* Alamat Korespondensi : [email protected]
DOI : http://dx.doi.org/10.21082/bullittro.v31n2.2020.123-134
KERAGAMAN GENETIK 64 AKSESI KUNYIT ASAL INDONESIA
BERDASARKAN MARKA P450-
BASED ANALOGUE
(PBA)
Genetic Diversity of 64 Turmeric Accessions from Indonesia
Based on P450-
Based Analogue
(PBA) Marker
Tresna Kusuma Putri1), Putri Ardhya Anindita2), Noladhi Wicaksana2), Tarkus Suganda2), Vergel Concibido3), Agung Karuniawan1,2)*
1)Sekolah Pascasarjana, Universitas Padjadjaran, Jalan Dipati Ukur No. 35 Bandung 40132 2)Fakultas Pertanian, Universitas Padjadjaran, Jalan Raya Bandung-Sumedang km 21, Jatinangor 45363
3)
Sensient Colors, LLC, 2515 North Jefferson Evenue, Saint Louis, Missouri 63106, USA
INFO ARTIKEL ABSTRAK/ABSTRACT
Article history: Kunyit merupakan tanaman penghasil rimpang yang memiliki banyak kegunaan,
baik untuk konsumsi, industri obat, maupun pewarna. Pengembangan varietas unggul kunyit di Indonesia saat ini perlu didukung oleh adanya informasi keragaman genetik. Saat ini informasi mengenai keragaman genetik tanaman kunyit di Indonesia masih belum tersedia. Salah satu cara untuk memperoleh informasi keragaman genetik adalah dengan menggunakan marka molekuler yang mampu memberikan hasil yang akurat dan tidak dipengaruhi oleh lingkungan. Marka PBA sebagai marka fungsional mampu mendeteksi gen P450 yang berkaitan dengan pembentukan metabolit sekunder pada area genom yang luas sehingga dapat dijadikan alternatif marka untuk mengidentifikasi keragaman genetik. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk memperoleh informasi keragaman genetik 64 aksesi tanaman kunyit menggunakan delapan pasang primer P450-Based Analogue (PBA). Penelitian dilakukan di Laboratorium Sentral Universitas Padjadjaran dari Juni 2019 hingga Januari 2020. Sebanyak 133 pita terdeteksi dengan rentang jumlah masing-masing alel 8 – 45 pita, dan rata-rata per alel 22,3 pita. Hasil analisis PIC menunjukkan adanya enam pasang primer PBA yang menunjukkan polimorfisme tinggi pada rentang 0,90 – 0,98 sehingga marka PBA dikategorikan sangat informatif. Analisis klaster membagi 64 aksesi kunyit ke dalam dua klaster utama berdasarkan tingkat kemiripan pada rentang 0,01 hingga 0,83. Aksesi CL-GTL01 yang berasal dari Gorontalo memiliki kemiripan yang rendah yaitu 0,01 terhadap 64 aksesi lainnya, sedangkan aksesi CL-NTB01 dan CL-PPB04 memiliki tingkat kemiripan yang tinggi pada jarak 0,83. Berdasarkan nilai PIC, jumlah pita polimorfik, dan jarak genetik, kunyit asal Indonesia memiliki keragaman yang luas berdasarkan marka PBA. Diterima: 30 Juni 2020
Direvisi: 26 Oktober 2020 Disetujui: 11 Desember 2020
Kata kunci:
Curcuma longa; cytochrome P450; dendrogram; PIC; UPGMA
Keywords:
Curcuma longa; dendrogram; PIC; sitokrom P450; UPGMA
Turmeric is a rhizome producing plant with many utilization such as for consumption, medicine, and colorant industries. The development of superior turmeric varieties in Indonesia needs to be supported by genetic diversity information availability. Despite its potential, genetic diversity information of Indonesian turmeric has not been widely observed. A molecular marker is used to address genetic diversity information with the accurate result due to minimum environmental influences. PBA can detect the P450 gene as a functional marker, which is related to the synthesis of secondary metabolites in a wide genome area. Thus, it can be used as an alternative marker to identify genetic diversity. This research aimed to obtain genetic diversity information of 64 turmeric accessions using eight primer sets of P450-Based Analogue (PBA). The study was conducted in the Central Laboratory of Padjadjaran University from June 2019 to January 2020. Results showed that the full 133 bands were detected with a range of allele number 8 - 45 bands and an average of 22.3 bands per allele. PIC analysis showed six primer sets of PBA had high polymorphisms ranged from 0.90 to 0.98, hence categorized
PBA as a highly informative marker. Cluster analysis divided 64 turmeric accessions into two main clusters based on a similarity index ranged from 0.01 to 0.83. The accession of CL-GTL01 origins from Gorontalo had a low similarity coefficient of 0.01 to the other 64 accessions cluster. On the other hand, NTB01 dan CL-PPB01 had the highest similarity index of 0.83. Based on the PIC value, the total number of polymorphic bands, and genetic distance, it can be concluded that local Indonesian turmeric had wide diversity based on PBA marker.
PENDAHULUAN
Kunyit (Curcuma longa L.) merupakan tanaman yang memiliki banyak manfaat bagi industri makanan dan obat-obatan. Secara tradisional, masyarakat telah mengenal kunyit dan memanfaatkannya sebagai obat (Kuntorini, 2005). Masyarakat di India, Cina, dan Asia Tenggara memanfaatkan kunyit sebagai pewarna, bumbu, dan pengawet makanan (Ishita dan Khaushik 2004). Penelitian di bidang kesehatan juga menunjukkan bahwa kunyit memiliki fungsi sebagai antidiabetes (Shabana et al. 2015), anti-HIV (Javed et al. 2016), antibakteri (Basir et al. 2018), antikanker (Shakeri et al. 2018), antioksidan (Kim dan Clifton 2018), dan antijamur (Sari et al. 2020). Banyaknya manfaat kunyit dapat
memberikan peluang dalam peningkatan
kesejahteraan masyarakat apabila dikelola dengan baik.
Kunyit merupakan tanaman yang berasal dari Asia Selatan dan telah digunakan dalam budaya Vedic di India sejak 4000 tahun lalu (Prasad dan Aggarwal, 2011). Saat ini kunyit telah menyebar dan dibudidayakan di Cina, Indonesia, Bangladesh dan Thailand (Selvan dan Thomas, 2002). Kunyit diperbanyak secara vegetatif
menggunakan rimpang karena jarang
menghasilkan bunga dan biji serta memiliki sterilitas yang tinggi karena memiliki kromosom triploid (2n=63) (Ravindran et al. 2007). Di sisi lain, penelitian menunjukkan adanya perbedaan genetik antara genotip kunyit di India pada tingkat gen meskipun tanaman tersebut diperbanyak secara vegetatif (Verma et al. 2015; Singh et al. 2015; Singh et al. 2018). Keragaman genetik pada tanaman yang diperbanyak vegetatif dapat terjadi melalui beberapa mekanisme seperti mutasi alami dan warisan epigenetik transgenerasi (Balloux et al. 2003).
Indonesia sebagai salah satu produsen kunyit yang besar memiliki potensi untuk pengembangan kunyit. Areal pertanaman kunyit yang luas mendukung Indonesia untuk mengembangkan tanaman ini sehingga menjadi lebih bernilai secara ekonomi. Pengembangan tanaman kunyit ke arah industri pangan dan obat-obatan perlu didukung dengan adanya pengembangan varietas unggul
yang sesuai dengan kebutuhan pasar. Menurut Govindaraj et al. (2015), keberhasilan petani dan
pemulia tanaman dalam mengembangkan
komoditas bergantung pada keragaman sumber daya genetik plasma nutfah. Evaluasi keragaman
memudahkan pemulia tanaman dalam
mengidentifikasi potensi dan nilai dari plasma nutfah (Kumar dan Kaur, 2010). Namun, informasi keragaman genetik kunyit saat ini masih terbatas
sehingga diperlukan suatu upaya untuk
mendapatkan informasi mengenai keragaman genetik kunyit di Indonesia. Informasi tersebut diperlukan dalam upaya pemuliaan tanaman untuk perbaikan genetik dan pengembangan tanaman kunyit di Indonesia.
Penggunaan marka molekuler dalam
mengidentifikasi keragaman genetik memiliki beberapa keunggulan. Marka molekular memiliki kemampuan yang tinggi dalam mengevaluasi tingkat keragaman, struktur genetik, dan kekerabatan berdasarkan keragaman dominansi dan kekayaan alel (Ismail et al. 2019). Selain itu, marka molekuler dapat menjadi alternatif dari serangkaian uji BUSS (Baru, Unik, Seragam, Stabil) dalam perlindungan varietas tanaman karena mampu membedakan varietas tanaman
(Moeljopawiro 2016). Penggunaan marka
molekuler dapat menunjukkan hasil yang lebih akurat dibandingkan dengan penggunaan marka morfologi yang penampilannya dipengaruhi oleh
lingkungan. Sanghamitra et al. (2015)
mengemukakan bahwa beberapa karakter kualitatif seperti kurkumin, minyak atsiri rimpang, dan kandungan minyak atsiri pada daun tanaman bervariasi dan dipengaruhi oleh perbedaan zona agroklimat. Oleh karena itu, marka molekuler dapat dijadikan alat untuk mengidentifikasi keragaman genetik.
Penggunaan penanda molekuler P450-Based Analog (PBA) merupakan salah satu cara untuk mengidentifikasi keragaman. Marka ini telah berhasil mengidentifikasi keragaman pada 51 spesies tanaman yang tergolong ke dalam 28 famili dengan jumlah fragmen yang dihasilkan sebanyak 41–63 (Yamanaka et al. 2003). Marka PBA merupakan marka yang sangat informatif dengan nilai polymorfism information content (PIC) dan persen polimorfisme yang tinggi (Wicaksana et al. 2011).
Aplikasi marka tersebut pada tanaman cabai menunjukkan nilai PIC yang tinggi (rata-rata 0,96) dibandingkan dengan marka RAPD (rata-rata 0,72) (Dolkar et al. 2019). Hal ini dikarenakan marka PBA mampu mendeteksi gen yang berperan dalam proses biosintesis dan biodegradasi metabolit sekunder (Greule et al. 2018). Penggunaan marka PBA untuk mendeteksi keragaman diperkirakan akan mampu menghasilkan sikuen yang lebih banyak dibandingkan dengan penggunaan marka SSR pada tanaman kunyit yang menghasilkan 2–8 alel (Senan et al. 2013). Penelitian ini bertujuan
untuk mengidentifikasi keragaman kunyit
berdasarkan marka PBA. Informasi yang
didapatkan dari studi mengenai keragaman genetik sangat penting dalam konservasi dan perakitan varietas unggul berbasis sumber daya lokal.
BAHAN DAN METODE
Bahan tanaman yang digunakan pada penelitian ini adalah 64 aksesi kunyit (C. longa) koleksi Laboratorium Pemuliaan Tanaman dan Teknologi Benih Universitas Padjadjaran yang berasal dari beberapa provinsi di Indonesia dan tiga varietas unggul milik Balai Penelitian Tanaman Rempah dan Obat (Balittro) (Tabel 1). Bahan tanaman berasal dari populasi kunyit yang telah dibudidayakan oleh masyarakat. Seluruh aksesi kunyit ditanam dan dikelola di Kebun
Percobaan Ciparanje, Fakultas Pertanian
Universitas Padjadjaran (753 m dpl) pada garis lintang 6o55’0.72804” S dan garis bujur 107o46’18.46056” E. Kegiatan penelitian dilakukan di Laboratorium Sentral, Universitas Padjadjaran dari Juni 2019 hingga Januari 2020.
Isolasi DNA
Daun tanaman kunyit yang digunakan untuk proses isolasi DNA adalah daun muda yang terletak pada daun kedua teratas. Prosedur isolasi DNA pada tanaman C. longa dilakukan mengikuti Promega (2017). Kualitas DNA hasil isolasi diuji melalui elektroforesis dengan agarose 1%. Konsentrasi dan kemurnian DNA dianalisis dengan menggunakan spektrofotometer NanoDrop.
Amplifikasi DNA dengan PCR
Optimasi Polymerase Chain Reaction (PCR) dilakukan untuk menentukan konsentrasi primer, template DNA, serta Taq polymerase yang memberikan hasil PCR optimal. Individu diambil secara acak dan diamplifikasi menggunakan delapan pasang primer (Tabel 2). Campuran larutan PCR yang digunakan mengacu pada panduan penggunaan MyTaq polymerase (Bioline), sedangkan proses amplifikasi DNA dengan PCR mengacu pada Yamanaka et al. (2003). Sampel dimasukkan ke dalam mesin PCR (LabCycler Gradient) dengan tahapan pra-denaturasi pada suhu 940C selama 5 menit, diikuti 32 siklus yang terdiri atas denaturasi pada suhu 940C selama 1 menit, annealing pada suhu 520C atau 560C selama 2 menit, dan ekstensi pada suhu 720C selama 3 menit. Tahap selanjutnya adalah final extention pada suhu 720C selama 5 menit yang diikuti dengan pendinginan pada suhu 40C.
Hasil PCR kemudian difraksinasi dengan elektroforesis menggunakan campuran pewarna gel (Gel Red, Biotium) sebanyak 3 µl pada agarose 1,5% (Thermo Fisher Scientific) dalam buffer TBE, pada tegangan 80 V selama 50 menit. DNA ladder 100 bp (Genetica Sciences) digunakan
sebagai pembanding ukuran DNA. Hasil
elektroforesis divisualisasikan menggunakan Gel Documentation (BluPad). Hasil optimasi PCR menunjukkan terdapat enam pasang primer yang menghasilkan pita DNA yang jelas.
Analisis data
Scoring dilakukan terhadap fragmen DNA yang teramplifikasi menggunakan angka biner 1 bila terdapat pita, dan 0 bila tidak terdapat pita. Data biner digunakan untuk menghitung jumlah alel dan nilai PIC yang menunjukkan tingkat informasi keragaman yang diberikan masing-masing pasangan primer yang digunakan mengacu pada Botstein et al. (1980). Data biner kemudian diolah menggunakan Sequential Agglomerative Hierarchical and Nested-Unweighted Pair-Group
Method with Arithmetic (SAHN-UPGMA)
menggunakan perangkat lunak NTSYS versi 2.0.2. (Rohlf 2000). Koefisien Jaccard digunakan untuk mengetahui indeks kemiripan dan keragaman antar sampel (Shameem dan Ferdous 2009).
Tabel 1. Deskripsi karakter morfologi aksesi kunyit asal Indonesia
Table 1. Morphological character description of turmeric accessions from Indonesia
No Nomor Aksesi Asal Batang
semu Tata letak daun pada batang Warna daun bawah Warna daun atas Pola urat daun
Tepi daun Kepadatan rimpang Bentuk rimpang Warna rimpang Jarak ruas rimpang
1 CL-JBR01 Jawa Barat Rapat Erect Hijau muda Hijau Dekat Gelombang Intermerdiet Lurus Oranye Dekat
2 CL-JBR02 Jawa Barat Terbuka Erect Hijau muda Hijau Jauh Gelombang Intermediet Lurus Oranye Dekat
3 CL-JBR07 Jawa Barat Terbuka Erect Hijau muda Hijau Dekat Gelombang Intermediet Lurus Oranye Dekat
4 CL-JBR11 Jawa Barat Terbuka Semi-erect Hijau Hijau Jauh Gelombang Renggang Lurus Oranye Dekat
5 CL-JBR13 Jawa Barat Terbuka Erect Hijau muda Hijau Dekat Gelombang Intermediet Lurus Oranye Dekat
6 CL-JBR14 Jawa Barat Rapat Erect Hijau muda Hijau Jauh Gelombang Intermediet Lurus Oranye Dekat
7 CL-JBR08 Jawa Barat Terbuka Semi-Erect Hijau muda Hijau Dekat Gelombang Intermediet Lurus Oranye Dekat
8 CL-JTG04 Jawa Tengah Terbuka Erect Hijau Hijau Jauh Gelombang Intermediet Lurus Oranye Dekat
9 CL-JTM02 Jawa Timur Rapat Erect Hijau muda Hijau Dekat Gelombang Intermediet Lurus Oranye Dekat
10 CL-JTM06 Jawa Timur Rapat Erect Hijau muda Hijau Dekat Rata Intermediet Lengkung Oranye Dekat
11 CL-JTM07 Jawa Timur Terbuka Semi-Erect Hijau Hijau Dekat Gelombang Intermediet Lurus Oranye Dekat
12 CL-SSL01 Sumatera Selatan Rapat Erect Hijau Hijau Dekat Rata Intermediet Lurus Oranye Dekat
13 CL-SSL02 Sumatera Selatan Rapat Erect Hijau Hijau Jauh Rata Intermediet Lurus Oranye Dekat
14 CL-SUT01 Sumatera Utara Terbuka Erect Hijau Hijau Dekat Gelombang Intermediet Lurus Oranye Dekat
15 CL-SUT02 Sumatera Utara Terbuka Erect Hijau muda Hijau Jauh Gelombang Intermediet Lurus Oranye Dekat
16 CL-SUT03 Sumatera Utara Terbuka Semi-Erect Hijau Hijau Dekat Gelombang Intermediet Lurus Oranye Dekat
17 CL-KLB01 Kalimantan Barat Rapat Erect Hijau Hijau Jauh Rata Renggang Lurus Oranye Dekat
18 CL-SLS01 Sulawesi Selatan Terbuka Erect Hijau muda Hijau Dekat Gelombang Intermediet Lurus Oranye Dekat
19 CL-SLT01 Sulawesi Timur Terbuka Erect Hijau Hijau Dekat Gelombang Intermediet Lurus Oranye Dekat
20 CL-MLK01 Maluku Terbuka Erect Hijau Hijau Dekat Gelombang Padat Lurus Oranye Dekat
21 CL-NTB01 Nusa Tenggara Barat Terbuka Erect Hijau Hijau Dekat Gelombang Intermediet Lurus Oranye Dekat
22 CL-PAP01 Papua Terbuka Erect Hijau muda Hijau Jauh Gelombang Intermediet Lengkung Oranye Dekat
23 CL-PAP03 Papua Terbuka Erect Hijau Hijau Dekat Gelombang Intermediet Lengkung Oranye Dekat
24 CL-PPB01 Papua Barat Rapat Semi-Erect Hijau Hijau Dekat Gelombang Intermediet Lurus Oranye Dekat
25 CL-PPB04 Papua Barat Terbuka Erect Hijau Hijau Dekat Gelombang Intermediet Lengkung Oranye Dekat
26 CL-PPB05 Papua Barat Rapat Erect Hijau Hijau Jauh Gelombang Renggang Lurus Kuning lemon Dekat
27 CL-PPB08 Papua Barat Terbuka Erect Hijau Hijau Dekat Gelombang Intermediet Lurus Oranye Dekat
28 CL-PPB09 Papua Barat Rapat Erect Hijau Hijau Dekat Rata Renggang Lurus Oranye Jauh
30 31
CL-NAD01 CL-KBB01
Aceh Kep. Bangka Belitung
Terbuka Terbuka Erect Semi-Erect Hijau muda Hijau muda Hijau Hijau Jauh Dekat Rata Gelombang Intermediet Padat Lurus Lurus Oranye Oranye Dekat Dekat
32 CL-SLS02 Sulawesi Selatan Terbuka Semi-Erect Hijau Hijau Dekat Gelombang Intermediet Lurus Oranye Dekat
33 CL-BAL01 Bali Terbuka Semi-Erect Hijau muda Hijau Dekat Gelombang Intermediet Lurus Oranye Dekat
34 CL-GTL01 Gorontalo Terbuka Erect Hijau Hijau Jauh Gelombang Intermediet Lurus Oranye Dekat
35 CL-KLT02 Kalimantan Timur Rapat Erect Hijau muda Hijau Jauh Rata Intermediet Lurus Oranye Dekat
36 CL-SSL04 Sumatera Selatan Rapat Erect Hijau muda Hijau Jauh Gelombang Intermediet Lurus Oranye Dekat
37 CL-MLK04 Maluku Terbuka Erect Hijau Hijau Jauh Gelombang Intermediet Lurus Oranye Dekat
38 CL-SLT04 Sulawesi Timur Terbuka Semi-Erect Hijau Hijau Dekat Gelombang Intermediet Lurus Oranye Dekat
39 CL-KBB02 Kep. Bangka Belitung Terbuka Erect Hijau Hijau Dekat Rata Intermediet Lurus Oranye Dekat
40 CL-JMB01 Jambi Terbuka Erect Hijau Hijau Dekat Gelombang Intermediet Lurus Oranye Dekat
41 CL-BTN01 Banten Terbuka Erect Hijau Hijau Jauh Gelombang Intermediet Lurus Oranye Dekat
42 CL-KBB03 Kep. Bangka Belitung Terbuka Semi-Erect Hijau muda Hijau Jauh Rata Renggang Lurus Oranye Dekat
43 CL-NTB03 Nusa Tenggara Barat Terbuka Erect Hijau Hijau Dekat Gelombang Padat Lengkung Oranye Dekat
44 CL-KBB04 Kep. Bangka Belitung Rapat Erect Hijau Hijau Jauh Gelombang Intermediet Lurus Oranye Dekat
45 CL-KBB05 Kep. Bangka Belitung Rapat Erect Hijau muda Hijau Dekat Gelombang Padat Lurus Oranye Dekat
46 CL-BTN02 Banten Rapat Erect Hijau Hijau Dekat Gelombang Padat Lurus Oranye Dekat
47 CL-BKL01 Bengkulu Terbuka Erect Hijau Hijau Jauh Gelombang Intermediet Lurus Oranye Dekat
48 CL-KTG01 Kalimantan Tengah Terbuka Erect Hijau Hijau Jauh Gelombang Padat Lengkung Oranye Dekat
49 CL-SLU01 Sulawesi Utara Rapat Erect Hijau Hijau Jauh Gelombang Intermediet Lurus Oranye Dekat
50 CL-STG01 Sulawesi Tenggara Rapat Erect Hijau Hijau Dekat Rata Intermediet Lurus Kuning lemon Dekat
51 CL-STG02 Sulawesi Tenggara Terbuka Erect Hijau Hijau Jauh Gelombang Padat Lurus Oranye Dekat
52 CL-SLS04 Sulawesi Selatan Terbuka Semi-Erect Hijau muda Hijau Jauh Gelombang Intermediet Lurus Oranye Dekat
53 CL-MUT01 Maluku Utara Rapat Erect Hijau Hijau Dekat Gelombang Renggang Lurus Kuning lemon Dekat
54 CL-LMP04 Lampung Rapat Erect Hijau Hijau Dekat Even Intermediet Lurus Oranye Dekat
55 CL-SMB01 Sumatera Barat Terbuka Erect Hijau Hijau Dekat Gelombang Intermediet Lurus Oranye Dekat
56 CL-NAD03 Aceh Rapat Erect Hijau Hijau Jauh Gelombang Renggang Lengkung Oranye Dekat
57 Turina 1 (T1) Balittro Terbuka Semi-Erect Hijau Hijau Dekat Gelombang Intermediet Lurus Oranye Dekat
58 Turina 2 (T2) Balittro Rapat Semi-Erect Hijau muda Hijau Dekat Gelombang Padat Lurus Oranye Dekat
59 Turina 3 (T3) Balittro Terbuka Erect Hijau muda Hijau Dekat Gelombang Intermediet Lurus Oranye Dekat
60 CL-JBR16 Jawa Barat Terbuka Erect Hijau muda Hijau Dekat Gelombang Intermediet Lurus Oranye Dekat
61 CL-JBR06 Jawa Barat Terbuka Semi-Erect Hijau Hijau Dekat Gelombang Intermediet Lurus Oranye Dekat
62 CL-JBR12 Jawa Barat Terbuka Erect Hijau Hijau Dekat Gelombang Padat Lurus Oranye Dekat
63 CL-YOG01 Yogyakarta Terbuka Erect Hijau Hijau Jauh Gelombang Intermediet Lengkung Oranye Dekat
Tabel 2. Primer dan suhu annealing marka PBA
Table 2. Primer and annealing temperature of PBA markers
Sumber/Source : Yamanaka et al. (2003)
HASIL DAN PEMBAHASAN
Nilai polymorphism information content (PIC) dan kesesuaian marka PBA
Hasil amplifikasi DNA menggunakan PCR menunjukkan variasi jumlah alel pada masing-masing pasang primer (Gambar 1). Pasangan
primer CYP1A1F/CYP1A1R dan
CYP1A1F/heme2C19 merupakan pasangan primer PBA yang tidak menghasilkan pita pada tiap individu sehingga tidak dapat digunakan untuk mengidentifikasi keragaman genetik tanaman kunyit. Sementara itu, jumlah pita yang terampilifikasi menggunakan enam pasang primer PBA lainnya berjumlah 8 hingga 45 dengan jumlah total pita keseluruhan sebanyak 133, dan rata-rata
22,3 (Tabel 3). Pasangan primer
CYP2C19F/CYP2B6R mampu mengamplifikasi sikuen lebih banyak dibanding primer lainnya, sedangkan jumlah sekuen teramplifikasi paling sedikit dihasilkan oleh pasangan primer CYP2C19F/heme2B6.
Marka PBA mampu mengidentifikasi
banyak sikuen yang teramplifikasi pada tanaman kunyit. Jumlah sikuen yang dihasilkan pada penelitian ini lebih banyak bila dibandingkan dengan studi oleh Singh et al. (2012) yang
menggunakan marka Random Amplified
Polymorphic DNA (RAPD) dan marka Inter Simple Sequence Repeats (ISSR) terhadap 55 aksesi kunyit. Singh et al. (2012) melaporkan jumlah sikuen yang dihasilkan masing-masing terdiri atas 5–13 dan 8–11 pita. Semakin banyak jumlah pita
polimorfik, semakin tinggi pula keragaman genetiknya (Istiqomah et al. 2016). Tingginya jumlah fragmen yang teramplifikasi menunjukkan tingkat homologi yang tinggi terhadap berbagai protein yang ditemukan dan berkaitan dengan wilayah fungsional yang berbeda pada genom tanaman (Yamanaka et al. 2003).
Penggunaan marka PBA sebagai marka fungsional terhadap aksesi kunyit Indonesia menunjukkan nilai polimorfisme tinggi yaitu sebesar 100%. Hal ini sejalan dengan penelitian Wicaksana et al. ( 2011) yang menggunakan marka PBA pada Zingiber barbatum Wall. asal Myanmar yang menunjukkan persentase polimorfisme sebesar 92,15%. Persentase polimorfisme dengan marka PBA sebesar 94,58% ditemukan pada 12 aksesi temu manga, Curcuma amada asal Myanmar (Jatoi et al. 2010) dan pada galur hasil pemuliaan Moringa oleifera L. sebesar 86,44% (Kumar et al. 2017). Nilai polimorfisme tersebut memiliki kaitan dengan nilai PIC yang dihasilkan.
Nilai PIC menunjukkan tingkat kesesuaian marka yang digunakan berdasarkan tinggi rendahnya tingkat polimorfisme yang diperoleh. Nilai PIC di atas 0,90 menunjukkan bahwa marka sangat informatif untuk melihat perbedaan antar aksesi (Ismail et al. 2019; Botstein et al. 1980). Berdasarkan jumlah alel yang terdeteksi,
didapatkan nilai PIC sebesar 0,90
(CYP2C19F/heme2B6) hingga 0,98
(CYP2C19F/CYP1A1R) dengan rerata
No. Primer forward/reverse Forward (5’–3’) Reverse (5’–3’) Annealing
(oC)
1. CYP1A1F/heme2B6 GCC AAG CTT TCT AAC AAT GC
ACC AAG ACA AAT CCG
CTT CCC 56,0
2. CYP2C19F/CYP1A1R TCC TTG TGC TCT GTC TCT CA
AAG GAC ATG CTC TGA
CCA TT 56,0
3. CYP2C19F/heme2B6 TCC TTG TGC TCT GTC TCT CA
ACC AAG ACA AAT CCG
CTT CCC 56,0
4. CYP2C19F/heme2C19 TCC TTG TGC TCT GTC TCT CA
TCC CAC ACA AAT CCG
TTT TCC 56,0
5. CYP2B6F/CYP2B6R GAC TCT TGC TAC TCC TGG TT
CGA ATA CAG AGC TGA
TGA GT 52,0
6. CYP2C19F/CYP2B6R TCC TTG TGC TCT GTC TCT CA
CGA ATA CAG AGC TGA
TGA GT 52,0
7. CYP1A1F/CYP1A1R GCC AAG CTT TCT AAC AAT GC
AAG GAC ATG CTC TGA
CCA TT 56,0
8. CYP1A1F/heme2C19 GCC AAG CTT TCT AAC AAT GC
TCC CAC ACA AAT CCG
Tabel 3. Persentase polimorfisme dan nilai PIC 6 pasang primer PBA pada 64 aksesi kunyit
Table 3. Percentage of polimorphism and PIC value of 6 pairs of PBA primers on 64 turmeric accessions
No. Primer Jumlah fragmen
polimorfik
Polimorfisme (%)
Nilai
PIC Tingkat informatif
1 CYP1A1F/heme2B6 16 100 0,92 Tinggi 2 CYP2C19F/CYP1A1R 22 100 0,98 Tinggi 3 CYP2C19F/heme2B6 8 100 0,90 Tinggi 4 CYP2C19F/heme2C19 12 100 0,96 Tinggi 5 CYP2B6F/CYP2B6R 31 100 0,96 Tinggi 6 CYP2C19F/CYP2B6R Jumlah Rata-rata 45 134 22,3 100 100 0,91 0,94 Tinggi Tinggi
Keterangan: Nilai PIC > 0,5 = sangat informatif, 0,5 > PIC > 0,25 = cukup informatif, dan nilai PIC < 0,25 = sedikit informatif (Botstein et al. 1980)
Note: PIC value > 0.5 = very informative, 0.5 > PIC > 0.25 = fairly informative, and PIC value < 0.25 = less
informative (Botstein et al. 1980)
.
Gambar 1. Visualisasi DNA beberapa aksesi kunyit pada beberapa primer PBA (a) CYP1A1F/ CYP1A1R, (b) CYP2C19/heme2C19, dan (c) CYP2B6F/CYP2B6R. Pita polimorfik ditunjukkan dengan tanda panah berwarna putih.
Figure 1. DNA visualisation of several turmeric accessions on several PBA primers (a) CYP1A1F/ CYP1A1R, (b)
CYP2C19/heme2C19, dan (c) CYP2B6F/CYP2B6R. Polymorphic bands were marked with the white arrow.
200 bp 100 bp 300 bp 200 bp 100 bp 300 bp 100 bp 300 bp 200 bp
Jaccard Coefficient 0.01 0.08 0.14 0.20 0.27 0.33 0.39 0.46 0.52 0.58 0.64 0.71 0.77 0.83 CL-JBR01 CL-JBR02 CL-JBR07 CL-JT M06 CL-JT M07 CL-SSL02 CL-JBR11 CL-SSL01 CL-MLK04 CL-SLT 04 CL-KBB03 CL-NT B03 CL-BKL01 CL-SLU01 CL-MUT 01 CL-LMP04 CL-SMB01 T 2 T 1 T 3 CL-LMP02 CL-JBR06 CL-JBR13 CL-JT G04 CL-JT M02 CL-SUT 01 CL-BT N01 CL-SUT 02 CL-JBR16 CL-JBR12 CL-NAD03 CL-SUT 03 CL-PAP03 CL-KLB01 CL-SLS01 CL-SLT 01 CL-PPB08 CL-PPB09 CL-JBR14 CL-JBR08 CL-PPB12 CL-SSL04 CL-NAD01 CL-SLS02 CL-KBB01 CL-KLT 02 CL-BAL1 CL-KBB02 CL-JMB01 CL-KBB04 CL-KBB05 CL-BT N02 CL-KT G01 CL-ST G01 CL-ST G02 CL-SLS04 CL-MLK01 CL-YOG01 CL-PAP01 CL-NT B01 CL-PPB04 CL-PPB01 CL-PPB05 CL-GT L01 0,94 (Tabel 3). Nilai tersebut lebih tinggi bila
dibandingkan dengan penelitian Singh et al. (2018) yang menggunakan marka SSR pada aksesi kunyit dengan nilai PIC berkisar dari 0,43 hingga 0,67. Tingginya nilai polimorfik memiliki kaitan dengan
ukuran genom, persilangan alami, dan
heterozigositas spesies (Pan et al. 2017). Hasil analisis nilai PIC menunjukkan bahwa enam pasang primer PBA sangat informatif dan dapat digunakan untuk mengidentifikasi keragaman genetik pada tanaman kunyit.
Analisis kekerabatan dan keragaman genetik Kekerabatan 64 aksesi kunyit asal Indonesia dianalisis menggunakan analisis kluster UPGMA dengan koefisian Jaccard. Hasil analisis berupa
dendrogram yang menunjukkan kekerabatan
genetik antar aksesi kunyit menggunakan marka PBA. Analisis klaster tersebut menunjukkan kelompok yang terbentuk berada pada jarak genetik 0,01 hingga 0,83 atau dengan tingkat kemiripan 1–83% (Gambar 2). Aksesi CL-PPB04 yang berasal dari Papua Barat dan CL-NTB01 dari Nusa Tenggara Barat memiliki tingkat kemiripan yang tinggi dengan koefisien kemiripan sebesar 83%, diikuti oleh aksesi CL-JBR07 dari Jawa Barat dan aksesi CL-JTM06 dari Jawa Timur dengan koefisien kemiripan 0,75 atau sama dengan 75%. Menurut Singh et al. (2018) rentang klaster
aksesi kunyit yang berada pada rentang 0,44 – 1,00 mengindikasikan adanya keragaman. Sementara pada penelitian Verma et al. (2015), jarak genetik 30 genotip kunyit yang berada pada rentang 0,03– 0,59 menunjukkan cukup beragam. Pada penelitian ini, jarak genetik pada klaster sangat bervariasi terutama jarak koefisien kemiripan di atas 0,45 yang menunjukkan keragaman yang luas.
Koefisien kemiripan pada rentang jarak 0,01–0,83 mengindikasikan tingkat keragaman genetik yang luas pada aksesi kunyit. Hal ini sejalan dengan penelitian Ismail et al. (2019) pada temulawak yang menunjukkan bahwa tingkat keragaman temulawak berdasarkan marka PBA sangat luas dengan tingkat kemiripan pada rentang 0,00–0,83. Penelitian Wicaksana et al. ( 2011) menunjukkan keragaman genetik yang luas pada Zingiber barbatum Wall, berdasarkan analisis marka morfologi dan marka molekuler PBA dengan rentang koefisien kemiripan genetik Jaccard 0,21–0,97. Informasi keragaman genetik yang didapatkan sangat penting untuk dasar strategi konservasi, pemanfaatan, dan kegiatan pemuliaan tanaman (Li et al. 2011). Luasnya keragaman pada aksesi kunyit tersebut mendukung ketersediaan materi genetik bagi proses pemuliaan kunyit dan mampu meningkatkan kemajuan seleksi terhadap karakter yang diinginkan pemulia.
Gambar 2. Dendrogram 64 aksesi kunyit asal Indonesia berdasarkan marka PBA menggunakan koefisien kemiripan Jaccard
Figure 2. Dendrogram of 64 turmeric accessions from Indonesia based on PBA markers using Jaccard similarity
Nilai polimorfisme serta keragaman yang dihasilkan mengindikasikan keragaman genetik yang luas antar aksesi kunyit di Indonesia. Keragaman pada tanaman yang diperbanyak secara vegetatif dapat disebabkan oleh adanya mutasi alami yang mengakibatkan perubahan susunan genom tanaman. Hal tersebut dipengaruhi oleh penyebaran geografis yang diikuti dengan proses mutasi dan seleksi (Ravindran et al. 1994). Penyebaran kunyit di Asia Selatan dan Asia Tenggara memiliki kaitan dengan keragamaan di bawah pengaruh agama Hindu pada masa Post-Arya (Sasikumar 2005) dan jalur perdagangan. Proses penyebaran kunyit tersebut membuat kunyit perlu melakukan adaptasi dengan lingkungan tumbuhnya yang menyebabkan adanya akumulasi mutasi spontan dalam proses evolusi genetik. Klon tanaman yang diperbanyak secara vegetatif yang semakin lama menghadapi berbagai cekaman lingkungan dapat mengakumulasi mutasi dan berpotensi menimbulkan adanya mutasi somatik (Pelsy 2010). Menurut Jiang dan Ramachandran (2010) tingkat mutasi pada tanaman sangat rendah pada rentang 10-5 hingga 10-8. Oleh karena itu, dapat disimpulkan bahwa aksesi kunyit yang ada hingga saat ini merupakan aksesi yang sudah beradaptasi dengan kondisi lingkungan.
Hasil analisis klaster mengelompokkan 64 aksesi kunyit ke dalam dua klasterutama pada nilai koefisien 0,01 (Tabel 4). Kelompok pertama terdiri atas 63 aksesi dan terbagi ke dalam tiga subklaster yaitu subklaster I, subklaster II, dan subklaster III dengan nilai koefisien kemiripan 0,13. Subklaster I terdiri atas 10 aksesi pada rentang koefisien kemiripan 0,12–0,75. Subklaster II terdiri atas 47
aksesi dengan koefisien kemiripan 0,13–0,74. Subklaster III terdiri atas 6 aksesi pada rentang koefisien kemiripan 0,22–0,8. Sementara pada klaster II hanya terdiri atas satu aksesi yaitu CL-GTL01 yang berasal dari Gorontalo dengan koefisien kemiripan 0,02 dengan subklaster lainnya. Berdasarkan scoring pita DNA, aksesi CL-GTL01 menunjukkan pola pita DNA yang sangat berbeda, sehingga pada analisis klaster terpisah dari aksesi lainnya.
Dendrogram tidak menunjukkan adanya variasi yang didasarkan pada lokasi geografis asal kunyit. Aksesi-aksesi yang berada pada satu subklaster merupakan aksesi yang berasal dari provinsi yang berbeda. Spesies jahe liar yang diteliti oleh Wicaksana et al. ( 2011) juga menunjukkan tidak adanya hubungan yang signifikan antara aksesi Zingiber barbatum dengan wilayah asal koleksinya di Myanmar. Hal tersebut dapat terjadi karena plasma nutfah berasal dari daerah yang sama dan ditransfer di dalam maupun ke luar provinsi (Shen et al. 2010). Beberapa aksesi kunyit diperoleh dari daerah perbatasan antar provinsi sehingga ada kemungkinan berbagai aksesi mengelompok pada klaster yang sama. Secara morfologi tidak ditemukan kemiripan sifat tertentu yang membedakan sifat antar aksesi kunyit dalam satu klaster sehingga perlu dilakukan penelitian lanjutan mengenai mekanisme genetik yang terjadi dan diperlukan analisis korelasi antara keragaman genetik dengan marka molekuler dan marka morfologi Menurut Balloux et al. ( 2003) tanaman tanaman yang diperbanyak secara vegetatif dapat mengalami variasi di tingkat alel
Tabel 4. Pengelompokan aksesi kunyit pada klaster dendrogram berdasarkan metode UPGMA menggunakan penanda PBA
Table 4. Dendogram cluster of turmeric accessions grouping based on UPGMA method using PBA markers
Klaster Subklaster Aksesi
I I JBR01, JBR02, JBR07, JTM06, JTM07, SSL02, CL-JBR11, CL-SSL01, CL-MLK04, CL-SLT04
I II
CL-KBB03, CL-NTB03, CL-BKL01, CL-SLU01, CL-MUT01, CL-LMP04, CL-SMB01, Turina 2, Turina 1, Turina 3, CL-LMP02, CL-JBR06, CL-JBR13, JTG04, JTM02, SUT01, BTN01, SUT02, JBR16, JBR12, NAD03, SUT03, PAP03, KLB01, SLS01, SLT01, PPB08, PPB09, JBR14, JBR08, PPB12, SSL04, NAD01, SLS02, KBB01, KLT02, BAL01, KBB02, JMB01, KBB04, KBB05, BTN02, KTG01, CL-STG01, CL-STG02, CL-SLS04
I III MLK01, YOG01, PAP01, NTB01, PPB04, PPB01, CL-PPB05
pada lokus spesifik akibat adanya mutasi alami. Meskipun demikian, jika mutasi somatik terjadi pada fase pertumbuhan tanaman, maka tidak akan
memberikan pengaruh terhadap penampilan
fenotip (Pelsy 2010). Secara keseluruhan, kunyit yang berasal dari provinsi di Indonesia memiliki keragaman genetik yang luas yang dipengaruhi oleh mutasi disebabkan adanya adaptasi dengan lingkungan tumbuh.
KESIMPULAN
Marka PBA merupakan marka yang sangat informatif dalam mendeteksi keragaman aksesi kunyit pada tingkat gen dengan nilai poliformisme 100% dan PIC lebih dari 0,9, dan sesuai untuk mengidentifikasi keragaman kunyit. Aksesi kunyit memiliki keragaman yang luas yang terdistribusi pada klaster dengan koefisien kemiripan 0,02 hingga 0,83. Koefisien keragaman tersebut menunjukkan adanya kemungkinan mutasi alami pada tanaman kunyit akibat pola penyebaran secara geografis. Kunyit yang berasal dari daerah yang sama cenderung menyebar dan mengelompok dengan aksesi yang berasal dari daerah yang lain. Informasi terkait keragaman aksesi kunyit pada penelitian ini berguna untuk pengembangan varietas unggul dan konservasi sumberdaya genetik kunyit Indonesia.
TERIMA KASIH
Ucapan terima kasih disampaikan kepada Sensient Colors LLC, St. Louis, Missouri, Amerika yang memberikan dukungan dana untuk penelitian.
DAFTAR PUSTAKA
Balloux, F., Lehmann, L. & De Meeus, T. (2003) The Population Genetics of Clonal and Partially Clonal Diploids. Genetics. 164 (4), 1635–1644.
Basir, L., Kalhori, S., Zare Javid, A. & Khaneh Masjedi, M. (2018) Anticaries Activity of Curcumin on Decay Process in Human Tooth Enamel Samples (In Vitro Study).
Journal of the National Medical
Association. 110 (5), Elsevier Inc, 486–490. Botstein, D., White, R.L., Skolnick, M. & Davis,
R.W. (1980) Construction of a Genetic Linkage Map in Man Using Restriction Fragment Length Polymorphisms. American
journal of Human Genetics. 32 (3), Elsevier, 314.
Dolkar, R., Kumar, P., Girigowda, M. & Pallavi, H.M. (2019) Assessment of Genetic Diversity in Advance Breeding Lines of Chilli (Capsicum annuum L.) Using RAPD and Cytochrome P450 Gene Based Marker system. 7 (2), 1656–1663.
Govindaraj, M., Vetriventhan, M. & Srinivasan, M. (2015) Importance of Genetic Diversity Assessment in Crop Plants and Its Recent Advances : An Overview of Its Analytical Perspectives. 2015 (Figure 1).
Greule, A., Stok, J.E., De Voss, J.J. & Cryle, M.J. (2018) Unrivalled Diversity: The Many
Roles and Reactions of Bacterial
Cytochromes P450 in Secondary
Metabolism. Natural Product Reports. Royal Society of Chemistry. 35 (8), 757– 791. doi:10.1039/c7np00063d.
Ishita, C. & Khaushik, B. (2004) Turmeric and Curcumin: Biological Actions and Medical Applications. Current Science. 87 (1), 44– 53. doi:10.2307/24107978.
Ismail, N.A., Rafii, M.Y., Mahmud, T.M.M., Hanafi, M.M. & Miah, G. (2019) Genetic Diversity of Torch Ginger (Etlingera elatior) Germplasm Revealed by ISSR and
SSR Markers. BioMed Research
International. doi:10.1155/2019/5904804. Istiqomah, C.R.P., Pancasakti, H. & Kusdiyantini,
E. (2016) Keragaman Genetik Jahe
(Zingiber officinale Roscoe) menggunakan
Teknik Penanda Molekuler Random
Amplified Polymorphic DNA (RAPD). Jurnal Biologi. 5 (2), 87–97.
Jatoi, S.A., Kikuchi, A., Ahmad, D. & Watanabe, K.N. (2010) Characterization of The Genetic Structure of Mango Ginger (Curcuma amada Roxb.) from Myanmar in Farm and Genebank Collection by The Neutral and Functional Genomic Markers. Electronic Journal of Biotechnology. 13 (6), 1–11. doi:10.2225/vol13-issue6-fulltext-10.
Javed, M., Upadhayaya, S.K. & Malik, V. (2016) Cultivation, Harvesting and Quantitative Analysis in Curcuma longa. European Journal of Pharmaceutical and Medical Research. 3 (3), 423–425.
Jiang, S.Y. & Ramachandran, S. (2010) Natural and Artificial Mutants as Valuable Resources for Functional Genomics and
Molecular Breeding. International Journal of Biological Sciences. 6 (3), 228–251. doi:10.7150/ijbs.6.228.
Kim, Y. & Clifton, P. (2018) Curcumin, Cardiometabolic Health and Dementia. International Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (10), 2093. Kumar, A. & Kaur, V. (2010) Characterisation and
Evaluation of PGR : Principles and Techniques. In: Division of Germplasm Evaluation, ICAR-NBPGR, New Delhi. pp.139–145.
Kumar, P., Dolkar, R., Manjunatha, G. & Pallavi, H.M. (2017) Molecular Fingerprinting and Assessment of Genetic Variations Among Advanced Breeding Lines of Moringa oleifera L. by Using Seed Protein, RAPD and Cytochrome P450 Based Markers. South African Journal of Botany. 111, SAAB, 60– 67. doi:10.1016/j.sajb.2017.03.024.
Kuntorini, E.M. (2005) Botani Ekonomi Suku Zingiberaceae sebagai Obat Tradisional oleh Masyarakat di Kotamadya Banjarbaru. Bioscientiae. 2 (1), 25–36.
Li, G., Ra, W.H., Park, J.W., Kwon, S.W., Lee, J.H., Park, C.B. & Park, Y.J. (2011) Developing EST-SSR Markers to Study
Molecular Diversity in Liriope and
Ophiopogon. Biochemical Systematics and Ecology. 39 (4–6), Elsevier Ltd, 241–252. doi:10.1016/j.bse.2011.08.012.
Moeljopawiro, S. (2016) Marka Mikrosatelit sebagai Alternatif Uji BUSS dalam Perlindungan Varietas Tanamam Padi. Buletin Plasma Nutfah. 16 (1), 1. doi:10.21082/blpn.v16n1.2010.p1-7.
Pan, L., Fu, J., Zhang, R., Qin, Y., Lu, F., Jia, L., Hu, Q., Liu, C., Huang, L. & Liang, G.
(2017) Genetic Diversity Among
Germplasms of Pitaya Based on SSR Markers. Scientia Horticulturae. 225, 171– 176. doi:10.1016/j.scienta.2017.06.053. Pelsy, F. (2010) Molecular and Cellular
Mechanisms of Diversity Within Grapevine Varieties. Heredity. 104, Nature Publishing Group, 331–340. doi:10.1038/hdy.2009.161. Promega (2017) Technical Manuarl Wizard®
Genomic DNA Purification Kit. Promega
Corporation. USA, pp.1–18.
doi:10.1007/978-3-642-58362-9_35.
Ravindran, P.N., Babu, K.N. & Shiva, K.N. (2007)
Botany and Crop Improvement of Turmeric. In: Ravindran, P.N., Babu, N. & Sivaraman (eds.) Turmeric The Genus Curcuma. Medicinal. 45, India, CRC Press, pp.15–70. doi:10.1017/CBO9781107415324.004. Ravindran, P.N., Sasikumar, B., George, J.K.,
Ratnambal, M.J. & Babu, K.N. (1994) Genetic Resources of Ginger (Zingiber officinale Rosc.) and Its Conservation in India. Plant Genetic Resources Newsletter. Rohlf, F.J. (2000) NTSYSpc Numerical Taxonomy
and Multivariate Analysis System. New York, Applied Biostatistics Inc.
Sanghamitra, N., Sujata, M. & Nagar, K. (2015) Differential Effect of Soil and Environment on Metabolic Expression of Turmeric (Curcuma longa cv. Roma). Indian Journal of Experimental Biology. 53, 406–411. Sari, A.R.K., Rahmah, F.A. & Djauhari, S. (2020)
Effectiveness of Nonessential Compounds
from Curcuma spp. on Reducing
Anthracnose Disease of Chilli Pepper Fruit.
Buletin Littro. 31 (1), 21–30.
doi:10.21082/bullittro.v31n1.2020.21-30 Sasikumar, B. (2005) Genetic Resources of
Curcuma: Diversity, Characterization and Utilization. Plant Genetic Resources. 3 (2), 230–251. doi:10.1079/pgr200574.
Selvan, T.M. & Thomas, K.G. (2002) Turmeric. In: Production and Utilization Proceedings,
National Consultative Meeting for
Accelerated Production and Export of Spices. Indian Spi. Cochin, Coconut Development Board, pp.97–109.
Senan, S., Kizhakayil, D., Sheeja, T.E., Sasikumar, B., Bhat, A.I. & Parthasarathy, V.A. (2013) Novel Polymorphic Microsatellite Markers
from Turmeric, Curcuma longa L.
(Zingiberaceae). Acta Botanica Croatica. 72 (2), 407–412. doi:10.2478/botcro-2013-0002.
Shabana, M.H., Shahy, E.M., Taha, M.M., Mahdy,
G.M. & Mahmoud, M.H. (2015)
Phytoconstituents from Curcuma longa L.
Aqueous Ethanol Extract and Its
Immunomodulatory Effect on Diabetic Infected Rats. Egyptian Pharmaceutical Journal. 14 (1), 36.
Shakeri, A., Cicero, A.F.G., Panahi, Y., Mohajeri, M. & Sahebkar, A. (2018) Curcumin: A Naturally Occurring Autophagy Modulator. Journal of Cellular Physiology. 234,
5643-5654. doi:10.1002/jcp.27404.
Shameem, M.U.S. & Ferdous, R. (2009) An efficient K-Means Algorithm Integrated with Jaccard Distance Measure for
Document Clustering. First Asian
Himalayas International Conferenceon Internet. 1–6.
Shen, J., Jia, X., Ni, H., Sun, P., Niu, S. & Chen, X. (2010) AFLP Analysis of Genetic Diversity of Jatropha curcas Grown in Hainan, China. Trees - Structure and
Function. 24 (3), 455–462.
doi:10.1007/s00468-010-0413-1.
Singh, A.K., Nanda, P., Singh, A. & Singh, B. (2015) Genetic Diversity Analysis in Turmeric (Curcuma longa L.) Based on SSR Markers. Journal of Biological Engineering Research and Review. 2 (1), 20–24.
Singh, S., Panda, M.K. & Nayak, S. (2012) Evaluation of Genetic Diversity in Turmeric (Curcuma longa L.) Using RAPD and ISSR Markers. Industrial Crops and Products. 37
(1), Elsevier B.V., 284–291.
doi:10.1016/j.indcrop.2011.12.022.
Singh, T.J., Patel, R.K., Patel, S.N. & Patel, P.A. (2018) Molecular Diversity Analysis in Turmeric (Curcuma longa L.) Using SSR
Markers. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 7 (11), 552–560.
Verma, S., Singh, S., Sharma, S., Tewari, S.K., Roy, R.K., Goel, A.K. & Rana, T.S. (2015) Assessment of Genetic Diversity in Indigenous Turmeric (Curcuma longa) Germplasm from India Using Molecular Markers. Physiology and Molecular Biology
of Plants. 21 (2), 233–242.
doi:10.1007/s12298-015-0286-2.
Wicaksana, N., Gilani, S.A., Ahmad, D., Kikuchi, A. & Watanabe, K.N. (2011) Morphological
and Molecular Characterization of
Underutilized Medicinal Wild Ginger (Zingiber barbatum Wall.) from Myanmar. Plant Genetic Resources: Characterization
and Utilization. 9 (4), 531–542.
doi:10.1017/S1479262111000840.
Yamanaka, S., Suzuki, E., Tanaka, M., Takeda, Y., Watanabe, J.A. & Watanabe, K.N. (2003) Assessment of Cytochrome P450 Sequences Offers a Useful Tool for Determining Genetic Diversity in Higher Plant Species. Theoretical and Applied Genetics. 108, 1–9. doi:10.1007/s00122-003-1403-0.
