!
" " !
# $ % & !
' (
)*+,-" $ % & !
' (
)*+,-!. . " % & !
//
01 2 3 4 33
! "
# $
$ # %
& &
'()'* +
$ & ,-*
),
+ ),. #
,-). '* + /
! ! 0
1 # # # # # #
+ # # # # # #
# # # # #
# 2 3 # # # #
# # + # ( # # # # #
# # 3 4 #
# # # # # # # # & #
# # # # # 1 (
3 # 3 # # # # # #
& '()'* # #
3 # # # #
# 3 # 3 # & ,-* # ),
5 # 3 # # # & # ),.
# 3 # ,- # ). 6'*
# 7 ( # # # # # # #
0 # #
(
( + . 3 ( &
5 6 7 ( 3 1 (
( (
3 . 3 3 5 ( (
( (
( ( 3 ( (
( ! ( 3 ( ( (
( ( & (
! ( 68 /99-7 ( ( 3 ( (
( 1 3 (
( ( 3 (
( ( ( + .
( ( 3 +3 (
6: /9;,7 ! (
;+/*< ( ( ( /)+/=< 6 !
*---7 ( ( + 5 +
( ( ( 5
( ( ( 6
*-->7 & 6/99)7 +
5 ( 3 ( + ( (
( 3 (
( ( ( (
( ( (
+ ' ( (
( 3 5 (
! ( 6 3 ! ! 7 ! ( (
( (
( ( ( 5
( 3 3 ( (
$ ( ( (
( 5 ( +
5 3 ( ( (
Sampel diambil dari tiga (3) spesies , yaitu kelapa, aren dan lontar. Sampel diambil dua kali, pada pagi hari (07.00 – 09.00) dan sore hari (15.00 – 17.00). Sebanyak 0.2!
20 ml nira segar diambil secara aseptik dan disimpan dalam suhu 4°C sampai proses
selanjutnya. Lokasi pengambilan yaitu di :
• Nira kelapa: Kecamatan Tuntang, Pabelan, Suruh (Kabupaten Semarang) dan
Kecamatan Wonosegoro (Kabupaten Boyolali) sebanyak 48 sampel.
• Nira aren: Desa Karangnongko (Kecamatan Tuntang), Desa Wonosari, Karang
Bawang, dan Kemambang (Kecamatan Banyubiru), Desa Lanjan, Jambe, Trayu, Candi Garon, Mitir, Ngoho dan Kebun Agung (Kecamatan Sumowono) di Kabupaten Semarang sebanyak 45 sampel.
• Nira lontar: Kabupaten Pati, Lasem, Tuban, Gresik, Paciran dan Kupang sebanyak
31 sampel.
Khamir diisolasi menggunakan media YPD (1% Bacto yeast extract, 2% Bacto pepton, 2% glukosa, pH 5) cair yang mengandung etanol 5%. Sebanyak 0.2 ml nira
diinokulasikan dan diinkubasi selama 24!48 jam pada suhu 30°C. Isolat dipisahkan dan
dimurnikan menggunakan medium agar YPD dengan prosedur mikrobiologi standar. Pengamatan morfologi koloni dan sel dilakukan terhadap isolat murni.
Isolat ditumbuhkan secara aseptis pada 2 ml medium YPD cair mengandung etanol dengan konsentrasi 10; 12.5; 13.5; 14; 14.25; 14.5; 14.75 dan 15% selama 24!48 jam pada suhu 30°C.
Isolat ditumbuhkan secara aseptis pada medium YPD cair yang mengandung etanol
5% dan indicator BCP ( ) 1.6% selama 24!72 jam pada suhu 30°C.
Kemampuan fermentasi ditandai dengan perubahan warna menjadi kuning dalam waktu ≤
24 jam.
Isolat ditumbuhkan secara aseptis pada medium YPD cair yang mengandung 2% sumber karbon yang berbeda!beda, yaitu xilosa, fruktosa, glukosa, maltosa, dan sukrosa.
Kultur ditumbuhkan secara sistem pada kecepatan 130 rpm pada suhu ruang sampai
mencapai fase stasioner (18!48 jam). Sampel kultur diambil secara periodik tiap 3!5 jam dan diukur kandungan gulanya dengan metode DNSA (dijelaskan selanjutnya) dan biomassa sel menggunakan spektofotometer pada panjang gelombang 660 nm.
Isolat ditumbuhkan secara aseptis pada medium YPD cair dengan sumber karbon glukosa 20% secara anaerob fakultatif. Inkubasi dilakukan selama 12!15 hari pada kecepatan 130 rpm di suhu ruang. Pengamatan konsentrasi etanol, biomassa dan glukosa dilakukan 3 hari sekali.
Pengukuran kadar glukosa dilakukan sesuai James (1995). Secara ringkas, pengukuran kadar glukosa dilakukan sebagai berikut: Sebanyak 0.5 ml supernatant dari sampel ditambahkan 1 ml air dan 0.5 ml reagen DNS (1% asam 3,5!dinitrosalisilat, 30%
natrium kalium tartrat, 0.4 M NaOH) lalu dipanaskan dalam suhu 100°C selama 5 menit
panjang gelombang 540 nm. Konsentrasi glukosa diukur dengan membuat kurva standar glukosa.
Kadar etanol diukur berdasarkan jumlah NADH yang terbentuk dari hasil oksidasi etanol menjadi asetaldehid oleh enzim ADH (alcohol dehydrogenase) dalam suatu reaksi yang membutuhkan NAD. Jumlah NADH yang terbentuk setara dengan banyaknya etanol ini kemudian diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 340 nm. Prosedur kerja yang dilakukan adalah sebagai berikut:
4.8 ml buffer (0.1 M Na4P2O7.10H2O, 0.02 M glisin, pH 8.7) ditambah dengan 0.1 ml sampel, 0.1 ml NAD, dan ADH 0.02 ml lalu diinkubasi pada suhu 25°C selama 70 menit. Setelah inkubasi, adsorbansi diukur pada panjang gelombang 340 nm dengan blanko H2O.
Konsentrasi etanol dihitung dengan menggunakan rumus (Boehringer, 1989): V x MW
Konsentrasi etanol (g/l) = _________________x 340 (sampel!blanko) x fp
ε x d x v x 1000 Keterangan:
V : volume total akhir (ml)
v : volume sampel (ml)
MW : berat molekul etanol (g/l)
d : diameter kuvet
ε : koefisien serapan NADH pada 340 nm (6,31 mol!1cm!1)
fp : factor pengenceran
Data dianalisis menggunakan ANOVA Satu arah yang dilanjutkan dengan uji Tukey. Perhitungan dilakukan dengan menggunakan program SPSS versi 12.0.
Pengambilan nira kelapa dilakukan secara acak pada penyadap nira kelapa di 48 titik lokasi yang tersebar di desa Gedangan, Ujung!Ujung, Krandon lor, Suruh, Plumbon, Medayu, Bonomerto (Kabupaten Semarang) dan Desa Garangan, Bandung, Gosono, dan Wonosegoro (Kabupaten Boyolali). Hasil isolasi khamir dari sampel!sampel tersebut menghasilkan total 48 isolat dengan perincian dan kode nomor sebagai berikut: 10 isolat dari Desa Gedangan (no. 1!10), 8 isolat dari Ujung!Ujung (no.11!18), 5 isolat dari Krandon lor (no.19!23), 4 isolat dari Suruh (no.24!27), 2 isolat dari Plumbon (no.28!29), 4 isolat dari Medayu (no.30!33), 2 isolat dari Bonomerto (no.34!35), 2 isolat dari Gosono (no.36!37), 4 isolat dari Bandung (no.38!41), 2 isolat dari Bedoyo (no.42!43), 2 isolat dari Wonosegoro (no.44!45), dan 3 isolat dari Garangan (no. 46!48).
Uji toleransi terhadap etanol menunjukkan bahwa isolat dari Gedangan dan Ujung! Ujung, yaitu no. 1, 5, dan 11, mempunyai toleransi tertinggi, yaitu mampu hidup pada konsentrasi etanol 14.75% (Tabel 1). Berdasarkan kecepatan fermentasi, sebanyak 9 isolat
mampu melakukan fermentasi dalam waktu ≤24 jam dan menyebabkan perubahan warna
BCP menjadi kuning. Isolat!isolat tersebut yaitu no. 1!2, 4!5, 11, 19, 26, 42, dan 45. Di antara 9 kultur tersebut, no. 42 mempunyai performa fermentasi terbaik, ditandai dengan warna kuning yang lebih pekat dibandingkan isolat!isolat lain.
!
"#$
% & ' % ( % ( )% * * '% * % * )%
Gedangan 10 6 5 5 3 2 2 2 2
Ujung!Ujung 8 3 2 2 2 1 1 1 1
Krandon Lor 5 2 1
Suruh 4
Plumbon 2
medayu 4
Bonomerto 2 1
Garangan 3 2
Bandung 4 1
Gosono 4 2 1
Wonosegoro 2
Ketiga kultur tersebut menunjukkan respon berbeda dalam adaptasi berbagai sumber karbon (Gambar 1). Isolat no.1 menunjukkan adaptasi terbaik terhadap glukosa, sedangkan isolat lainnya pada fruktosa. Berdasarkan peningkatan biomassa, fruktosa dan glukosa merupakan sumber karbon yang mendukung perkembangbiakan sel. Xilosa merupakan karbon yang paling sulit diutilisasi oleh khamir. Isolat no. 5 tidak dapat tumbuh, sedangkan isolat no. 1 dan 42 menunjukkan kecepatan tumbuh yang lambat. Dengan demikian, glukosa dipilih sebagai sumber karbon dalam uji produktivitas etanol.
Parameter yang diamati pada uji produktivitas etanol yaitu kadar etanol, penggunaan
glukosa dan peningkatan biomassa. digunakan sebagai control
dalam eksperimen tersebut. Gambar 2 menunjukkan bahwa hampir semua (99%) dari total
glukosa dapat dimanfaatkan oleh semua isolat khamir. mampu
! " $+ % " $+ *' " $ ,
- " $+ ".$+ / "0$+ " $+
" $
Dari segi pertumbuhan sel, isolat no.42 menunjukkan fase pertumbuhan yang relative lebih cepat dibanding isolat lain. Sebagai akibatnya, fase kematian isolat ini lebih cepat terdeteksi dibanding isolat lain, yaitu pada hari ke 12. Isolat no. 1 dan 5 serta memasuki fase stationer mulai hari ke 6!12, namun mampu bertahan sampai pada akhir eksperimen.
Produksi etanol baru tampak jelas setelah hari ke!6 untuk semua isolat. Kadar etanol tertinggi dihasilkan oleh isolat no.42 pada hari ke!12, yaitu sebesar 82 g/l. Namun demikian, kadar etanol ini menurun pada hari ke 15, sehingga hampir sama dengan kadar etanol isolat lain, yaitu 75.3 g/l (isolat no.5), 66.8 g/l (isolat no.1) dan 68.3 g/l (
). Tingginya kadar etanol yang dihasilkan suatu isolat bukanlah jaminan bahwa isolat tersebut unggul, karena tingkat konversi glukosa ke etanol (produktivitas etanol) juga harus diperhitungkan. Berdasarkan tingkat konversi substrat, maka isolat no. 1 adalah yang terunggul.
karbon dan mampu memproduksi etanol dalam jumlah besar. Namun dari segi efektivitas produksi etanol, maka isolat no. 1 mempunyai produktivitas etanol yang paling tinggi.
' " 1 $ " $+ " 1 $ " $
"2 33&$ " $ ! % " $+ *' ".$+ "0$ " $
Sampel nira aren diambil dari titik!titik lokasi yang tersebar di 11 desa di Kabupaten Semarang. Sebanyak 45 isolat berhasil dimurnikan dari sampel nira tersebut yaitu sebagai berikut: 4 isolat dari Desa Karangnongko (Kecamatan Tuntang) (no.49!52), 3 isolat dari Desa Wonosari (no.53!55), 3 isolat dari Desa Tegaron (no.56!58), dan 9 isolat dari Desa Kemambang (Kecamatan Banyubiru) (no.59!67), 4 isolat dari Desa Lanjan (no.68!71), 3 isolat dari Desa Jambe (no.72!74), 3 isolat dari Desa Candi Garon (no.75!77), 4 isolat dari Desa Mitir (no.78!81), 3 isolat dari Desa Ngoho (no.82!84), 4 isolat dari Desa Trayu (no.85! 88), dan 5 isolat dari Desa Kebun Agung (Kecamatan Sumowono) (no.89!93). Dari total 45 isolat, 8 isolat yang berasal dari Desa Karangnongko, Kemambang, Kebun Agung dan Lanjan mampu tumbuh pada medium yang mengandung konsentrasi etanol 14.75% (Tabel 2).
' !
"#$
% & ' % ( % ( )% * * '% * % * )%
Karangnongko 4 3 3 3 3 3 3 3 3
Kemambang 9 4 3 3 3 3 2 2 2
Tegaron 4 2 1 1
Wonosari 3 1 1 1
Kebun Agung 5 3 1 1 1 1 1 1 1
Trayu 4 3 1 1
Candi Garon 3 2 2 2
Jambe 3 2 2 2 1 1 1
Lanjan 4 3 3 3 2 2 2 2 2
Ngoho 2
Selanjutnya dilakukan uji kecepatan fermentasi dengan menggunakan indicator BCP.
Jumlah isolat khamir yang mampu melakukan fermentasi dalam waktu ≤24 jam, 24!48, dan
≥48 jam yaitu berturut!turut sebanyak 13, 2, dan 27 isolat. Sebanyak 3 isolat (7%) tidak dapat melakukan fermentasi. Berdasarkan hasil seleksi toleransi terhadap etanol dan kecepatan fermentasi, maka dipilih 3 isolat terbaik untuk eksperimen selanjutnya yaitu isolat
no.50 (toleran terhadap 14.75% etanol dan mampu memfermentasi ≤24 jam), no.55 (toleran
terhadap 13.75% etanol dan mampu memfermentasi ≤24 jam) dan no.93 (toleran terhadap
14.75% etanol dan mampu memfermentasi ≤24 jam). Berdasarkan morfologi koloni dan sel,
( ! %& " $+ %% " $+ 4( " $
, - " $+ ".$+ / "0$+ " $+
" $
Ketiga isolat tersebut ditumbuhkan pada medium YPD yang mengandung sumber karbon berbeda!beda seperti pada isolat nira kelapa untuk mengetahui sumber karbon yang cocok dalam produksi etanol. Gambar 3 menunjukkan bahwa masing!masing isolat memberikan respon berbeda terhadap variasi sumber karbon. Sama halnya dengan isolat yang diperoleh dari nira kelapa, isolat dari nira aren mampu beradaptasi dan menunjukkan pertambahan sel secara cepat pada medium yang mengandung glukosa dan fruktosa. Nilai pertumbuhan eksponensial (F) untuk medium xilosa, glukosa, fruktosa, maltosa, dan sukrosa ditampilkan di Tabel 3. Berdasarkan lama fase adaptasi dan sudut kemiringan kurva, isolat khamir dari nira aren memberikan respon pertumbuhan yang baik pada sumber karbon glukosa, fruktosa dan xilosa, sedangkan pada disakarida maltosa dan sukrosa responnya lebih lambat dibanding respon di sumber karbon monosakarida sederhana.
( !
%& %% 4(
xilosa 0.225 0.305 0.214
glukosa 0.366 0.209 0.251
fruktosa 0.439 0.226 0.416
maltosa 0.084 0.071 0.060
sukrosa 0.131 0.091 0.122
Selanjutnya, ketiga isolat khamir tersebut diuji produktivitas etanolnya pada sumber
karbon glukosa (Gambar 4). Seperti sebelumnya, digunakan
sebagai kontrol. Seperti halnya isolat nira kelapa, produksi etanol baru mulai meningkat setelah hari ke!6, sedangkan biomassa cenderung stationer. Pada akhir eksperimen (hari
ke!15), kadar etanol untuk , isolat no. 50, 55, dan 93 berturut!
turut adalah 68.3, 87.35, 90.3, dan 71.4 g/l. Hampir semua substrat digunakan oleh tiap
isolat (≥99%). Menurut uji statistika, produksi etanol ketiga isolat khamir berbeda nyata dari
5
* " 1 $ " $+ " 1 $ " $
"2 33&$ " $ ! " $+ %& ".$+ %% "0$+ 4( " $
Nira lontar diambil dari beberapa daerah di Jawa dan Nusa Tenggara Timur. Total isolat yang diperoleh dari nira lontar yaitu 31 isolat, dengan perincian sebagai berikut: 5 isolat dari NTT (no.94!98), 4 isolat dari Lasem (no.99!102), 4 isolat dari Pati (no.103!106), 5 isolat dari Pacitan (no.107!111), 6 isolat dari Gresik (no.112!117), dan 7 isolat dari Tuban (no.118!124)
* !
"#$
% & ' % ( % ( )% * * '% * % * )%
Gresik 6 5 5 5 4 4 3 2 2
Kupang 5 5 3 1 1 1 1 1 1
Lasem 4 4 2 2 1 1 1
Paciran 5 2 2 2 2 2 2 2 1
Pati 4 4 4 4 4 3 3 3 3
Tuban 7 4 3 3 3 2 2 2 2
total 31 isolat mampu melakukan fermentasi, dengan sebaran sebagai berikut: 21 isolat
(68%) mampu melakukan fermentasi dalam waktu ≤24 jam, 6 isolat (19%) mampu
melakukan fermentasi dalam waktu 24!48 jam, dan 3 isolat (10%) melalukan fermentasi ≥48
jam.
% ! 4 " $+ &* " $+ 43 " $
, - " $+ ".$+ / "0$+ " $+
" $
Ketiga isolat terplih lalu diuji kemampuannya menggunakan berbagai sumber karbon (Gambar 5). Semua isolat mampu tumbuh dengan baik pada medium dengan sumber karbon fruktosa, sukrosa, dan maltosa, walaupun inokulum yang digunakan pada medium maltosa dan sukrosa berjumlah dua kali dibanding medium lain. Untuk medium glukosa, fase adaptasi isolat cukup lama dan fase eksponensial nampaknya baru dimulai setelah jam ke 15. Pertumbuhan isolat no. 96 jauh lebih pesat dibandingkan 2 isolat lain dan mencapai fase stationer lebih cepat, sehingga pada akhir eksperimen (jam ke!30), konsentrasi sel antar isolat hampir sama. Untuk medium dengan xilosa, isolat no. 96 nampak kurang mampu memetabolisme xilosa dan mengalami kesulitan tumbuh, sehingga OD660 tertinggi <0.4. Fase stationer dan kematian sel pada medium xilosa ini juga tercapai lebih cepat oleh semua isolat dibandingkan sumber karbon lain. Pada medium mengandung glukosa, isolat no. 96 mampu tumbuh dengan cepat melebihi 2 isolat lainnya.
Produktivitas etanol ketiga isolat tersebut ditampilkan di Gambar 6. Berbeda dengan isolat dari nira aren dan kelapa, kadar etanol meningkat sejak hari pertama dan tidak ada kesan bahwa etanol diproduksi setelah biomassa. Akumulasi etanol isolat no. 96, 104 dan 119 pada hari ke!12 berturut!turut adalah 91.75 g/l, 82.21 g/l dan 87.79 g/l. Hasil ini jauh
lebih tinggi dibanding yaitu sebesar 76.62 g/l. Konsumsi
glukosa sama seperti eksperimen menggunakan isolat lainnya, di mana ≥99% glukosa habis
terkonsumsi pada akhir eksperimen. Dari segi biomassa, semua isolat mengalami kenaikan biomassa yang tajam sejak hari pertama dan mencapai fase stationer dan kematian rata! rata pada hari ke!8. Kematian sel tersebut diduga disebabkan oleh habisnya glukosa dan tingginya kadar etanol yang diproduksi sel.
Dengan demikian, ekpslorasi khamir dari nira lontar menghasilkan strain!strain local dengan toleransi etanol tinggi, kemampuan fermentasi yang cepat dan produksi etanol yang tinggi. Strain!strain ini menunjukkan potensi untuk digunakan dalam industry dan diharapkan
3 " 1 $ " $+ " 1 $ " $ "2 33&$
" $ ! 4 " $+ &* ".$+ 43 "0$
1. Total sampel adalah yaitu 124 sampel yang terdiri dari 48 isolat dari nira kelapa, 45 isolat dari nira aren dan 31 isolat dari nira lontar.
2. Morfologi sel dari semua isolat sama yaitu koloni putih!krem dengan tepian rata dan bentuk sel sub!globuse.
3. Dipilih tiga isolat dari masing!masing nira kelapa, aren dan lontar untuk uji produktivitas etanol berdasarkan toleransi terhadap etanol, kecepatan fermentasi dan fleksibilitas sumber karbon.
4. Varietas khamir lokal menunjukkan karakteristik fermentasi yang bagus, berdasarkan ketahanan terhadap etanol, kecepatan fermentasi, pertambahan biomassa, penggunaan substrat dan produktivitas etanol.
5. Penelitian ini menunjukkan bahwa Indonesia mempunyai sumber daya khamir lokal yang berpotensi dalam bidang industri etanol dan dapat menjadi alternative strain tradisional
.
: ? . # /9;, 1 ! 8 : & # !
/@6@72*/9+*;-. $ *--> 1! ? ! 3 # ! ' & &
& # ! );2 *-=+*@/
: /99) ! : 3 " $ ! ! ! . 3
! . . & 1 # 1 *--- . ! 1 !
3 1 !! ! ! & (( 1 &
& : ! A . : ' B /99) ? ! ' &
? ( ! ' 3 !! ! ! & 3 +. !
3 : " ! ! ! 3 # ! ,/6/-7
