KOMPARASI PRETREATMENT SAMPEL JARINGAN HEWAN
DENGAN PERENDAMAN BERBAGAI JENIS LARUTAN TERHADAP
KUANTITAS KONSENTRASI ISOLAT RNA
Sherry Aristyani 1), Evi Setyowati 1), Erni Widya Ningtiyas 1), Patricia Karin.H.P 1), Ahmad Fauzi 2), dan Dwi Listyorini 1)
1 Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Negeri Malang, Malang 2 Pasca Sarjana Pendidikan Biologi, Universitas Negeri Malang, Malang
e-mail :eik.aristyani@gmail.com
ABSTRAK
RNA merupakan materi genetik yang banyak terlibat dalam proses regulasi dan ekspresi gen. Saat ini penggunaan RNA sebagai bahan penelitian molekuler telah banyak digunakan. Pretreatment sampel merupakan proses yang perlu diperhatikan agar dapat menghasilkan isolat RNA dengan kualitas dan kuantitas baik. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pretreatment yang tepat dalam penyimpanan sampel jaringan hewan dengan perendaman berbagai jenis larutan. Jenis larutan yang digunakan adalah DEPC 0,01 %, alkohol 70 %, dan alkohol 96%. Sampel jaringan hewa n direndam terlebih dahulu dalam larutan selama 16 jam pada suhu ruang sebelum dilakukan isolasi RNA. Isolasi RNA menggunakan kit komersial NucleoSpin® RNA II Macherey-Nagel. Pengukuran kuantitas konsentrasi dan kemurnian isolat RNA dengan memggunakan spektrofotometri menunjukkan bahwa perendaman sampel dengan alkohol 70% mampu meningkatkan konsentrasi isolat RNA.
Kata Kunci : Isolat RNA, pretreatment, perendaman.
I. PENDAHULUAN
RNA merupakan salah satu materi genetik yang tersusun atas ribonukleotida adenin, sitosin, guanin, dan urasil. RNA banyak berperan dalam sintesis protein dan proses regulasi sel [6]. Saat ini, penggunaan RNA telah banyak digunakan sebagai bahan dalam penelitian bidang molekuler. Isolasi RNA merupakan teknik dasar untuk studi ekspresi gen dan untuk memproduksi gen baru melalui cDNA. RT-PCR, qPCR dan microarray merupakan teknik yang sekarang banyak digunakan untuk mendeteksi dan menganalisis produk transkripsi, teknik ini membutuhkan RNA sebagai bahan utama dalam prosesnya [12,3]. Konsentrasi dan kemurnian RNA merupakan parameter penting yang perlu dipertimbangakan sebelum melanjutkan tahapan penelitian berikutnya oleh karena itu diperlukan RNA berkualitas baik agar dapat memperoleh hasil yang akurat.
Isolasi RNA merupakan langkah awal dan sering dikatakan sebagai langkah paling ktiris. Diperlukan adanya perlakuan khusus atau modifikasi prosedur untuk memperoleh RNA dengan kualitas dan kuantitas yang baik, salah satunya adalah dengan pretreatment sampel atau perlakuan sampel terlebih dahulu sebelum dilakukan isolasi RNA. Dalam studi ini, beberapa metode pretreatment yang berbeda dibandingkan untuk mengetahui efek masing-masing metode terhadap kuantitas eluat RNA hasil ekstraksi. Tujuannya adalah untuk menentukan protokol pretreatment yang optimal untuk mengesktraksi RNA dari jaringan hewan.
II. METODE
Material
larutan DEPC 0,01 %, alkohol 70 %, dan alkohol 96% selama semalaman (± 16 jam) pada suhu ruang. Sebelum dilakukan isolasi RNA peralatan yang digunakan seperti batang penggerus, tips, dan microtube direndam dengan DEPC 0,01 % selama semalaman dan kemudian disterilkan.
Isolasi RNA
Isolasi RNA menggunakan kit komersial NucleoSpin® RNA II (Macherey-Nagel). Prosedur isolasi RNA yang digunakan sesuai dengan protokol kit. RNA yang diperoleh dilarutkan ke dalam RNase free water sebanyak 60 µl dan disimpan dalam lemari pendingin -20oC. Pengukuran konsentrasi dan kemurnian RNA dilakukan dengan mengunakan spektofotometri (Nanodrop 2000, Thermo Scientific)
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil pengukuran eluat RNA dengan spektrofotometri (table 1.) menunjukkan bahwa berbagai pretreatment perendaman sampel jaringan hewan menghasilkan konsentrasi RNA yang berbeda sedangkan kemurnian RNA yang hampir sama. Pada perendaman alkohol 70% menghasilkan konsentrasi RNA tertinggi, yaitu sebesar 210 ng/µl, kemudian disusul dengan perlakuan kontrol sebesar 128,6 ng/µl, perendaman alkohol 96% sebesar 28,3 ng/µl, dan perendaman DEPC 0,01% sebesar 6,4 ng/µl. Pada perendaman sampel dengan alkohol 70% dan perlakuan kontrol menghasilkan konsentrasi isolat RNA lebih tinggi jika dibanding perendaman sampel dengan DEPC 0,01% dan alkohol 96%. Hal tersebut disebabkan perendaman sampel dengan larutan DEPC 0,01% dan alkohol 96% menjadikan sampel kaku sehingga proses disrubsi dan homogenasi dalam isolasi RNA kurang optimal. Proses disrubsi yang kurang optimal menjadikan sampel tidak hancur sempurna dan dapat menyumbat membran filter silika pada saat proses penyaringan lysate.
Konsentrasi RNA pada perendaman alkohol 70% lebih tinggi jika dibandingkan dengan perlakuan kontrol disebabkan adanya struktur alkohol yang mampu menjaga RNA [1,4]. Adanya peningkatan konsentrasi isolat RNA pada penelitian ini dapat mengindikasikan bahwa alkohol 70% dapat
digunakan sebagai larutan untuk menyimpan sampel yang akan digunakan. Hal ini juga didukung dengan adanya penelitian sebelumnya yang menyatakan bahwa penyimpanan jaringan tumor pada alkohol mampu menjaga DNA dan RNA jika dibanding dengan jaringan tumor yang dingin [4]. Di sisi lain dilaporkan juga bahwa fiksasi jaringan dengan menggunakan alkohol dapat menghasilkan RNA dengan integritas yang lebih baik jika dibanding fiksasi dengan menggunakan formalin [5,7-10].
Pada perlakuan kontrol, perendaman alkohol 70%, dan alkohol 96% kemurnian RNA A260/A280 adalah 2,11-2,22, nilai tersebut menunjukkan bahwa RNA yang dihasilkan tersebut tidak terkontaminasi oleh protein atau fenol [11]. Pada perlakuan perendaman dengan DEPC 0,01% kemurnian RNA A260/A280 adalah sebesar 3,44, hasil tersebut mengindikasikan bahwa RNA mengalami degradasi [11]. Kemurnian RNA A260/A230 pada seluruh perlakuan adalah < 2, nilai tersebut mengindikasikan bahwa RNA tersebut masih terdapat molekul 2-merkaptoetanol [2].
Tabel 1. Hasil pengukuran konsentrasi dan kemurnian RNA
Perlakuan Konsentrasi (ng/µl)
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa perendaman sampel pada alkohol 70% sebelum dilakukan isoalasi RNA dapat meningkatkan konsentrasi isolat RNA.
VI.DAFTARPUSTAKA
[2] Davenport, A.P. 2005. Receptor Binding Technique Second Edition. Human Press: New Jersey
[3] Gupta, S., Verma, A.K. & Chand, L. 2012. Comparative study of different protocols for isolation of RNA from polysaccharides and polyphenolics rich plant tissues. International Journal of Plant Physiology and Biochemistry, 4(2): 23-26
[4] Hostein, I., Stock, N., Soubeyran, I., Marty, M., Mascarel, I.D., Bui, M., Geneste, G., Petersen, M.C., Coindre, J.M. & MacGrogan, G. 2011. Nucleic Acid Quality Preservation by an Alcohol-based Fixative Comparison with Frozen Tumors in a Routine Pathology. Diagn.Mol. Pathol., 20 (1).
[5] Kim, J.-O., Kim, H.-N., Hwang, M.-H., Shin, H.-I., Kim, S.-Y., Park, R.-W., Park, E.-Y., Kim, I.-S., van Wijnen, A.J., Stein, J.L., Lian, J.B., Stein, G.S. &Choi, J.-Y. 2003. Differential gene expression analysis using paraffinembedded tissues after laser microdissection. J. Cell. Biochem. 90: 998– 1006.
[6] Lodish, H., Berk, A., Zipursky, S.L., Matsudaira, P., Baltimore, D. & Darmel, J. 2000. Molecular Cell Biology, 4th edition. W.H. Freeman: New York
[7] Perlmutter, M.A., Best, C.J.M., Gillespie, J.W., Gathright, Y., Gonzalez, S.,Velasco, A., Linehan, W.M., Emmert-Buck, M.R. & Chuaqui, R.F., 2004.Comparison of snap freezing versus ethanol fixation for gene [8] Shibutani, M., Chikako, U., Keiko, M.,
Toyoda, K. & Hirose, M., 2000.Methacarn fixation: a novel tool for analysis of gene expressions in paraffin embedded tissue specimens. Lab. Invest. 80: 199–208. [9] Takagi, H., Shibutani, M., Kato, N., Fujita,
H., Lee, K.-Y., Takagami, S., Mitsumori, K. & Hirose, M., 2004. Microdissected region-specific gene expression analysis with methacarn-fixed, paraffin-embedded tissues by real-time RT-PCR. J. Histochem. Cytochem. 52: 903–913expression profiling of tissue specimens. J. Mol. Diagn. 6: 371– 377
[10] Vincek, V., Nassiri, M., Nadji, M. & Morales, A.R., 2003. A tissue fixative that protects macromolecules (DNA, RNA, and protein) and histomorphology in clinical samples. Lab. Invest. 83, 1427–1435.
[11] Ye, W., Liu, L., Zheng, W., Lin, J. & Yin, J. 2009. Comparison of RNA Extraction Methods Applied to Gene Cloning of the Taxol-Producing Fungi. African Journal of Microbiology Research, 3 (10): 632-636 [12] Yilmaz, R., Akca, O., Baloglu, M. C., Oz,
