BAB III
METODOLOGI
3.1 Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan di Kota Yogyakarta sebagai kota yang terkena dampak langsung erupsi Gunung Merapi dan di lokasi yang relatif tidak terlalu terpengaruh debu vulkanik di Kota Solo (kontrol). Pembuatan sediaan mikroskopis anatomi daun dan pengamatannya dilakukan di Laboratorium Anatomi Tumbuhan Departemen Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA) IPB. Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan Juni 2011 sampai dengan bulan Agustus 2011.
3.2 Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain pisau silet, tabung film, kertas label, termometer air raksa, mikrotom, counter, parafin strectcher, hot plate, mikroskop biasa, mikroskop foto, oven, gelas ukur, kamera digital, dan alat tulis.
Bahan yang digunakan dalam penelitian adalah alkohol 70%, akuades, asam asetat glacial, etanol, entellan, fast-green, clorox, formaldehid, gliserin, parafin oil, parafin, sampel daun (akasia dan mahoni), safranin, tertier butyl alcohol (TBA) dan xilol.
3.3 Jenis Data
Jenis data terdiri dari data primer dan data sekunder. Data primer diperoleh dari pengambilan sampel di lapangan dan pengamatan struktur anatomi daun. Data sekunder yang diambil adalah data kandungan udara Yogyakarta dan Solo dari Balai Lingkungan Hidup masing-masing kota.
3.3.1 Data Primer
Data primer yang diukur dan diamati dalam penelitian ini adalah :
a. Anatomi daun berupa sayatan paradermal, yang meliputi ukuran stomata (panjang dan lebar), kerapatan stomata, indeks stomata, kerusakan sel epidermis dan abnormalitas stomata.
Kerapatan stomata dan indeks stomata dihitung dengan menggunakan rumus: Kerapatan stomata = 𝐽𝑢𝑚𝑙𝑎 ℎ 𝑆𝑡𝑜𝑚𝑎𝑡𝑎 𝑆𝑎𝑡𝑢𝑎𝑛 𝑙𝑢𝑎𝑠 𝑏𝑖𝑑𝑎𝑛𝑔 𝑝𝑎𝑛𝑑𝑎𝑛𝑔
Indeks stomata
=
𝑆𝑡𝑜𝑚𝑎𝑡𝑎 𝑆𝑡𝑜𝑚𝑎𝑡𝑎 + 𝑆𝑒𝑙 𝑒𝑝𝑖𝑑𝑒𝑟𝑚𝑖𝑠x 100
b. Anatomi daun berupa sayatan transversal, yang meliputi tebal daun, jaringan epidermis, jaringan palisade, jaringan bunga karang dan kutikula.
3.3.2 Data Sekunder
Data sekunder penelitian ini berupa data kualitas udara Kota Yogyakarta dan Solo serta kondisi lingkungan yang diambil dari Balai Lingkungan Hidup (BLH) dan Biro Pusat Statistik (BPS) masing-masing kota.
3.4 Metode Pengambilan Data 3.4.1 Penentuan Plot Pengamatan
Plot pengamatan diambil di dua kota yaitu Kota Yogyakarta sebagai daerah yang tercemar debu vulkanik dan daerah Sukoharjo (Solo) sebagai daerah kontrol. Lokasi pengambilan sampel pohon masing-masing jenis pada kedua kota dilakukan secara acak. Sampel daun tercemar diambil di jalan Cendana Selatan Mandalakrida, Jalan Cendana Depan Mandala Krida, Jalan Gondosuli, Jalan Bimasakti, Jalan Jendral Soedirman dan Pertigaan Munggur (Lampiran 1). Sampel daun kontrol diambil di Jalan Slamet Riyadi, Jalan Jendral Soedirman, dan Jalan Jendral Ahmad Yani (Lampiran 2).
3.4.2 Penentuan Jenis Pohon
Penentuan jenis pohon dilakukan setelah melakukan pengamatan terhadap lokasi penelitian. Jenis pohon yang diambil berdasarkan jenis-jenis yang banyak ditanam dalam rangka pemulihan kondisi udara Kota Yogyakarta dan berdasarkan pada tingkat ketebalan daun yaitu sedang dan tipis. Jenis pohon yang dipilih adalah akasia dan mahoni.
3.4.3 Pengambilan Sampel Daun
Sampel daun yang digunakan untuk pengamatan irisan paradermal diambil dari 5 ulangan pohon pada posisi daun ke 6 dari pucuk pada 3 arah percabangan yang berbeda. Kemudian untuk kebutuhan irisan transversal, daun yang diambil adalah daun ke 5 dari pucuk pada 3 percabangan yang berbeda dengan 3 ulangan pohon. Masing-masing daun kemudian dimasukan ke dalam tabung film yang sudah diisi alkohol 70% dan diberi label.
3.4.4 Pembuatan Sediaan Mikroskopis
Sampel daun yang telah diambil kemudian diamati di Laboratorium Anatomi Tumbuhan Departemen Biologi FMIPA IPB. Pengamatan dilakukan terhadap irisan paradermal dan irisan transversal daun.
1. Irisan paradermal dibuat dalam bentuk preparat semi permanen dengan pewarnaan safranin 1% mengikuti metode Wholemount (Sass 1951) yaitu :
a. Daun difiksasi dalam alkohol 70%
b. Larutan fiksatif dibuang dan diganti dengan akuades
c. Daun dilunakan dengan merendamnya di dalam larutan HNO3 50% selama 2 hari, kemudian daun dicuci dengan akuades sebanyak 3 kali. d. Jaringan epidermis permukaan atas dan bawah daun akasia disayat
dengan menggunakan silet. Untuk jenis tanaman mahoni hanya dilakukan penyayatan lapisan bawah daun saja. Sebab setelah pengamatan pendahuluan diketahui bahwa pada daun mahoni, stomata hanya dijumpai pada permukaan abaksial.
e. Untuk menghilangkan klorofil dari mesofil yang terikut, sayatan epidermis direndam dalam larutan kloroks (bayclean) selama beberapa menit dan dicuci dengan akuades.
f. Irisan epidermis daun diwarnai dengan pewarna tunggal yaitu safranin 1% (aquosa) selama 1-3 menit, diletakan pada gelas objek yang telah diberi media gliserin 30% dan ditutup dengan gelas penutup kemudian diamati dibawah mikroskop.
Parameter anatomi daun yang diamati pada irisan paradermal adalah ukuran panjang, lebar, kerapatan dan indeks stomata serta kerusakan sel episermis dan abnormalitas stomata. Penghitungan kerapatan dan indeks stomata serta pengukuran stomata dilakukan pada 5 bidang pandang dengan perbesaran 10 x 40. 2. Irisan transversal menggunakan metode parafin (Johansen 1940). Adapun
tahapan pembuatan preparat daun adalah sebagai berikut :
a. Fiksasi : bahan difiksasi selama 48 jam dalam larutan FAA yang terdiri dari formaldehid, asam asetat glacial dan alkohol 70% dengan perbandingan 5:5:90.
b. Pencucian : larutan fiksatif dibuang dan dicuci dengan etanol 50% sebanyak 4 kali dengan waktu penggantian masing-masing 1 jam. c. Dehidarasi dan penjernihan: dilakukan secara bertahap dengan
merendam bahan dalam larutan seri Johansen I-VII (Lampiran 3). d. Infiltrasi : wadah berisi material dan campuran TBA, minyak
parafin serta parafin beku disimpan pada suku kamar selama 1 sampai 4 jam (tutup dibuka), lalu dimasukan dalam oven (58 0C) selama 12 jam (tutup dibuka). Keesokan harinya dilakukan 3 kali penggantian parafin setiap 6 jam dalam oven pada suhu 58 0C.
e. Penanaman (blok) : satu jam sebelum penanaman material, dilakukan penggantian parafin dengan parafin cair murni dan disimpan dalam oven pada suhu 58 0C. Selanjutnya material ditanam dalam blok parafin.
f. Pelunakan jaringan : blok yang berisi material dilunakan dengan merendam dalam larutan Gifford (Lampiran 4 ) selama dua minggu. g. Penyayatan : blok yang sudah dirapikan ditempel pada holder dan
disayat dengan mikrotom putar setebal 10 µm.
h. Perekatan : sayatan direkatkan pada gelas objek yang telah diolesi gelas albumin-gliserin dan ditetesi air. Kemudian gelas berisi pita parafin dipanaskan pada hot-plate dengan suhu 400C selama 24 jam. i. Pewarnaan : dilakukan pewarnaan ganda yang terdiri dari sarafin 2%
j. Penutupan : bahan diberi media entellan lalu ditutup dengan gelas penutup, diberi label dan dimasukan ke dalam oven 500C selama 24 jam.
k. Pengamatan di bawah mikroskop.
Parameter anatomi daun yang diamati pada irisan transversal adalah tebal daun, tebal kutikula, tebal jaringan epidermis, tebal jaringan palisade, dan tebal jaringan bunga karang. Pengukuran setiap parameter irisan transversal dilakukan pada 4 bidang pandang di bawah mikroskop.
3.5 Analisis Data
Analisis data menggunakan uji t-student dengan menggunakan software Statistic Product and Service Solution (SPSS) 17.0 untuk menguji perbandingan anatomi daun antara tanaman daerah yang tercemar debu vulkanik Gunung Merapi dengan daerah kotrol atau daerah yang relatif tidak tercemar. Parameter anatomi yang dibandingkan meliputi kerapatan stomata, indeks stomata, ukuran stomata, kerusakan sel epidermis, abnormalitas stomata, tebal daun, tebal jaringan kutikula, tebal jaringan epidermis, tebal jaringan palisade, dan jaringan bunga karang.
Kriteria uji menggunakan tingkat kepercayaan 95% dengan asumsi:
H0 :Pencemaran udara dari debu vulkanik Merapi tidak memberikan pengaruh nyata terhadap parameter yang diamati.
H1 : Pencemaran udara dari debu vulkanik Merapi memberikan pengaruh yang nyata terhadap parameter yang diamati.
Hasil analisis statistik data yang dianalisis didapatkan dengan menggunakan nilai signifikansi.
Signifikansi < 0,05 = Berbeda Nyata (Tolak H0, terima H1) Signifikansi > 0,05 = Tidak Berbeda Nyata (Tolak H1, terima H0)
