PENDAHULUAN
Latar Belakang
Lahan asam merupakan salah satu lingkungan yang membatasi produksi pertanian. Sekitar 50% lebih dari lahan pertanian di dunia adalah lahan asam (Bot et al. 2000). Sementara Indonesia mempunyai sekitar 47,5 juta ha tanah Podsolik Merah Kuning (CSAR 1997) yang bersifat asam dengan kelarutan aluminium (Al) yang tinggi.
Foy (1988) menjelaskan bahwa kemasaman tanah adalah faktor cekaman terbesar yang mempengaruhi pertumbuhan tanaman dengan keberadaan Al merupakan faktor pembatas pertumbuhan pada tanah asam. Pada pH dibawah 5, Al menjadi terionisasi yang sangat beracun bagi tanaman (Kinraide & Parker 1990; Kochian et al. 2004; Meriga et al. 2010 ). Aluminium telah bersifat racun bagi tanaman meskipun konsentrasinya masih sangat rendah. Walaupun demikian Al yang membentuk ikatan dengan ligand adalah tidak beracun bagi tanaman seperti aluminium silikat. Bentuk Al yang bersifat toksik bagi tanaman adalah ion Al3+ yang dominan pada kondisi asam (Matsumoto 2000; Kochian et al. 2004). Kelarutan Al yang tinggi di dalam tanah sangat merugikan tanaman karena dapat menghambat pertumbuhan akar (Delhaize & Ryan 1995; Rout et al. 2001; Kochian et al. 2005).
Tumbuhan yang hidup di tanah asam umumnya adalah tumbuh-tumbuhan yang dapat beradaptasi dengan lingkungan tersebut. Salah satu jenis tumbuhan yang banyak dijumpai pada Tanah Podsolik Merah Kuning adalah Melastoma (Tjitrosoedirdjo 1991). Melastoma merupakan anggota famili Melastomataceae, tersebar di daerah Tropik Asia dan seluruh Indonesia sebagai gulma. Salah satu spesiesnya adalah Melastoma malabathricum L. yang banyak dijumpai di lahan asam. Pertumbuhan akar M. malabathricum L. tidak mengalami gangguan pada pH 4.0 dan terganggu pada pH 3.0 (Muhaemin 2008). Tumbuhan ini dapat tumbuh dengan baik pada tanah asam yang tumbuhan lain tidak tumbuh sehingga dapat dijadikan sebagai tumbuhan indikator pada tanah asam. Watanabe et al. (1998) melaporkan bahwa M. malabathricum L. mampu mengakumulasi lebih dari 14.4 g Al kg-1 daun tua dan lebih dari 8 g Al kg-1 daun muda tanpa mengalami keracunan. Analisis akumulasi Al pada M. affine D.Don. (sinonim dengan M. malabathricum L.) yang mendapat cekaman 3.2 mM Al pH 4 pada media cair menunjukkan bahwa
M.affine D.Don. mampu mengakumulasi 8.81 g Al kg-1 daun tua setelah 2 bulan perlakuan (Mutiasari 2008).
Respon toleransi tanaman terhadap Al sangat berkaitan dengan gen-gen yang terlibat di dalamnya. Isolasi gen diperlukan untuk mengetahui regulasi ekspresinya, sehingga dapat dimanfaatkan untuk perbaikan genetika tanaman (Suharsono 2002). Gen-gen yang ekspresinya diinduksi oleh Al diduga terlibat dalam sistem toleransi terhadap Al. Sedikitnya ada 30 gen yang ekspresinya diinduksi Al (Darko et al. 2004), beberapa diantaranya adalah gen-gen yang mengkode enzim antioksidan, seperti glutathione-S-transferase (GST), ascorbate peroxidase (APX), catalase (Cat), dan superoxide dismutase (SOD) (Richards et al. 1998; Ezaki et al. 2000; Boscolo et al. 2003; Meriga et al. 2010). Superoxide dismutase (SOD) termasuk kelompok metalloenzim yang mampu menetralkan radikal bebas dengan mengkatalisis perubahan radikal superoksida menjadi molekul O2 dan H2O2. Superoksida merupakan salah satu radikal bebas turunan (derivate) oksigen reaktif (ROS) yang umumnya terdapat dalam sel tanaman sebagai hasil samping dari proses metabolisme normal. Akumulasi radikal bebas dapat menyebabkan kerusakan makromolekul sel dan bahkan kematian sel (Bowler et al. 1992; Scandalios 1993). Konsentrasi radikal bebas di dalam sel tanaman dapat meningkat ketika tanaman merespon cekaman biotik dan abiotik. Namun tanaman juga memiliki sistem pertahanan yang dapat mencegah peningkatan radikal bebas ini dengan adanya enzim antioksidan seperti SOD. Ada tiga tipe enzim SOD sesuai dengan logam yang berperan sebagai kofaktor pada sisi aktif enzimnya, yaitu copper/zinc (CuZn-SOD), besi (Fe-(CuZn-SOD), dan mangan (Mn-SOD). CuZn-SOD ditemukan di sitosol, kloroplas, dan peroksisom; Mn-SOD di mitokhondria; dan Fe-SOD di kloroplas
(
Bannister et al. 1987; Bowler et al. 1992; Bueno et al. 1995; Kliebenstein et al. 1998).Aktivitas SOD telah dilaporkan meningkat dengan adanya cekaman abiotik, seperti cahaya tinggi dan suhu rendah (Allen et al. 1997), sulfur dioksida (Tseng et al. 2008), kekeringan (Fu & Huang 2001; Bian & Jian; 2009), dan aluminium (Cakmak & Horst 1991; Basu et al. 2001; Du et al. 2010). Brassica napus yang tahan Al mengekspresikan gen SOD secara berlebih (Basu et al. 2001). Aktivitas enzim SOD juga meningkat dengan cekaman Al pada kedelai (Cakmak & Horst 1991; Du et al. 2010), gandum (Darko et al. 2004), dan padi
(Meriga et al. 2010). Cekaman Al dapat menimbulkan cekaman oksidatif dengan terbentuknya oksigen radikal (ROS) (Panda et al. 2003).
Gen penyandi SOD telah diisolasi dari jagung (Cannon et al. 1987), tomat (Perl-Treves et al. 1988), sawi (Liu et al. 1998), dan Nicotiana plumbaginifolia (Alscher et al. 2002). Pada Arabidopsis thaliana, telah diisolasi tiga gen CuZnSOD, yaitu CSD1, CSD2, dan CSD3. CSD1 dan CSD2 terekspresi pada akar, daun, dan batang, dan masing-masing target proteinnya di sitosol dan kloroplas. Sementara target potein CSD3 di peroksisom karena ujung karboksilnya mengandung tripeptida Ala-Lys-Leu yang merupakan targeting signal peroksisom (Kliebenstein et al. 1998).
Pada M. malabathricum L., beberapa gen yang diduga terlibat dalam cekaman asam dan Al telah diisolasi seperti multidrug resistance associated protein (MRP) (Suharsono et al. 2008), metallothionein type 2 (Mt2) (Suharsono et al. 2009), H+-ATPase membran plasma (Muzuni et al. 2010), dan sitrat sintase (Mushofa 2011). Namun sampai saat ini belum ada informasi tentang gen CuZn-SOD pada M. malabathricum L. yang diduga juga terlibat dalam toleransi terhadap cekaman asam dan Al. Untuk mempelajari ekspresi gen secara kuantitatif pada M. malabathricum L, informasi housekeeping gene dari tumbuhan tersebut sangat dibutuhkan sebagai kontrol internal. Sampai saat ini informasi tersebut belum ada. Menurut Maroufi et al. (2010) aktin termasuk salah satu kontrol internal yang paling stabil.
Beberapa metode dapat digunakan untuk mengisolasi gen antara lain melalui penapisan terhadap pustaka genom dan pustaka cDNA, serta RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction). Selain itu ada juga yang menggunakan metode RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) untuk memperoleh gen utuh, yaitu sintesis cDNA dengan menggunakan mRNA sebagai cetakan dan sekuen internal yang sudah diketahui urutan nukleotidanya serta adapter pada ujung 3’ atau 5’ sebagai primer. Metode RACE telah digunakan untuk isolasi gen utuh (full length) mannose-binding lectin dari umbi Zephyranthes grandiflora (Kai et al. 2006), gen penyandi Gibberellin 20-Oxidase
dari Helianthus annuus (Carzoli et al. 2008), dan gen penyandi H+-ATPase membran plasma dari M. malabathricum L. (Muzuni et al. 2010).
Peranan suatu gen dalam tanaman dapat dipelajari minimal dengan pendekatan dua arah, yaitu meningkatkan ekspresi gen dengan mengkonstruksi vektor over expression dan pendekatan kedua dengan menghentikan dan
menurunkan ekspresi atau pembungkaman gen antara lain dengan mengkonstruksi vektor RNAi (RNA interference). RNAi menyebabkan mRNA terdegradasi sehingga gen menjadi tidak berfungsi. Teknologi RNAi telah digunakan untuk mempelajari peranan gen penyandi H+-ATPase pada M. malabathricum L. (Muzuni et al. 2011), membungkam gen OsGEN-L pada padi (Moritoh et al. 2005), dan menurunkan ekspresi gen ornithine decarboxylase pada tanaman Nicotiana tabacum L. (DeBoer et al. 2011). Pada penelitian ini, telah dilakukan isolasi dan pengklonan fragmen gen penyandi aktin dari M. malabathricum L, selanjutnya dilakukan isolasi, pengklonan, dan analisis ekspresi gen penyandi copper/zinc-superoxide dismutase (CuZn-SOD) dari M. malabathricum L. Ekspresi gen dilakukan di tanaman model Nicotiana benthamiana dan Nicotiana tabacum, dan pembungkaman gen dilakukan di M. malabathricum L.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan :
1. Mengisolasi dan mengklon fragmen gen penyandi aktin dari Melastoma malabathricum L.
2. Mengisolasi, mengklon, dan menganalisis ekspresi gen penyandi copper/zinc superoxide dismutase (CuZn-SOD) dari M.malabathricum L. (MmCuZn-SOD). 3. Mengkonstruksi vektor ekspresi gen MmCuZn-SOD untuk ekspresi berlebih
pada tanaman Nicotiana benthamiana dan Nicotiana tabacum.
4. Mempelajari peranan gen MmCuZn-SOD melalui konstruksi vektor RNAi untuk pembungkaman gen pada tanaman M. malabathricum L.
Strategi Penelitian
Strategi yang digunakan untuk mencapai tujuan dengan membagi penelitian menjadi 4 aspek kajian (Gambar 1), yaitu:
1. Mengisolasi dan mengklon gen penyandi aktin dari M. malabathricum L. 2. Mengisolasi, mengklon, dan menganalisis ekspresi gen MmCuZn-SOD pada
M. malabathricum L. yang diberi perlakuan cekaman abiotik.
3. Mengkonstruksi vektor ekspresi untuk ekspresi berlebih gen MmCuZnSOD pada tanaman model N. benthamiana dan N. tabacum.
4. Mengkonstruksi vektor ekspresi RNAi untuk pembungkaman gen MmCuZn-SOD pada tanaman M. malabathricum L.
Gambar 1. Diagram alir percobaan isolasi, pengklonan, analisis ekspresi, analisis ekspresi berlebih pada tanaman model dan pembungkaman pada M.malabathricum L. gen penyandi CuZn-SOD dari M. malabathricum L. RACE, Rapid Amplification cDNA Ends; RNAi, RNA interference.
