Elisa

ﾧ ﾧ

聽

聽 _{Sejarah ELISA Sejarah ELISA}

Sebelum pengembangan ELISA, satu-satunya pilihan untuk melakukan suatu immunoassay Sebelum pengembangan ELISA, satu-satunya pilihan untuk melakukan suatu immunoassay adal

adalah ah radiradioimmoimmunoaunoassayssay, , teknteknik ik mengmenggunagunakan kan antiantigen gen berlberlabel abel radiradioaktoaktif if atau atau antiantibodi. bodi. DalamDalam radi

radioimmoimmunoasunoassaysay, , radiradioaktoaktivitivitas as memmemberikberikan an sinyasinyal, l, yang yang menumenunjuknjukkan kan apakapakah ah suatsuatu u antiantigengen tertentu atau antibodi hadir dalam sampel. adioimmunoassay pertama kali dijelaskan dalam kertas tertentu atau antibodi hadir dalam sampel. adioimmunoassay pertama kali dijelaskan dalam kertas oleh osalyn Sussman !alo" dan Salomo #erson diterbitkan pada tahun $%&'. Sebuah mikrobiologi oleh osalyn Sussman !alo" dan Salomo #erson diterbitkan pada tahun $%&'. Sebuah mikrobiologi me

menggnggunaunakan kan enen(im (im suasuatu tu LinLinked ked tes tes AsAssay say )EL)ELISAISA* * immimmunounosorsorbenbent, t, daldalam am rarangkngka a untuntuk uk  mengemba

mengembangkan metode untuk ngkan metode untuk deteksi +epat antigen p deteksi +epat antigen p I/ dalam sampel darah.I/ dalam sampel darah.

0arena radioaktivitas menimbulkan an+aman kesehatan potensial, alternatif yang lebih aman 0arena radioaktivitas menimbulkan an+aman kesehatan potensial, alternatif yang lebih aman itu

itu di+adi+ari. ri. SebuSebuah ah altalternaernatif tif yang +o+ok yang +o+ok untuuntuk k radiradioimmoimmunoasunoassay say akan mengganakan mengganti ti sinyasinyal l non- non-radioaktif di tempat sinyal non-radioaktif. 0etika en(im )seperti peroksidase* bereaksi dengan substrat radioaktif di tempat sinyal radioaktif. 0etika en(im )seperti peroksidase* bereaksi dengan substrat yang sesuai

yang sesuai )sep)seperti A#1S erti A#1S atau 2,2 atau 2,2 3, 3, 4,43-t4,43-tetraetrametmethylbehylben(idin(idine*, ne*, peruperubahabahan n "arna terjadi"arna terjadi, , yangyang digunakan sebagai sinyal. 5amun, sinyal tersebut harus dikaitkan dengan keberadaan antibodi atau digunakan sebagai sinyal. 5amun, sinyal tersebut harus dikaitkan dengan keberadaan antibodi atau an

antitigegen, n, yayang ng memengngapapa a enen(i(im m haharurus s didihuhububungngkakan n dedengngan an anantitibobodi di yayang ng sesesusuaiai. . 6r6rososeses menghubungkan se+ara independen dikembangkan oleh Stratis Avrameas dan 7# 6ier+e. 0arena itu menghubungkan se+ara independen dikembangkan oleh Stratis Avrameas dan 7# 6ier+e. 0arena itu  perlu untuk menghilangkan antibodi atau antigen terikat

 perlu untuk menghilangkan antibodi atau antigen terikat dengan men+u+i, antibodi atau antigen harusdengan men+u+i, antibodi atau antigen harus tetap ke permukaan "adah8. !aitu, immunosorbent telah harus dipersiapkan. Sebuah teknik untuk  tetap ke permukaan "adah8. !aitu, immunosorbent telah harus dipersiapkan. Sebuah teknik untuk  men+apai hal ini diterbitkan oleh 9ide dan :erker 6orath pada tahun $%&&.

men+apai hal ini diterbitkan oleh 9ide dan :erker 6orath pada tahun $%&&. 聽聽

6ada tahun $%;$, 6etrus 6erlmann dan Eva Engvall di <niversitas Sto+kholm di S"edia, dan 6ada tahun $%;$, 6etrus 6erlmann dan Eva Engvall di <niversitas Sto+kholm di S"edia, dan Anton S+huurs dan #auke van 9eemen di #elanda mandiri makalah yang disintesis pengetahuan ini Anton S+huurs dan #auke van 9eemen di #elanda mandiri makalah yang disintesis pengetahuan ini ke dalam metode untuk melakukan EIA = ELISA.

ke dalam metode untuk melakukan EIA = ELISA.

聽 聽 聽

聽 _{Pengertian ELISA Pengertian ELISA}

En(yme-Linked Immunosorbent Assay )ELISA* adalah suatu teknik biokimia yang terutama En(yme-Linked Immunosorbent Assay )ELISA* adalah suatu teknik biokimia yang terutama digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi kehadiran antibodi atau antigen dalam suatu digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi kehadiran antibodi atau antigen dalam suatu sampel. ELISA telah digunakan sebagai alat diagnostik dalam bidang medis, patologi tumbuhan, dan sampel. ELISA telah digunakan sebagai alat diagnostik dalam bidang medis, patologi tumbuhan, dan  juga

 juga berbagai berbagai bidang bidang industri. industri. Dalam Dalam pengertian pengertian sederhana, sederhana, sejumlah sejumlah antigen antigen yang yang tidak tidak dikenaldikenal ditempelkan pada suatu permukaan, kemudian antibodi spesifik di+u+ikan pada permukaan tersebut, ditempelkan pada suatu permukaan, kemudian antibodi spesifik di+u+ikan pada permukaan tersebut, sehingga akan berikatan dengan antigennya. Antibodi ini terikat dengan suatu en(im, dan pada tahap sehingga akan berikatan dengan antigennya. Antibodi ini terikat dengan suatu en(im, dan pada tahap terakhir, ditambahkan substansi yang dapat diubah oleh en(im menjadi sinyal yang dapat dideteksi. terakhir, ditambahkan substansi yang dapat diubah oleh en(im menjadi sinyal yang dapat dideteksi. Dalam ELISA fluoresensi, saat +ahaya dengan panjang gelombang

Dalam ELISA fluoresensi, saat +ahaya dengan panjang gelombang 聽聽 tertentu disinarkan pada suatu tertentu disinarkan pada suatu sampel, kompleks antigen=antibodi akan berfluoresensi sehingga jumlah antigen pada sampel dapat sampel, kompleks antigen=antibodi akan berfluoresensi sehingga jumlah antigen pada sampel dapat disimpulkan berdasarkan besarnya

disimpulkan berdasarkan besarnya fluoresensi.fluoresensi. ES

6enggunaan ELISA melibatkan setidaknya satu antibodi dengan spesifitas untuk antigen tertentu. Sampel dengan jumlah antigen yang tidak diketahui diimobilisasi pada suatu permukaan solid )biasanya berupa lempeng mikrotiter polistirene*, baik yang non-spesifik )melalui penyerapan  pada permukaan* atau spesifik )melalui penangkapan oleh antibodi lain yang 聽  spesifik 

untuk antigen yang sama, disebut 鈥 >i?sand"i+h 鈥 >=i? ELISA*. Setelah antigen diimobilisasi, antibodi pendeteksi ditambahkan, membentuk kompleks dengan antigen. Antibodi pendeteksi dapat berikatan juga dengan en(im, atau dapat dideteksi 聽   se+ara langsung oleh antibodi sekunder yang berikatan dengan en(im melalui biokonjugasi. Di antara tiap tahap, plate harus di+u+i dengan larutan deterjen lembut untuk membuang kelebihan protein atau antibodi yang tidak terikat. Setelah tahap pen+u+ian terakhir, dalam  plate ditambahkan substrat en(imatik untuk memproduksi sinyal yang visibel, yang

menunjukkan 聽  kuantitas antigen dalam sampel. 1eknik ELISA yang lama menggunakan substrat kromogenik, meskipun metode-metode terbaru mengembangkan substrat fluorogenik  yang jauh lebih sensitif.

Aplikasi ELISA

ELISA dapat mengevaluasi kehadiran antigen dan antibodi dalam suatu sampel, karenanya merupakan metode yang sangat berguna untuk mendeterminasi konsentrasi 聽  antibodi 聽  dalam serum )seperti dalam tes I/*, dan juga untuk mendeteksi kehadiran antigen. @etode ini juga bisa diaplikasikan dalam industri makanan untuk mendeteksi allergen potensial dalam makanan seperti susu, ka+ang, "alnut, almond, dan telur. ELISA 聽 juga dapat digunakan dalam bidang toksikologi untuk uji pendugaan +epat pada berbagai kelas obat.

ELISA adalah tes skrining dahulu banyak digunakan untuk I/ karena kepekaan tinggi. Dalam ELISA, serum seseorang dien+erkan '' kali lipat dan diterapkan pada pelat yang antigen I/ yang terpasang. :ika antibodi terhadap I/ hadir dalam serum, mereka dapat mengikat antigen I/. 6elat ini kemudian di+u+i untuk menghapus semua komponen lain dari serum. Sebuah antibodi sekunder khusus disiapkan - antibodi yang mengikat antibodi lain - kemudian diterapkan ke piring, men+u+i diikuti oleh yang lain. Ini antibodi sekunder se+ara kimia"i terkait di muka untuk en(im. Anti Ig7 manusia Antibodi 7anda Sand"i+h ELISA

Dengan demikian, piring akan berisi en(im sebanding dengan jumlah antibodi sekunder  terikat ke piring. Sebuah substrat untuk en(im diterapkan, dan katalisis oleh en(im mengarah ke  perubahan pada "arna atau fluoresensi. asil ELISA dilaporkan sebagai nomor8 aspek paling

kontroversial dari tes ini adalah menentukan +ut-off titik antara positif dan hasil negatif. Sebuah titik  +ut-off dapat ditentukan dengan membandingkannya dengan standar yang dikenal. :ika tes ELISA digunakan untuk skrining obat di tempat kerja, konsentrasi +ut-off, 4' ng = mL, misalnya, didirikan,

dan sampel yang berisi konsentrasi analit standar akan disiapkan. Diketahui bah"a menghasilkan sinyal yang lebih kuat daripada sampel dikenal adalah positif. @ereka yang menghasilkan sinyal lemah, yang negatif. Dokter Dennis E #id"ell dan Alister /oller men+iptakan tes.

0egunaan lain dari ELISA meliputiB $. deteksi antibodi mikobakteri dalam 1#. . deteksi rotavirus dalam tinja.

2. deteksi penanda hepatitis # dalam serum. . deteksi enterotoksin E. +oli dalam tinja.

聽 Tipe-tipe ELISA

Ada beberapa tipe-tipe ELISA, diantaranya adalah sebagai berikutB $.聽聽聽聽聽 Indire+t ELISA

.聽聽聽聽聽 Sand"i+h ELISA 2.聽聽聽聽聽 Competitive ELISA

聽

ﾧ聽

)7ambar @ekanisme Indire+t ELISA*

1ahap umum yang digunakan dalam indirect  _{ELISA untuk mendeterminasi konsentrasi}

antibodi dalam serum adalahB

a*聽聽聽聽聽 Suatu antigen yang sudah dikenal dan diketahui konsentrasinya ditempelkan pada  permukaan lubang plate mikrotiter. Antigen tersebut akan menempel pada permukaan plastik 

dengan +ara adsorpsi. Sampel dari konsentrasi antigen yang diketahui ini akan menetapkan kurva standar 聽 yang digunakan untuk mengkalkulasi konsentrasi antigen dari suatu sampel yang akan diuji.

 b*聽 聽 聽 聽 聽 Suatu larutan pekat dari protein non-intera+ting, seperti bovine serum albumin )#SA* atau kasein, ditambahkan dalam semua lubang plate mikrotiter.聽 1ahap ini dikenal

sebagai blo+king, karena protein serum memblok adsorpsi non-spesifik dari protein lain ke  plate.

+*聽 聽 聽 聽 聽 Lubang plate mikrotiter atau permukaan lain kemudian dilapisi dengan sampel serum dari antigen yang tidak diketahui, dilarutkan dalam buffer yang sama dengan yang digunakan untuk antigen standar. 0arena imobilisasi antigen dalam tahap ini terjadi karena adsorpsi non-spesifik, maka konsentrasi protein total harus sama dengan antigen standar. d*聽 聽 聽 聽 6late di+u+i, dan antibodi pendeteksi yang spesifik untuk antigen yang diuji

dimasukkan dalam lubang. Antibodi ini hanya akan mengikat antigen terimobilisasi pada  permukaan lubang, bukan pada protein serum yang lain atau protein yang terbloking.

e* 聽 聽 聽 聽 聽 Antibodi sekunder, yang akan mengikat sembarang antibodi pendeteksi, ditambahkan dalam lubang. Antibodi sekunder ini akan berkonjugasi menjadi en(im dengan substrat spesifik. 1ahap ini bisa dile"ati jika antibodi pendeteksi berkonjugasi dengan en(im. f*聽 聽 聽 聽 聽 聽 6late di+u+i untuk membuang kelebihan konjugat en(im-antibodi yang tidak 

terikat.

g*聽 聽 聽 聽 聽  Dimasukkan substrat yang akan diubah oleh en(im untuk mendapatkan sinyal kromogenik= fluorogenik= elektrokimia.

h*聽聽聽聽聽 asil dikuantifikasi dengan spektrofotometer, spektrofluorometer atau alat optik= elektrokimia lainnya.

En(im bertindak sebagai amplifier, bahkan jika hanya sedikit antibodi terikat en(im yang tetap terikat, molekul en(im akan memproduksi berbagai molekul sinyal. 0erugian utama dari metode indire+t ELISA adalah metode imobilisasi antigennya non-spesifik, sehingga setiap protein pada sampel akan menempel pada lubang plate mikrotiter, sehingga konsentrasi analit yang ke+il dalam sampel harus berkompetisi dengan protein serum lain saat pengikatan pada permukaan lubang.

ﾧ聽

1ahapan dalam Sand"i+h ELISA adalah sebagai berikutB

a*聽聽聽聽聽 Disiapkan permukaan untuk mengikatkan antibodi 鈥榩enangkap鈥>=span?  b*聽聽聽聽聽 Semua non spesifik binding sites pada permukaan diblokir 

+*聽聽聽聽聽 Sampel berisi antigen dimasukkan dalam plate

d*聽聽聽聽 6late di+u+i untuk membuang kelebihan antigen yang tidak terikat

e*聽聽聽聽聽 Antibodi primer ditambahkan, supaya berikatan se+ara spesifik dengan 聽 antigen f*聽 聽 聽 聽 聽 聽 Antibodi sekunder yang berikatan dengan en(im dimasukkan, yang akan

 berikatan dengan antibodi primer 

g*聽聽聽聽聽 6late di+u+i, sehingga konjugat antibodi-en(im yang tidak terikat dapat dibuang h*聽 聽 聽 聽 聽  Ditambahkan reagen yang dapat diubah oleh en(im menjadi sinyal ber"arna=

 berfluoresensi= elektrokimia

i*聽 聽 聽 聽 聽 聽 聽  Diukur absorbansinya 聽  untuk menetukan kehadiran dan kuantitas dari antigen

0euntungan utama dari metode sand"i+h ELISA adalah kemampuannya menguji sampel yang tidak murni, dan mampu mengikat se+ara selektif antigen yang dikehendaki. 1anpa lapisan  pertama antibodi penangkap, semua jenis protein pada sampel )termasuk protein serum* dapat diserap

6rinsip kerja sand"i+h ELISA dapat dilihat pada skema berikut iniB

聽 聽 _3.聽聽聽聽 _{Competitive ELISA}

1ahapan pengerjaan ELISA kompetitif berbeda dari dua metode yang telah dibahas sebelumnya, yaituB

a*聽聽聽聽聽 Antibodi yang tidak berlabel diinkubasi dengan kehadiran antigennya

 b*聽 聽 聽 聽 聽 0omplek antigen-antibodi ini selanjutnya ditambahkan pada lubang yang telah dilapisi antigen

+*聽聽聽聽聽 6late di+u+i, sehingga kelebihan antibodi ter+u+i )semakin banyak antigen dalam sampel, semakin sedikit antibodi yang dapat terikat pada antigen yang menempel pada  permukaan lubang, karena inilah disebut kompetisi

d*聽 聽 聽 聽 Ditambahkan antibodi sekunder yang spesifik utnuk antibodi primer. Antibodi sekunder ini berpasangan dengan en(im

e*聽聽聽聽聽 Substrat ditambahkan, en(im akan mengubah substrat menjadi sinyal kromogenik= fluoresensi.

Dalam ELISA kompetitif, semakin tinggi konsentrasi antigen orisinal, semakin lemah sinyal yang dihasilkan. 6rinsip kerjanya dapat dilihat pada gambar berikut iniB

聽

聽

聽 _4.聽聽聽聽 _{e!erapa dan Porta!"e ELISA #$ % P ELISA& #ELISA 'ever(e di ma)a"ah *ang}

diter!it)an&

Sebuah teknik baru )E6 $ %% % #$ di E6 #uletin 4.'.'% 5. ''%='%8 <S61 ;4$'&; di <S61 #uletin ''%='2=2$8 FL '2.$'.'%,' di SI6 C #uletin ''%='='* menggunakan fase padat terdiri dari polistiren immunosorbent batang dengan -$ ogives menonjol.

Seluruh perangkat direndam dalam tabung reaksi berisi sampel dikumpulkan dan langkah-langkah  berikut )+u+i, inkubasi dalam +onjugate dan inkubasi dalam +hromogenous* dilakukan oleh

men+elupkan ogives di mi+ro"ells standar mi+roplates pra-diisi dengan reagen.

0euntungan dari teknik ini adalah sebagai berikutB

6ara ogives masing-masing dapat peka terhadap reagen yang berbeda, memungkinkan deteksi simultan dari antibodi yang berbeda dan = atau antigen yang berbeda untuk multi-target tes8

/olume sampel dapat ditingkatkan untuk meningkatkan sensitivitas tes di klinik )darah, air liur, urin*, makanan )susu +urah, telur dikumpulkan* dan )air* lingkungan sampel8

Satu ogive yang tersisa unsensiti(ed untuk mengukur reaksi non-spesifik sampel8

6enggunaan perlengkapan laboratorium untuk mengeluarkan alikuot sampel, men+u+i solusi dan reagen dalam mi+ro"ells tidak diperlukan, memfasilitasi pengembangan siap menggunakan laboratorium-kit dan di tempat kit.

 +.聽聽聽聽 $ateria" ,a"am $etode ELISA

脴聽 Antigen

脴聽 @ono+lonal Ab

脴聽 @i+roplate

脴聽 #lo+king #uffer 

脴聽 Serum sample

脴聽 _{Conjugate )se+ondary Ab G En(yme*} 脴聽 Subtrate