 な 役 割 は明 らか に さ れ て い な い が,p161NK4a蛋. 頸 部 腺 癌 に お け るハ イ リス ク型HPV感. 白質 が 過 剰 に発 現 さ れ て も,タ ー ゲ ッ. トで あ る脱 リ ン酸 化 型Rb蛋. 白 質 は す で にE7蛋. よ る不 活 化 を 受 け て い る た め,も. は やRb蛋. い て 今 日ま で い くつ か の報 告 が され て き た23-28).いず れ. 白質 に. 白質 による. もPCR法. 細 胞 周 期 調 節 機 構 は機 能 しな くな っ て い る.(Ishikawa Met. al:lnternational. Pathology. 22:378-385,2003の. Journal. of. 第3図. 染 の 関 与 にっ. やISH法. 報 告 で あ る が,ハ. Gynecological. を 用 い たHPV感. 染 の検 出に関す る. イ リス ク型HPV感. 染 の検 出 率 は そ の. 解 析 方 法 の違 い も反 映 して32%か. を許 可 を 得 て 転. 載). ら91%と. 報告 によ り. 大 き な差 が 見 られ た.ま た ハ イ リス ク型HPV感. 染が検. 出 され て も頸 部 腺 癌 の 発 癌 と結 びっ け る根 拠 が な く,頸 部 腺 癌 の発 癌 過 程 にHPV感. 染 が 関 与 して い るか 否 か は. 不 明 で あ っ た.そ こで 本 研 究 で は,扁 平 上 皮 系 病 変 にお 一T77一.

慶磨医学. 82巻2号(平. 成17年6月). い て 行 っ た 解 析 と 同 様 に 頸 部 腺 癌 に お け る ハ イ リス ク型. を 用 い たp1G-NK4a蛋 白質 の免 疫 化 学 染 色 を 細 胞 診 検 体 に. HPV感. 応 用 す る こ とが 可 能 か否 か を検 討 す る 目的 でp7G[NK4a蛋. 染 の 有 無 とp161NK4a蛋. 討 し,頸. 白質 過 剰 発 現 の相 関 を検. 白質 の 免 疫 細 胞 化 学 染 色 を 試 み た32-34).その 結 果,組 織. 部 腺 癌 の 発 癌 過 程 に お け る ハ イ リス ク 型HPV. の 関 与 を 明 ら か に しよ う と試 み た.頸 イ リ ス ク 型HPV感. 部 腺 癌 に お け るハ. 染 の 検 出 に 際 し て は,コ. 検 体 と同 様 に細 胞 診 検 体 でp161NK4a蛋 白 質 の 過 剰 発 現 を. ン タ ミネ ー. 検 出 す る こ とが可 能 で あ る こ とが 判 明 した.加 え て頸 部. 体 は頸 部 腺癌 の 病. 腺 癌 で は そ の解 剖 学 的位 置 に よ り,生 検 や 膣 拡 大 鏡 診 に. 巣 の み か ら 抽 出 して 隣 接 す る扁 平 上 皮 細 胞 の 混 入 を 防 い. て病 巣 を捉 え に くい こ とが あ り細 胞 診 の診 断精 度 が 強 く. だ.さ. 局 在 を明 らか に. 求 め られ る こ とが あ る.今 回 行 った免 疫 細 胞 化 学 染 色 の. た パ ラ フ ィ ン包 埋 切 片 を 検 体 と し て 用 い る こ と. 試 み か ら,臨 床 的 に有 用 な補 助 診 断 法 へ の発 展 が期 待 さ. シ ョ ンな ど の 偽 陽 性 を 防 ぐ た め に,検. ら にISH法. した.ま. も行 いHPV. か ら生 じ るPCR法. DNAの. れ た.. の 検 出 感 度 の 低 下 を 防 ぐ た め に,代. 表 的 な ハ イ リ ス ク 型 で あ るHPV16型. と18型. に標 的 を. 絞 り23-28),HPV16型,18型DNAのE6E7領. を 独 自 に開 発. し て 検 出 感 度 を 高 あ た6)・3').そ の 結 果,頸. 部 腺 癌 の65.. 3%でHPV16型. も し く は18型. に お い て もHPV. 16型,18型. 内 に 点 状 の シ グ ナ ル(ド た.Cooperら HPV. が 検 出 さ れ た. のDNAが. DNAが. して 検 出 さ れ. お け る ド ッ トパ タ ー ン は. 宿 主 細 胞 核 に イ ン テ グ レ ー シ ョ ン して い. る こ と を 示 し て い る39).こ HPV16型. も し く は18型. の こ とか ら頸 部 腺 癌 細 胞 に のDNAが. イ ン テ グ レー シ ョ. ン し て い る こ と が わ か っ た. HPV感. 例 に お け るp161NK4a蛋 め,ハ. か っ た.頸. イ リス ク 型HPV感. 染陽性症 占. 染 陰 性 症 例 に比 べ て 有 意 に高. 部 腺 癌 の61.2%の. 感 染 と と も にplGINK4a蛋. 白質 過 剰 発 現 頻 度 と の. 白 質 過 剰 発 現 頻 度 は93.8%を. イ リス ク 型HPV感. 括 白質 過 剰 発 現 と ハ イ リス ク型. 染 を指 標 と して子 宮 頸 癌 の分 子 生 物 学 的 解 析 を. 試 み た.そ. の結 果,ハ. イ リス ク型HPVに. よ るRb蛋. 白. 質 の不 活 化 は軽 度 異 形 成 か ら中等 度 異 形 成 に進 行 す る際 に高 率 に生 じて い る ことが 判 明 した.さ に お い て ハ イ リス ク型HPV感. らに,頸 部 腺 癌. 染 の有 無 に よ りpl61NK4a. 蛋 白 質 過 剰 発 現 頻 度 に有 意 差 が 認 め られ,頸 61.2%の. 症 例 は 発 癌 にハ イ リス ク型HPV感. 部腺 癌 の 染が関与 し. て い る可 能 性 が強 く示 唆 され た.. 染 の 有 無 とp161NK4a蛋. 相 関 を 検 討 した と こ ろ,ハ. 本 研 究 で は,p161NK4a蛋 HPV感. ISH法. 腫瘍 細胞 の核. ッ トパ タ ー ン)と. に よ る とISHに. 総. 域 の塩基. 配 列 か らそ れ ぞ れ 特 異 的 なnested-PCR法. この よ うにp161NK4a蛋 白質 過 剰 発 現 を検 討 す る ことで, 扁 平 上 皮 系 病 変 に お い て は ハ イ リス ク型HPV感. 析 す る こ とが で き,さ ク型HPV感. 症 例 で ハ イ リ ス ク 型HPV. 染 によ. り引 き起 こさ れ る宿 主 の変 化 と病 変 の進 行 との関 連 を解 らに腺 系 病 変 にお いて もハ イ リス. 染 と発 癌 を結 び っ け る こ とが で きた.ま. た. 細 胞 診 検 体 を用 い た臨 床 応 用 の 可 能 性 も示 唆 され た.以. 白 質 の 過 剰 発 現 が 検 出 さ れ た.. こ れ ら の 症 例 で は ハ イ リ ス ク 型HPVのDNAが. 検 出さ. 上 か ら,p161NK4a蛋 白 質 の 過 剰 発 現 を解 析 す る こ と は,. れ た だ け で な く宿 主 細 胞 の 反 応 で あ るp161NK4a蛋. 白質 過. 子 宮 頸 癌 にお け る発 癌 機 構 の 解 明 や 診 断 ッ ー ル に利 用 可. 剰 発 現 が 認 め ら れ た こ と か ら,頸 ス ク 型HPV感. 部 腺 癌 の発 癌 にハ イ リ. 能 で あ る こ とが 明 らか と な っ た.. 染 が 関 与 して い る可 能 性 が 強 く示 唆 さ れ. た.. 稿 を終 え る に当 た り,御 指 導,御 校 閲 を 賜 りま した慶. 一 方 で,ハ. イ リ ス ク型HPVが. 検 出 さ れ な か っ た頸 部. 磨 義 塾 大 学 医 学 部 産 婦 人 科 学 教 室 野 澤 志 朗 教 授 に深 甚 な. 腺 癌 に お い て もplL:INK4a蛋 白 質 が 過 剰 発 現 を 示 し た 群 が. る謝 意 を 表 します.ま. 49例. れ らの 症 例. 助 言 を い ただ き ま した慶 鷹 義 塾 大 学 医 学 部 産 婦 人 科 学 教. 伝 子 の 異 常 な どの 発 癌 機 構 が 生 じて い る と考. 室塚 崎 克 己 助 教 授,久 布 白 兼 行 講 師,藤 井 多 久 磨 博 士 に. 中9例(18.4%)存. で はRb遺. え ら れ た.し. か しPCR法. 在 し て い た が,こ. に よ るHPV検. も 考 慮 に 入 れ ざ る を 得 な い.ま 感 染 とp161NK4a蛋 た 群 は49例 症 例 は,HPV感. 出感 度 の 限 界. た 頸 部 腺 癌 の う ちHPV. 在 し て い た.こ. れ らの. 染 が 関 与 し な い メ カ ニ ズ ム に よ り発 癌. に 至 っ た と考 え ら れ た. 現 在 子 宮 頸 癌 の ス ク リー ニ ン グ の 方 法 と し て 細 胞 診 が 用 い ら れ て い る こ と か ら,本. 厚 く感 謝 い た します. 本 研 究 の一 部 は第14回. 白質 の過 剰 発 現 が 共 に検 出 さ れ な か っ. 中8例(16.3%)存. た,本 研 究 に際 し直 接 御 指 導,御. 研 究 で行 って きた組 織 検 体 一T78一. ダ ム,2001),第42回 2001),第30回 第60回. 国 際 細 胞 診 学 会(ア. ムステル. 日本 臨 床 細 胞 学 会(宇. 都 宮,. 日本 婦 人 科 腫 瘍 学 会(横. 日本 癌 学 会(横. 浜,2001),第40回. 浜,2001), 日本 臨 床. 細 胞 学 会 秋 期 大 会(米. 子,2001),第54回. 日本 産 科 婦. 人 科 学 会 学 術 集 会(東. 京,2002),第43回. 日本 臨 床 細. 胞 学 会(大. 阪,2002),第61回. 日本 癌 学 会(東. 京,.

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