PROFIL GENETIK Escherichia coli YANG DIISOLASI DARI TEMPE INDONESIA BERDASARKAN ENTEROBACTERIAL
REPETITIVE INTERGENIC CONSENSUS-POLYMERASE CHAIN REACTION (ERIC-PCR)
QURROTA A’YUN
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR 2015
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Profil Genetik Escherichia coli yang Diisolasi dari Tempe Indonesia Berdasarkan Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus-Polymerase Chain Reaction (ERIC-PCR) adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.
Bogor, Maret 2015 Qurrota A’yun NIM G351120371
RINGKASAN
QURROTA A’YUN. Profil Genetik Escherichia coli yang Diisolasi dari Tempe Indonesia Berdasarkan Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus- Polymerase Chain Reaction (ERIC-PCR). Dibimbing oleh ANTONIUS SUWANTO dan TATI BARUS.
Tempe merupakan makanan tradisional Indonesia yang berasal dari fermentasi kacang-kacangan terutama kedelai yang diinokulasi menggunakan kapang Rhizopus sp. (Babu et al. 2009). Pembuatan tempe dilakukan dengan cara yang sangat bervariasi oleh para pengrajin dan umumnya pada kondisi yang tidak terkontrol. Kondisi yang tidak higienis mengakibatkan tumbuhnya Escherichia coli yang dikenal sebagai bakteri indikator kebersihan lingkungan. Keberadaan E. coli pada tempe sebelumnya telah dilaporkan oleh Barus et al. (2008). E. coli patogen dapat menimbulkan sindrom klinis, yaitu gastroenteritis akut pada anak-anak dan infeksi saluran pencernaan. E. coli pada tempe kemungkinan berbeda dengan E. coli patogen pada manusia. Perbedaan genetika dapat mempengaruhi karakteristik E. coli, terutama dalam hubungannya dengan bidang medis. Analisis molekuler berdasarkan sifat genotipik penting dilakukan untuk melakukan identifikasi dan karakterisasi, mempelajari evolusi serta epidemiologi tentang patogenitas dari suatu bakteri (Rademarker dan de Bruijn 1997). Salah satu teknik molekuler yang dilakukan adalah menggunakan Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus–Polymerase Chain Reaction (ERIC-PCR). Tujuan dari penelitian ini adalah untuk membandingkan keragaman genetik E. coli pada tempe dengan isolat medis dengan menggunakan metode ERIC-PCR.
Sampel tempe diambil dari 4 pengrajin tempe di Bogor, yaitu tempe EMP, DRG, WJB dan CLR (singkatan nama lokasi pengrajin tempe). Isolasi E. coli dari tempe dilakukan dengan metode pengenceran bertingkat 10-2 sampai 10-5 dan disebar ke dalam media Eosin Methylene Blue (EMB) kemudian diuji dengan media Simmon Sitrat Agar (SCA). DNA genom E. coli diisolasi menggunakan Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide (CTAB) (Sambrook dan Russel 2001) selanjutnya gen 16S rRNA E. coli diamplifikasi menggunakan primer 63f dan 1387r (Marchesi et al. 1998). Hasil amplifikasi dari produk PCR disekuensing dan dianalisis menggunakan software MEGA 5.2. Sekuen ERIC E. coli diamplifikasi menggunakan primer ERIC 1R dan ERIC 2 (Versalovic et al. 1991) dan profil fragmen diinterpretasikan menjadi matriks data biner untuk pembuatan pohon filogenetik dengan menggunakan program MEGA 5.2. Konstruksi pohon filogenetik menggunakan metode Unweighted Pair Groups Method Analysis (UPGMA).
Sebanyak 33 isolat E. coli berhasil diisolasi dari tempe. Hanya 2 dari 4 tempe yang mengandung E. coli yaitu 2 isolat dari tempe CLR dan 31 isolat dari tempe EMP. Hal ini membuktikan bahwa keberadaan E. coli tidak selalu ditemukan pada sampel tempe Amplifikasi Gen 16S rRNA 33 isolat E. coli menghasilkan pita DNA berukuran sekitar 1.3 kb. Hasil pensejajaran sekuen pada database di GenBank NCBI menggunakan program BLASTN menunjukkan bahwa 33 isolat dari tempe merupakan E. coli dengan persentase kemiripan 96%-100% dengan E- value 0.0.
Visualisasi profil ERIC-PCR menunjukkan bahwa pola pita isolat E. coli dari tempe berbeda dengan isolat medis. Pola pita yang sering muncul pada isolat E. coli dari tempe, yaitu pita yang terletak diantara marker 0.25 kb dan 1.0 kb.
Sedangkan pola pita yang sering muncul pada E. coli isolat medis tidak konsisten.
Jumlah fragmen DNA isolat E. coli yang teramplifikasi berkisar antara 4 sampai 13 pita dengan ukuran 0.25 kb sampai 5.0 kb.
Analisis profil ERIC-PCR menunjukkan bahwa 2 isolat E. coli dari tempe CLR memiliki pola fragmen yang sama sedangkan 31 isolat E. coli dari tempe EMP memiliki pola yang beragam. Isolat E. coli dari tempe CLR tidak menunjukkan adanya keragaman genetik dan isolat tersebut memiliki kekerabatan dengan beberapa isolat E. coli dari tempe EMP sehingga tergabung dalam satu grup yang sama. Berbeda dengan isolat E. coli dari tempe CLR, isolat E. coli dari tempe EMP menunjukkan adanya keragaman genetik. Pola hubungan kekerabatan isolat E. coli dari tempe EMP ada yang berkerabat dekat namun ada pula yang berkerabat jauh.
Hasil analisis pohon filogenetik menunjukkan bahwa E. coli dari tempe membentuk grup tersendiri dan terpisah dengan grup isolat medis dan E. coli DH5α.
Hasil pengulangan analisis ERIC-PCR menunjukkan bahwa perbedaan genetik E. coli dari tempe dengan isolat medis konsisten berbeda. Berdasarkan pohon filogenetik, isolat dari tempe membentuk 2 grup yang terpisah dengan isolat medis dan E. coli DH5α. Hasil ini mengindikasikan bahwa keberadaan E. coli pada tempe tidak sama dengan E. coli medis.
Kata Kunci: Escherichia coli, ERIC-PCR, tempe.
SUMMARY
QURROTA A’YUN. Genetic Profiles of Escherichia coli Isolated from Indonesian Tempeh Based on Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus-Polymerase Chain Reaction (ERIC-PCR). Supervised by ANTONIUS SUWANTO dan TATI BARUS.
Tempeh is a famous Indonesian fermented food derived from soybeans inoculated with Rhizopus sp. (Babu et al. 2009). Tempeh production varies depend on the producers and often conducted in an uncontroled condition. This condition could lead to the growth of Escherichia coli which is known as bacterial indicators of environmental hygiene. The presence of E. coli in tempeh have been reported by Barus et al. (2008). Pathogenic E.coli can create clinical symptoms i.e acute gastroenteritis in the kids or gastrointestinal tract infections. E. coli in human may differ with the E. coli pathogens in humans. Genetic differences may affect the characteristics of E. coli, particularly in relation to the medical field. Therefore, molecular analysis based on genotypic characteristics is important for the identification, characterization and to study evolution and epidemiology of the pathogenicity of the bacteria (Rademarker and de Bruijn 1997). One of molecular techniques used is Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus-Polymerase Chain Reaction (ERIC-PCR). The aim of this study was to compare genetic diversity of E. coli isolates from tempeh with medical isolates employing ERIC- PCR method.
Tempeh samples taken in EMP, DRG, WJB and CLR was produced in Bogor. Isolation of E. coli from tempeh used dilution was made from 10-2 until10-5 and spreaded on Eosin Methylene Blue (EMB) Agar then analyzed by cultivating them on Simmon’s Citrate Agar (SCA). Total DNA of E. coli from tempeh was extracted by Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide (CTAB) method (Sambrook and Russell 2001) further the amplification was using primer of 63f and 1387r (Marchesi et al. 1998). The result amplification of PCR product were sequenced and analyzed using software MEGA 5.2. ERIC sequence of E. coli was amplified using primer of ERIC 1R and ERIC 2 (Versalovic et al. 1991) and Band profiles were compared as binary data and analyzed using MEGA 5.2 software.
Phylogenetics tree constraction was using Unweighted Pair Groups Method Analysis (UPGMA).
A total of 33 isolates of E. coli had been isolated from tempeh. Only two of four tempeh samples contained E. coli i.e. 2 isolates from CLR tempe and 21 isolates from EMP tempeh. This proves that the presence of E. coli not always found on tempeh samples. 16S rRNA genes amplification of 33 isolates of E. coli produced DNA band size of 1.3 kb. The comparison of sequence alignment result in the GenBank database using BLASTN program showed that 33 isolates from tempeh were E. coli with similarity percentage ranging from 96%-100% with E- value 0.0.
Visualization of the ERIC-PCR profiles shows that band pattern E. coli from tempeh different with medical isolates. Banding pattern that often appears in E. coli isolates from tempeh, which is located between marker 0.25 kb and 1.0 kb.
While the banding pattern that often appears in E. coli isolates inconsistent medical.
The number isolates of E. coli DNA fragments were amplified ranged from 4 to 13 with a size of 0.25 kb to 5.0 kb.
ERIC - PCR profile analysis showed that two isolates of E. coli from CLR tempeh has similar pattern, while 31 isolates of E. coli from EMP tempeh has a diverse pattern. Isolates of E. coli from CLR tempeh did not showed genetic diversity and them have have a close related with isolates of EMP tempeh and clustered similar group. In contrast to E. coli isolates from CLR tempeh, E. coli isolates from EMP tempeh indicate genetic diversity. relationship patterns of E. coli isolates from EMP tempeh closely related but some are only distantly related. The results of the phylogenetic tree analysis showed that E. coli from tempeh formed a separate group with medical isolates and E. coli DH5α.
Results repetition ERIC -PCR analysis showed that the genetic diversity of E. coli isolates from tempeh with medical isolates consistent different. Based on the phylogenetic tree, E. coli from tempeh could be separated two groups with medical isolates and E. coli DH5α . These results indicate that the presence of E. coli in tempeh different with medical isolates.
Keywords: ERIC-PCR, Escherichia coli, tempeh
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015 Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains
pada
Program Studi Teknologi Industri Pertanian
PROFIL GENETIK Escherichia coli YANG DIISOLASI DARI TEMPE INDONESIA BERDASARKAN ENTEROBACTERIAL
REPETITIVE INTERGENIC CONSENSUS-POLYMERASE CHAIN REACTION (ERIC-PCR)
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR 2015
QURROTA A’YUN
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis:
Judul Tesis : Profil Genetik Escherichia coli yang Diisolai dari Tempe Indonesia Berdasarkan Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus- Polymerase Chain Reaction (ERIC-PCR)
Nama : Qurrota A’yun NIM : G351120371
Disetujui oleh Komisi Pembimbing
Prof Antonius Suwanto PhD Ketua
Dr Ir Tati Barus MSi Anggota
Diketahui oleh
Ketua Program Studi Mikrobiologi
Prof Dr Anja Meryandini, MS
Dekan Sekolah Pascasarjana
Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr
Tanggal Ujian: Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Desember 2013 hingga September 2014 ini berjudul
“Profil Genetik Escherichia coli yang Diisolasi dari Tempe Indonesia Berdasarkan Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus-Polymerase Chain Reaction (ERIC-PCR)”.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Prof Antonius Suwanto PhD dan Ibu Dr Ir Tati Barus MSi selaku pembimbing yang telah memberikan nasehat, saran, motivasi, serta solusi dari setiap permasalahan yang penulis hadapi selama penelitian dan penyusunan karya ilmiah ini. Selain itu, penulis ucapkan terima kasih kepada penguji luar komisi yang telah memberikan saran dalam penyusunan karya ilmiah ini sehingga menjadi lebih baik. Kepada Lembaga Pengelola Dana Pendidikan (LPDP) melalui beasiswa tesis terima kasih atas kepercayaannya untuk memberikan beasiswa kepada penulis dan terima kasih atas sebagian dari dana DIPA IPB 2014 a.n. Prof Antonius Suwanto sehingga penelitian yang penulis lakukan dapat terlaksana dengan baik.
Penulis juga ingin menyampaikan terima kasih kepada Ibu Dr Susan soka yang telah membantu mengurus segala keperluan di Laboratorium. Seluruh staf teknisi di Laboratorium Unika Atma Jaya terutama untuk mas bambang, mas Dahrul, kang Ridwan dan mas Tri terima kasih telah membantu penulis selama melakukan penelitian serta ucapan terima kasih kepada Ibu Tatik, Lekta T, Evelin dan Cidy sebagai partner selama penelitian. Ucapan terima kasih penulis sampaikan juga kepada Bapak Jaka (staf Laboratorium Mikrobiologi), sahabat-sahabat tersayang Nezharia, Mahyarudin, Allia N, Anja A, Dina F, Anik K, Novi A, Kak Heni S, Hamtini, Cici Nuryanti S, Ira E, Mona P, Wulan S, Rika F, M Asril, dan mbak Nina Ginting terima kasih atas bantuan, saran, motivasi, serta solusi yang telah diberikan kepada penulis. Ucapan terimakasih penulis sampaikan kepada Kak Listya U, Kak Sipri, dan Kak Sari atas pengalaman dan ilmu yang telah diberikan.
Kepada teman-teman Pascasarjana Mikrobiologi IPB 2012 terima kasih atas kebersamaan yang singkat dan sangat indah. Ungkapan terima kasih yang tak terhingga juga penulis ucapkan kepada orang tua tercinta Bapak Saunin, Ibu Hariroh, adik-adik tersayang, seluruh keluarga besar, serta teman-teman di bimbel BINAR atas segala doa, dukungan, motivasi dan kasih sayangnya selama ini.
Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi kemajuan ilmu pengetahuan selanjutnya.
Bogor, Maret 2015 Qurrota A’yun
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL vi
DAFTAR GAMBAR vi
DAFTAR LAMPIRAN vi
PENDAHULUAN 1
Latar Belakang 1
Perumusan Masalah 2
Tujuan Penelitian 2
Manfaat Penelitian 2
TINJAUAN PUSTAKA 3
Tempe 3
Escherichia coli 4
Identifikasi Gen Penyandi 16S rRNA 4
Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus-Polymerase Chain
Reaction (ERIC-PCR) 5
METODE 6
Kerangka Penelitian 6
Waktu dan Tempat Penelitian 6
Bahan 7
Isolasi E. coli dari Tempe 7
Isolasi DNA Genom E. coli 7
Amplifikasi Gen Penyandi 16S rRNA E. coli 8
Sekuensing Gen 16S rRNA E. coli 8
Analisis Profil Genetik dengan Sekuen ERIC-PCR 8
Konstruksi Pohon Filogeni 9
HASIL DAN PEMBAHASAN 9
Hasil 9
Pembahasan 14
SIMPULAN DAN SARAN 16
Simpulan 16
Saran 17
DAFTAR PUSTAKA 17
RIWAYAT HIDUP 21
DAFTAR TABEL
1 Tabel Frekuensi keberadaan E. coli pada tempe segar 10
2 Tabel Hasil BLASTN sekuen E. coli asal tempe 11
DAFTAR GAMBAR
1 Tahapan kerja penelitian 6
2 (A) Isolat E. coli pada media EMB Agar 10
(B) Isolat E. coli pada media Simmon Sitrat 10
3 Hasil amplifikasi gen 16S rRNA E. coli dari tempe 11 4 Profil genetik ERIC-PCR isolat E. coli dari tempe dan isolat medis 12 5 Pohon filogenetik dari analisis ERIC-PCR E. coli menggunakan metode
UPGMA melalui program MEGA 5.2. dengan bootstrap 1000x 13
6 (A) Profil genetik ERIC-PCR E. coli 14
(B) Pohon filogenetik isolat E. coli menggunakan metode UPGMA melalui
program MEGA 5.2. dengan bootstrap 1000x 14
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tempe dikenal sebagai makanan tradisional Indonesia yang terbuat dari kedelai dan difermentasi oleh kapang Rhizopus sp. Tempe mengandung nutrisi, vitamin, fitokimia, antioksidan, sumber vitamin B12 (Keuth dan Bisping 1994;
Astuti et al. 2000), asam lemak esensial (Utari 2010) serta senyawa isoflavon (Haron et al. 2009). Beberapa laporan menyatakan bahwa tempe memiliki banyak manfaat bagi kesehatan diantaranya dapat menangkal radikal bebas (Utari 2010), menurunkan resiko penyakit hati dan stroke, osteoporosis, kanker dan menopause (Babu et al. 2009).
Pembuatan tempe dilakukan dengan cara yang sangat bervariasi oleh para pengrajin, dan umumnya pada kondisi yang tidak terkontrol. Proses pembuatan tempe melibatkan tiga faktor pendukung, yaitu bahan baku yang dipakai, mikroorganisme, dan keadaan lingkungan. Keberadaan Rhizopus pada tempe berperan sebagai kapang yang menyediakan substrat bagi bakteri dalam mensintesis komponen cita rasa dan komponen nutrisi lain (Seumahu 2012).
Beberapa bakteri telah diketahui berperan dalam meningkatkan kualitas tempe, seperti Citrobacter freundii dan Klebsiella pneumoniae (Keuth dan Bisping 1994), Lactobacillus reuteri (Taranto et al. 2003) Bacillus sp. (Barus et al. 2008), dan bakteri asam laktat (Efriwati et al. 2013). Selain itu, pada tempe ditemukan juga bakteri kelompok Enterobacteria yang didominasi oleh bakteri yang berwarna hijau metalik. Bakteri tersebut diduga adalah Escherichia coli (Barus et al. 2008).
Kondisi yang tidak higienis mengakibatkan tumbuhnya E. coli yang dikenal sebagai bakteri indikator kebersihan lingkungan yang kemungkinan juga mengandung mikroorganisme enterik patogen lainnya (Clesceri et al. 1998).
Secara normal E. coli terdapat pada saluran pencernaan baik manusia maupun hewan, tetapi bakteri ini juga mempunyai peran cukup penting dalam penyakit zoonosis yang disebarkan melalui makanan. E. coli patogen dapat menimbulkan sindrom klinis, yaitu gastroenteritis akut pada anak-anak dan infeksi saluran pencernaan. E. coli memiliki banyak faktor virulensi. Serotipe E. coli patogen yakni E. coli O157:H7 pernah ditemukan pada daging sapi (Suardana et al.
2007), dan VTEC (Verotoxigenic E. coli) juga pernah ditemukan pada susu dari peternakan (Suwito 2009).
Perbedaan genetika dapat mempengaruhi karakteristik E. coli, terutama dalam hubungannya dengan bidang medis. Oleh karena itu, analisis molekuler berdasarkan sifat genotipik penting dilakukan untuk melakukan identifikasi dan karakterisasi, mempelajari evolusi serta epidemiologi tentang patogenitas dari suatu bakteri (Rademarker dan de Bruijn 1997). Salah satu teknik molekuler yang dilakukan dalam penelitian ini adalah menggunakan ERIC-PCR (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus–Polymerase Chain Reaction). ERIC-PCR merupakan metode amplifikasi DNA menggunakan sekuen ERIC. Sekuen ERIC merupakan sekuen pendek (126 bp) dengan area ulangan yang lestari dan di area non-coding yakni sekuen yang tidak dikodekan menjadi protein (Lupski dan
2
Weinstock 1992), dan biasanya terdapat pada bakteri yang termasuk dalam famili Enterobacteriaceae. Teknik ini digunakan karena sederhana, cepat, reproducible, diskriminatif (Olive dan Bean 1999). Metode ERIC-PCR telah berhasil menganalisis keragaman berbagai bakteri seperti Lactobacillus (Stephenson et al.
2009), Vibrio cholerae (Waturangi et al. 2012) dan Klebsiella sp. (Barus et al.
2013).
Perumusan Masalah
Teknik pembuatan tempe yang dilakukan oleh para pengrajin di Indonesia masih sangat sederhana dan dalam kondisi yang tidak terkontrol. Proses pembuatan tempe tradisional belum memiliki standar pengolahan yang higienis sehingga memungkinkan tumbuhnya E. coli. Keberadaan E. coli pada makanan memiliki peran dalam penyebaran penyakit mengingat bakteri tersebut memiliki banyak faktor virulensi. Oleh karena itu, diperlukan adanya perhatian dalam segi keamanan pangan. Perbedaan genetik pada E. coli menentukan karakteristik E. coli terutama dalam bidang medis.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk membandingan profil genetik E. coli dari tempe dengan E. coli medis berdasarkan sekuen ERIC-PCR.
Manfaat Penelitian
Manfaat penelitian ini adalah sebagai informasi bahwa genetik E. coli pada tempe berbeda dengan E. coli medis serta memberikan informasi tentang keamanan pangan untuk kontrol kualitas lingkungan pada saat pengolahan tempe.
Ruang Lingkup Penelitian
Penelitian meliputi pengambilan sampel dan isolasi E. coli dari media EMB, isolasi DNA genom E. coli, amplifikasi gen 16S rRNA dan analisis profil genetik E. coli dengan sekuen ERIC-PCR dan konstruksi pohon filogenetik.
3
TINJAUAN PUSTAKA
Tempe
Tempe didefinisikan sebagai suatu massa hasil fermentasi kapang dengan bahan baku biji-bijian yang terikat bersama oleh miselium kapang tersebut. Tempe sudah dikenal berabad-abad lalu dan pertama kali dibuat oleh masyarakat Jawa Tengah sekitar tahun 1700-an (Astuti et al. 2000). Kata tempe sudah ditemukan sejak tahun 1660-an di dalam Serat Centhini yang berasal dari Jawa kuno dan disebutkan sebagai hidangan bernama jae santen tempe (sejenis masakan tempe dengan santan) dan kadhele tempe srundengan.
Tempe mengandung komponen antioksidan seperti isoflavon, vitamin E dan β-karoten. Komponen Isoflavon pada tempe juga berkontribusi pada ekspresi gen.
(Rimbach et al. 2008). Gamma-asam aminobutirat juga diproduksi selama proses fermentasi dan senyawa ini mempunyai efek farmakologis dalam tubuh manusia (Aoki et al. 2003). Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Ghozali et al.
(2010) menyatakan bahwa pemberian tempe berpengaruh positif terhadap penurunan gula darah dan kecepatan kesembuhan luka pada tikus yang terkena diabetes.
Di Indonesia tempe dibuat secara tradisional pada skala industri kecil (industri rumah tangga). Pembuatan tempe dilakukan dengan cara yang sangat bervariasi oleh para pengrajin, yang berkembang secara turun temurun dan berubah karena pengalaman. Daerah yang berbeda memiliki proses pengolahan tempe yang sangat berbeda dengan urutan proses yang berbeda juga (Barus 2008). Meskipun cara pengolahan tempe setiap produsen berbeda tetapi pada dasarnya mempunyai prinsip dasar yang sama, yaitu persiapan dan fermentasi. Modifikasi yang dilakukan adalah lama perendaman, frekuensi perebusan, lama perebusan, penambahan cuka, penggilingan, pemakaian kembali kulit ari kedelai, jenis inokulum, lama fermentasi, dan tipe pengemasan (Utari 2010).
Fermentasi tempe merupakan fermentasi kultur padat yang melibatkan kapang, bakteri, dan khamir meliputi perendaman, perebusan, dan penginokulasian ragi (Garbutt 1997; Denter et al. 1998). Selama proses fermentasi, terjadi beberapa hal yang menguntungkan pada tempe. Hal ini dapat dilihat dari meningkatnya komposisi nutrisi, terjadinya pemecahan protein dan asam amino yang tinggi, serta mengandung antinutrien (Nurrahman et al. 2013). Menurut Nout dan Kiers (2005) fermentasi pada tempe dapat meningkatkan kualitas nilai gizi dan karakter organoleptik.
Mikroorganisme yang berperan selama proses pembuatan tempe adalah golongan Rhizopus spp. Pemberian genus Rhizopus pada tempe diberikan dalam bentuk yang telah diformulasikan menjadi laru/ragi/usar/inokulum atau starter (Efriwati 2013). Kebanyakan produsen tempe di Indonesia memilih menggunakan inokulum yang tumbuh pada daun yang mengandung spora Rhizopus sp. (Nout dan Kiers 2005). Selain itu, bakteri telah diketahui ikut berperan dalam meningkatkan kualitas tempe dan kelimpahannya tinggi sejak awal hingga akhir proses pembuatan tempe (Barus 2008).
4
Escherichia coli
E. coli merupakan bakteri fekal dari famili Enterobacteriaceae. Bakteri ini berbentuk batang dengan panjang 0.4-0.7 µm, lebar 1-3 µm, bersifat gram negatif dan dapat berupa satu individu maupun berpasangan (Gyles et al. 2010; Songer dan Post 2005). E. coli bersifat anaerob fakultatif, memfermentasikan laktosa, sorbitol, dan menghasilkan gas. Pada umumnya E. coli merupakan flora normal dalam saluran pencernaan hewan dan manusia. Namun, pada tahun 1953 ditemukan strain E. coli yang patogen dan menyebabkan wabah diare pada bayi (Todar 2008). Galur- galur E. coli tertentu mampu menyebabkan gastroenteritis taraf sedang hingga parah pada manusia dan hewan. Kehadiran E. coli di usus manusia dan feses dapat digunakan sebagai indikasi terjadinya kontaminasi pada air, produk peternakan, dan produk pertanian (Todar 2008).
E. coli patogen memiliki virulensi dan mekanisme patogenik yang berbeda serta inang yang spesifik. Galur E. coli yang menyerang manusia diklasifikasikan ke dalam 5 grup yaitu Enteropathogenic E. coli (EPEC), Enterotoxigenic E. coli (ETEC), Enterohemorrhagic E. coli (EHEC), Enteroaggregative E. coli (EAEC) dan Enteroinvasive E. coli (EIEC) (Nataro dan Kaper 1998).
ETEC dapat menimbulkan diare seperti Vibrio cholera yang aktif melekat pada mukosa usus kecil melalui permukaan fimbriae (pili tipe 1 dan antigen faktor kolonisasi) dan memproduksi satu atau dua enterotoksin, yaitu heat-labile toxin (LT) dan heat-stable toxin (ST). EPEC dapat menyebabkan penyakit perut. EHEC mengeluarkan toksin yang disebabkan edema dan pendarahan difus di kolon dan dapat menimbulkan sindrom hemolitik oremik. Permulaan penyakit ini ditandai kejang yang akut dan diare cair yang cepat menjadi berdarah. EAEC menyebabkan diare berair pada anak -anak dan dapat berlanjut menjadi diare persisten. EIEC dapat menimbulkan demam, perut kram berlendir dan berdarah seperti disentri.
Klasifikasi serotipe E. coli dibagi berdasarkan: (1) lipopolisakarida somatik (O) bersifat tahan panas atau termostabil dan terdiri dari lipopolisakarida yang mengandung glukosamin dan terdapat pada dinding sel bakteri gram negatif.
(2) flagelar (H) merupakan alat pergerakan bakteri, bersifat tidak tahan panas atau termolabil dan akan rusak pada suhu 100 oC, dan (3) kapsulas (antigen K) terdapat pada permukaan luar bakteri berfungsi untuk pertahanan diri. Komponen berupa polisakarida dan akan rusak pada suhu 100 oC selama 1 jam (Nataro dan Kaper 1998).
Identifikasi Gen Penyandi 16S rRNA
Pendekatan yang digunakan untuk mengklasifikasi dan mengidentifikasi mikroba berbasis filogenetik adalah analisis sekuen gen 16S rRNA (Case et al.
2007). Ribosomal RNA (r-RNA) merupakan salah satu makromolekul paling menarik karena molekul ini merupakan kerangka dari ribosom yang sangat berperan dalam mekanisme translasi. Semua rRNA identik secara fungsional yakni terlibat dalam produksi protein. Meski demikian, sekuen dibagian-bagian tertentu terus berevolusi dan mengalami perubahan pada level struktur primer sambil tetap mempertahankan struktur sekunder dan tersier yang homologus (Schluenzen et al.
5 2000). Gen 16S rRNA terdapat pada semua prokariot (Madigan et al. 1997) memiliki ukuran panjang antara 1.5–1.55 kb dan kaya akan basa nitrogen guanin dan sitosin dan tersusun atas daerah variabel dan konservatif (Clarridge 2004).
Sekuen gen 16S-rRNA selanjutnya dapat digunakan untuk menduga sifat-sifat organisme yang belum dapat dikulturkan, mengidentifikasi model untuk kultivasi (dari kerabat dekat), sintetis pelacak oligonukleotida untuk tujuan identifikasi, pemisahan morfologi, fisik, deteksi pertumbuhan spesifik dalam kultur campuran, memantau distribusinya di alam dan mengevaluasi laju pertumbuhan relative in situ; dan survey keragaman hayati dengan cepat dan komprehensif. Alasan praktis pemakaian rRNA adalah ketersediaan bagi umum untuk dapat mengakses database.
Dasar penggunaan gen 16S rRNA diantaranya; (1) bersifat universal:
protein synthesis machinery, (2) sekuen basa-basanya bersifat konservatif, (3) jumlahnya melimpah dalam sel, (4) memenuhi ukuran untuk perhitungan secara statistika (tidak terlalu panjang dan terlalu pendek), (5) ketersediaan informasi (data bank/database di GenBank) (Madigan et al. 1997). Proses amplifikasi gen 16S rRNA dapat dilakukan melalui teknik PCR. Terdapat beberapa primer universal yang umum digunakan untuk mengamplifikasi gen 16S rRNA bakteri, diantaranya 23f dan 24f serta 1392r dan 1492r (penomoran primer mengikuti konsensus sekuen 16S rRNA E. coli). Marchesi et al. (1998) mendesain dan mengevaluasi primer 63f dan 1387r untuk amplifikasi gen 16S-rRNA dari domain bakteri. Pasangan primer ini mampu mengamplifikasi gen 16S rRNA dengan ukuran sekitar 1.3 kb.
Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus–
Polymerase Chain Reaction (ERIC-PCR)
ERIC-PCR merupakan metode analisis keragaman berbasis PCR dengan cara mengamplifikasi DNA menggunakan sekuen ERIC. ERIC-PCR pertama kali ditemukan oleh Versalovic pada E.coli dan Salmonella typhimurium. Sekuen ERIC merupakan sekuen pendek (126 bp) dengan area ulangan yang conserve dan di area non-coding yakni sekuen yang tidak dikodekan menjadi protein (Lupski dan Weinstock 1992). Primer yang digunakan dirancang untuk mengidentifikasi wilayah ERIC yang lestari dalam rangka untuk menghasilkan pola pita berdasarkan frekuensi dan orientasi urutan ERIC dalam genom bakteri (Meacham et al. 2003).
Sekuen ERIC biasa terdapat pada bakteri golongan Enterobacteria, dapat ditemukan pada spesies bakteri, seperti Proteus mirabilis, K. pneumoniae, Vibrio cholerae, Rhizobium meliloti, Bifidobacterium sp., Aeromonas sp., bahkan bakteri gram positif, seperti Staphylococcus sp. dan Streptococcus sp. (Versalovic et al. 1991; de brujin 1992; Ventura et al. 2003; Szczuka dan Kaznowski 2003). Primer ERIC- PCR yang digunakan bersifat spesifik, serta biasa digunakan untuk DNA fingerprinting. Chuzcik et al. (2003) telah mengevaluasi pasangan primer ERIC1 dan ERIC2, dan pasangan primer tersebut mampu mengamplifikasi sekuen E. coli asal air.
ERIC-PCR telah digunakan untuk membedakan profil intraspesies beberapa bakteri, diantaranya: Sinorhizium meliloti (Niemann et al. 1999), Lactobacillus (Stephenson et al. 2009), V. cholerae (Waturangi et al.2012), Klebseilla sp. (Barus et al. 2013), serta mampu membedakan secara diskriminatif profil DNA Bacillus anthracis dan B. cereus (Shangkuang et al. 2000).
6
METODE
Kerangka Penelitian
Tahapan kerja yang dilakukan dalam penelitian ini, secara singkat disajikan pada Gambar 1 dibawah ini.
Gambar 1 Tahapan kerja penelitian
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilakukan mulai bulan Desember 2013 sampai September 2014 bertempat di Laboratorium Riset Fakultas Teknobiologi Universitas Katolik Atma Jaya Jakarta.
Pengambilan sampel tempe segar
Isolasi E. coli pada media EMB
Isolasi DNA Genom E. coli
Sekuensing Gen 16S rRNA E. coli
Analisis Profil Genetik dengan Sekuen ERIC-PCR
Konstruksi pohon filogenetik Amplifikasi gen 16S rRNA E. coli
Pensejajaran hasil sekuensing pada database di GenBank
7 Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini ialah sampel tempe segar, isolat E. coli dari tempe, isolat medis yaitu E. coli ATCC 25922 (koleksi Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia, Jakarta), E. coli O157 (koleksi Departemen Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Atma Jaya, Jakarta), dan EPEC K.1.1 (koleksi Laboratorium Mikrobiologi Institut Pertanian Bogor, Bogor) dan E. coli DH5α sebagai kontrol positif (koleksi Fakultas Teknobiologi Universitas Katolik Atma Jaya, Jakarta).
Isolasi E. coli dari Tempe
Sampel tempe diambil dari empat pengrajin tempe di Bogor, yaitu tempe EMP, DRG, WJB dan CLR (singkatan nama lokasi pengrajin tempe). Pengambilan sampel dilakukan sebanyak empat kali pengulangan dari bulan Desember 2013- Maret 2014.
Sebanyak 10 g tempe segar dihomogenkan ke dalam 90 mL larutan garam fisiologis 0.85% (NaCl). Pengenceran dilakukan dari 10-1 sampai 10-5 dan 100 µL dari pengenceran 10-2 sampai 10-5 disebar ke dalam media Eosin Methylene Blue (EMB) (Oxoid) dan diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam. Koloni dengan ciri hijau metalik dimurnikan pada media EMB dengan metode kuadran. Koloni tersebut kemudian diuji dengan media Simmon Sitrat Agar (SCA) (Difco) dan diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam. Selanjutnya, isolat disimpan pada media Nutrient Agar (NA) (Oxoid) untuk dianalisis lebih lanjut.
Isolasi DNA Genom E. coli
DNA genom diisolasi dengan metode Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide (CTAB) (Sambrook dan Russel 2001). Kultur E. coli ditumbuhkan pada media Luria Broth (LB) (Lennox) selama 16 jam pada suhu 37 oC dalam shaker dengan kecepatan 120 rpm. Sebanyak 1.5 mL kultur bakteri dipindahkan ke dalam tube dan disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm selama 2 menit (dilakukan 2x).
Supernatan dibuang dan pellet ditambahkan sebanyak 500 µL 1x Tris-EDTA (TE).
Setelah proses pemanenan sel dilakukan, selanjutnya adalah proses pelisisan dinding sel bakteri yaitu sebanyak 50 µL lisozim (50 µg/mL) ditambahkan kedalam tube lalu dibolak-balik sampai keruh. Kemudian diinkubasi pada suhu 37 oC selama 60 menit. Sebanyak 50 µL SDS 10% dan 10 µL Proteinase-K (10 µg/mL) ditambahkan kedalam tube. Diinkubasi kembali pada suhu 37 oC selama 60 menit (sampai bening).
Sebanyak 100 μL NaCl 5M dan 100 μL CTAB 10% ditambahkan dan dibolak-balik hingga memperlihatkan warna putih susu dan diinkubasi pada suhu 65 oC selama 20 menit. Sebanyak 500 µL Phenol Chloroform Isoamylalcohol (P:C:I) (25:24:1) ditambahkan ke dalam tube, dibolak-balik lalu disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit, dan akan terbentuk dua lapisan. Lapisan bagian atas yang bening diambil 500 μL dan dimasukkan ke tube baru dan ditambahkan sebanyak 500 μL larutan Chloroform Isoamyl alcohol (C:I) (24:1),
8
kemudian disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit. Sebanyak 300 µL lapisan atas diambil dan dipindahkan ke tube baru. Kemudian ditambahkan sebanyak 400 µL etanol absolut dingin, dibolak-balik perlahan dan diinkubasi pada suhu -20 oC selama 10 menit. Disentrifugasi kembali pada kecepatan 10.000 rpm selama 2 menit, supernatan dibuang kemudian pellet ditambahkan sebanyak 1 mL etanol 70% dan dibolak-balik perlahan untuk pencucian dan disentrifugasi cepat, supernatan dibuang dan dikeringudarakan. Pellet yang dihasilkan diresuspensi dengan 50 µL 1x TE.
Genom dikuantifikasi menggunakan elektroforesis pada gel agarosa 1%.
Sebanyak 5µL genom dicampur dengan 1 µL loading dye, dijalankan pada tegangan 80 volt selama 45 menit. Setelah itu, pita genom yang terbentuk diamati dengan pewarnaan Ethidium bromide dan dilihat dibawah UV transiluminator untuk didokumentasikan.
Amplifikasi Gen Penyandi 16S rRNA E. coli
Amplifikasi gen penyandi 16S rRNA menggunakan primer 63f (5’CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC-3’) dan primer 1387r (5’-CCC GGG AAC GTA TTC ACC GC-3’) Marchesi et al. (1998). Total volume PCR yang digunakan adalah 50 µL, setiap tabung terdiri atas 25 µL GoTaq Green® Master Mix (Promega), 2 µL primr forward dan reverse (25 pmol/µL-1), 19 µL nucleas free water dan 1 µL cetakan DNA. Kondisi PCR sebagai berikut: pre-denaturasi 94 oC selama 5 menit, denaturasi 94 oC selama 30 detik, annealing primer 55 oC selama 30 detik, elongasi 72 oC selama 1 menit, dan post PCR pada suhu 72 oC selama 20 menit. Penghentian reaksi dilakukan dengan penurunan suhu ke 4 oC dan PCR berlangsung sebanyak 35 siklus.
Hasil PCR dielektroforesis dengan gel agarosa 1% dalam buffer 1x Tris Asetat EDTA (TAE) pada 80 volt selama 60 menit. Selanjutnya, pita-pita DNA hasil isolasi dilihat dibawah UV transluminator (UVB 36 ultralum, Carson,California).
Sekuensing Gen 16S rRNA E. coli
Produk PCR dikirim ke Perusahaan Jasa Sekuensing First Base Sequensing INT, Malaysia dan dianalisis menggunakan program MEGA 5.2. Hasil sekuensing disejajarkan pada database dengan program Basic Local Alignment Search Tool Nucleotide (BLASTN) yang tersedia pada situs National Center for Biotechnology Information (NCBI) melalui website (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST.
Analisis Profil Genetik dengan Sekuen ERIC-PCR
Sekuen ERIC E. coli diamplifikasi menggunakan primer ERIC 1R (5’- ATG TAA GCT CCT GGG GAT TCAC-3’), dan primer ERIC 2 (5’-AAG TAA GTG ACT GGG GTG AGCG-3’) (Versalovic et al. 1991). Total volume PCR yang digunakan adalah 25 µL. Setiap tabung terdiri atas 12.5 µL GoTaq Green® Master Mix (Promega), 2 µL primer forward dan reverse (25 pmol/µL) 9.5 µL nuclease free water, dan 1 µL cetakan DNA. Kondisi PCR sebagai berikut: Pre-PCR 95 oC
9 selama 7 menit, denaturasi 95 oC selama 30 detik, annealing 49 oC selama 1 menit, elongasi 65 oC selama 8 menit, post PCR 65 oC selama 16 menit serta penyimpanan pada suhu 4 oC. Proses PCR berlangsung sebanyak 30 siklus. Sebanyak 3 µL hasil amplifikasi PCR diverifikasi dengan elektroforesis gel agarosa 1.5% dalam buffer 1x TAE pada 113 volt selama 120 menit.
Konstruksi Pohon Filogeni
Profil fragmen hasil amplifikasi ERIC-PCR diinterpretasikan menjadi matriks data biner dan dijadikan input untuk pembuatan pohon filogenetik dengan menggunakan program MEGA 5.2. Konstruksi pohon filogenetik menggunakan metode Unweighted Pair Groups Method Analysis (UPGMA). Topologi dari konstruksi pohon filogenetik dievaluasi menggunakan analisis bootstrap dengan 1000 replikasi.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Identifikasi dan Frekuensi Keberadaan E. coli
Sebanyak 81 isolat yang diduga E. coli telah berhasil diisolasi dari tempe EMP, DRG dan CLR (Tabel 1). Isolat tersebut berwarna hijau metalik pada media EMB (Gambar 2A). Namun, setelah diuji lebih lanjut dengan media Simmon sitrat hanya 33 isolat yang menunjukkan positif E. coli yang ditandai dengan media berwarna hijau (Gambar 2B).
E. coli tidak selalu ditemukan pada sampel tempe. E. coli hanya ditemukan pada tempe EMP dan CLR dengan jumlah yang bervariasi pada empat kali pengambilan tempe dari produsen. E. coli ditemukan pada tempe EMP dari pengambilan sampel ke-2 sampai ke-4 dan satu kali ditemukan pada tempe CLR (Tabel 1).
Gen 16S rRNA 33 isolat E. coli telah berhasil diamplifikasi menggunakan primer 63f dan 1387r serta menghasilkan pita DNA berukuran sekitar 1.3 kb (Gambar 3). Hasil pensejajaran sekuen pada database di GenBank NCBI menggunakan program BLASTN menunjukkan bahwa 33 isolat tersebut merupakan E. coli dengan persentase kemiripan 96%-100% dengan E-value 0.0 (Tabel 2).
10
Gambar 2 Pertumbuhan E. coli pada media agar. (A) Isolat E. coli pada media EMB Agar. (B) Isolat E. coli pada media Simmon Sitrat Agar
Tabel 1 Frekuensi keberadaan E. coli pada tempe segar Sampel
tempe
Hari/Tanggal Pengambilan sampel
Sampling ke-
Media EMB (jumlah isolat)
Media Simmon Sitrat (jumlah isolat) EMP
Kamis/12 Des 2013 1 - -
Selasa/12 Jan 2014 2 20 17
Selasa/10 Feb 2014 3 12 11
Senin/ 4 Mar 2014 4 4 3
DRG
Kamis/12 Des 2013 1 23 -
Selasa/12 Jan 2014 2 - -
Selasa/10 Feb 2014 3 - -
Senin/ 4 Mar 2014 4 20 -
WJB
Kamis/12 Des 2013 1 - -
Senin/26 Jan 2014 2 - -
Selasa/24 Feb 2014 3 - -
Selasa/25 Mar 2014 4 - -
CLR
Kamis/12 Des 2013 1 - -
Senin/26 Jan 2014 2 - -
Selasa/24 Feb 2014 3 - -
Selasa/25 Mar 2014 4 2 2
Total isolat 81 33
(A) (B)
11
Gambar 3 Hasil amplifikasi gen 16S rRNA E. coli dari tempe. Marker (M), isolat dari tempe (C3.12a-E4.33a), kontrol negatif (K-), kontrol positif (K+).
Tabel 2 Hasil BLASTN sekuen E. coli asal tempe
Kode isolat Homologi No. akses
Identitas maksimum
(%)
E-value E2.13b, E2.34b,
E2.44a, E4.13a
Escherichia coli strain- JCM 1649
NR112558.1 100 0.0
C3.12a, C3.23a Escherichia coli strain- JCM 1649
NR112558.1 99 0.0
E2.14a, E2.53b, E2.63a, E2.73a, E4.33a
Escherichia coli strain- JCM 1649
NR112558.1 99 0.0
E2.23a, E4.43a Escherichia coli- NBRC- 102203
NR114042.1 99 0.0
E3.13b, E3.33a, E3.63a, E3.53a, E3.114a
Escherichia coli - O157:H7 str.Sakai
NR074891.1 99 0.0
E3.84a Escherichia coli - O157:H7 str.Sakai
NR074891.1 98 0.0
E2.14b, E2.43b, E2.73b, E2.83b, E2.34a
Escherichia coli strain- JCM 1649
NR112558.1 98 0.0
E3.94a Escherichia coli str.K- 12 substr.
NR102804.1 98 0.0
E2.13a, E2.53a Escherichia coli strain- JCM 1649
NR112558.1 97 0.0
E3.23b, E3.33b, E3.73a
Escherichia coli - O157:H7 str.Sakai
NR074891.1 97 0.0
E3.104a Escherichia coli - O157:H7 str.Sakai
NR074891.1 96 0.0
E2.33a, E2.83a Escherichia coli strain- JCM 1649
NR112558.1 96 0.0
12
Analisis Profil Genetik ERIC-PCR dan Konstruksi Pohon Filogeni
Sekuen ERIC 33 isolat E. coli dari tempe dan 3 isolat medis berhasil diamplifikasi menggunakan primer ERIC 1R dan ERIC 2 (Gambar 4). Visualisasi profil ERIC-PCR menunjukkan bahwa pola pita isolat E. coli dari tempe berbeda dengan isolat medis. Pola pita yang muncul pada isolat E. coli dari tempe, yaitu pita yang terletak diantara marker 0.25 kb dan 1.0 kb. Sedangkan pola pita yang muncul pada E. coli isolat medis tidak konsisten.
Profil ERIC-PCR isolat E. coli dari tempe CLR menunjukkan pola yang sama sedangkan isolat E. coli dari tempe EMP memiliki pola yang beragam (Gambar 4). Meskipun profil genetik isolat E. coli dari tempe EMP lebih beragam dari tempe CLR tidak ada profil genetik yang sama ketika isolat-isolat E. coli dari tempe tersebut dibandingkan dengan E. coli DH5α.
Gambar 4 Profil genetik ERIC-PCR isolat E. coli dari tempe dan isolat medis.
Marker (M), isolat dari tempe CLR (C3.12a, C3.23a), isolat dari tempe EMP (E2.13a-E4.33a), kontrol negatif (K-), E. coli DH5α (kontrol positif), E. coli ATCC 25922 (Medis 1), EPEC K.1.1 (Medis 2), E. coli O157 (Medis 3).
Berdasarkan pohon filogenetik profil ERIC-PCR menunjukkan hubungan antara E. coli dari tempe dengan E. coli medis (Gambar 3). Hasil ini menunjukkan bahwa E. coli dari tempe secara genetik berbeda dengan isolat medis sehingga berbeda grup. Hal ini dapat dilihat pada E. coli dari tempe membentuk grup tersendiri (Grup I-IV), sedangkan isolat medis membentuk Grup VI dan E. coli DH5α membentuk Grup V.
13
Gambar 5 Pohon filogenetik dari analisis ERIC-PCR E. coli menggunakan metode UPGMA melalui program MEGA 5.2 dengan 1000x bootstrap E. coli DH5α (kontrol positif), E. coli ATCC 25922 (Medis 1), EPEC K.1.1 (Medis 2), E. coli O157 (Medis 3). Grup (1-VI).
Sebanyak 18 isolat E. coli dari tempe (Gambar 5) dianalisis ulang menggunakan ERIC-PCR untuk lebih lanjut dibandingkan keragaman genetiknya dengan isolat medis. Hasil analisis ERIC-PCR menunjukkan bahwa perbedaan genetik E. coli dari tempe dengan isolat medis konsisten berbeda, meskipun dilakukan pengulangan dengan ERIC-PCR (Gambar 6A).
14
Gambar 6B menunjukkan hubungan kekerabatan isolat E. coli dari tempe dan isolat medis hasil pengulangan. Isolat dari tempe membentuk 2 grup yaitu Grup pertama (Grup III) terdiri atas 4 isolat dari tempe EMP (isolat E4.13a, E4.33a, E2.43b, E3.33a) dan 2 isolat dari tempe CLR (isolat C3.23a dan C3.12a). Grup kedua (Grup IV) terdiri atas 12 isolat dari tempe EMP (isolat E2.14a, E3.84a, E2.23a, E3.23b, E3.114a, E3.94a, E2.63a, E2.73a, E2.34a, E2.53b, E2.13a, E2.33a, E2.33a) sedangkan isolat medis membentuk Grup I dan E. coli DH5α membentuk Grup II.
Gambar 6 Hasil pengulangan analisis ERIC-PCR. (A) Profil genetik ERIC-PCR E.
coli. Isolat dari tempe CLR (C3.12a, C3.23a), isolat tempe EMP (E2.13a- E4.33a), E. coli ATCC 25922 (Medis 1), EPEC K.1.1 (Medis 2), E. coli O157 (Medis 3). K. pneumoniae (Outgroup). (B) Pohon filogenetik isolat E. coli menggunakan metode UPGMA melalui program MEGA 5.2 dengan 1000x bootstrap. Grup (I-IV).
Pembahasan
Isolasi isolat E. coli dari sampel tempe dilakukan dengan penyebaran pengenceran bertingkat dari 10-2, 10-3, 10-4 dan 10-5 pada media EMB. Media EMB
(A) (B)
15 digunakan sebagai media selektif dan diferensial untuk membedakan bakteri dari kelompok Enterobacteriaceae. Media ini disebut sebagai media selektif karena mampu menghambat pertumbuhan bakteri gram positif seperti Staphylococcus spp.
dan diferensial karena mengandung eosin dan methylene blue serta laktosa yang berfungsi untuk membedakan mikroba yang memfermentasikan laktosa seperti S. aureus, Pseudomonas aerugenosa, dan Salmonella. Mikroba yang memfermentasi laktosa menghasilkan koloni dengan inti berwarna gelap dengan kilap logam. Sedangkan mikroba lain yang dapat tumbuh koloninya tidak berwarna.
Hal ini terjadi karena adanya penurunan pH media yang menyerap indikator sehingga warna koloni menjadi hijau metalik (Madigan dan Martinko 2006).
Setelah diuji dengan media Simmon sitrat hanya 33 isolat yang menunjukkan positif E. coli yang ditandai dengan media berwarna hijau (Gambar 2B). Hasil ini menunjukkan bahwa E. coli tidak menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon dan energi.
Keberadaan E. coli pada tempe sebelumnya telah dilaporkan oleh Barus et al. (2008). Keberadaan E. coli pada tempe bervariasi pada setiap pengambilan sampel ke-1-4 (Tabel 1). E. coli tidak selalu ditemukan pada keempat tempe ( EMP, DRG, WJB, dan CLR) meskipun pada sampel yang sama. E. coli pada tempe kemungkinan berasal dari berbagai sumber, misalnya berasal dari bahan baku, alat yang digunakan, orang yang terlibat dalam pengolahan, dan lingkungan sekitarnya.
Cara penyebaran E. coli dapat tejadi karena adanya kontaminasi silang secara langsung (melalui tangan) dan tidak langsung (melalui air) selama pengolahan (Antara dan Gunam 2002). Keberadaan E.coli pada makanan menunjukkan bahwa makanan tersebut tercemar kotoran akibat pengolahan dan kebersihan pengolah makanan yang kurang baik. E.coli merupakan bakteri patogen yang sering dijadikan indikator sanitasi (Githiri et al. 2009).
Pendekatan metode molekuler untuk mendeteksi keberadaan E. coli adalah dengan mengamplifikasi sekuens DNA yang mengkodekan gen 16S rRNA. E. coli diamplifikasi dengan menggunakan primer 63f dan 1387r. Selama proses amplifikasi berlangsung, primer 63f mulai mengamplifikasi cetakan DNA pada posisi basa 43-63, sedangkan primer 1387r mengamplifikasi DNA pada posisi 1387-1370 sehingga produk yang dihasilkan berukuran 1.3 kb (Marchesi et al.
1998). Sekuen gen 16S RNA digunakan sebagai penanda molekuler karena bersifat ubikuitis dengan fungsi yang identik pada seluruh organisme dan memiliki urutan basa yang relatif konservatif dan beberapa daerah urutan basanya variatif (Pangastuti 2006).
Analisis sifat virulensi dari suatu bakteri selain secara genetika dapat diketahui dari fenotipenya (Stenutz et al. 2006). Beberapa serotipe pada E. coli diketahui memiliki faktor virulensi diantaranya: serotipe O (somatik), serotipe H (flagella), dan serotipe K (kapsular) (Nataro & Kaper 1998). Serotipe O157: H7 adalah serotipe yang dapat menginduksi sekresi cairan tubuh secara berlebihan dan terus menerus sehingga terjadi diare dan dapat menyebabkan meningitis. E. coli O157 sebagai pembawa gen VT1 dan VT2 paling banyak ditemukan pada babi (Suardana et al. 2007). Namun, VT1 merupakan toksin yang relatif stabil terhadap panas yang apabila dilakukan pemanasan pada 80 oC selama 60 menit atau 85 oC selama 5 menit sama sekali menghilangkan aktivitas VT1 (Kittel et al. 1991).
Pada penelitian ini, fragmen multiple DNA semua strain E. coli yang di amplifikasi dengan primer ERIC berkisar antara 4-13 pita diantara ukuran 0.25 kb
16
dan 5 kb (Gambar 4). Hasil ini mengindikasikan luasnya keragaman genetik pada E. coli. Menurut Meacham (2003) perbandingan jumlah dan ukuran profil pita menunjukkan keragaman genetik isolat-isolat bakteri. Teknik ERIC-PCR menggunakan primer khusus untuk mengamplifikasi sekuen DNA yang berada diantara urutan ERIC yang berulang pada bakteri enterik gram negatif (Hulton et al. 1991).
Isolat E. coli dari tempe memiliki ciri morfologi yang sama dengan E. coli medis pada media EMB, namun dapat dilihat bahwa sifat genotipik isolat E. coli ini berbeda dengan E. coli medis (Gambar 4). Berdasarkan pohon filogenetik metode UPGMA (Gambar 5) menunjukkan bahwa isolat E. coli dari tempe membentuk grup yang terpisah dengan isolat medis. Isolat E. coli dari tempe CLR tidak menunjukkan adanya keragaman genetik dan isolat tersebut memiliki kekerabatan dengan beberapa isolat E. coli dari tempe EMP sehingga tergabung dalam Grup IV. Berbeda dengan isolat E. coli dari tempe CLR, isolat E. coli dari tempe EMP menunjukkan adanya keragaman genetik. Pola hubungan kekerabatan isolat E. coli dari tempe EMP ada yang berkerabat dekat namun ada pula yang berkerabat jauh. Hal ini menunjukkan bahwa keragaman isolat E. coli dari tempe EMP memiliki keragaman yang tinggi. Profil DNA yang sama (identik) dapat muncul dari isolat yang berasal dari tempe yang sama. Isolat yang berasal dari tempe yang sama ada yang berkerabat dekat, namun ada juga yang berkerabat jauh.
Teknik ERIC-PCR telah berhasil menjelaskan profil genetik E. coli dari tempe dan isolat medis dan bersifat diskriminatif dibandingkan dengan analisis gen 16S rRNA. Penelitian sebelumnya melaporkan bahwa ERIC-PCR telah berhasil mengamplifikasi sekuen ERIC Klebsiella spp. yang berasal dari tempe dan memperoleh hasil yang lebih diskriminatif dari sekuen 16S rRNA (Barus et al.
2013). Ayu et al. (2014) melaporkan bahwa ERIC-PCR juga mampu membedakan profil genetik isolat K. pneumoniae dari tempe dengan K. pneumoniae isolat medis.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Tidak semua tempe mengandung E. coli dan keberadaan E. coli pada tempe ditingkat produsen tidak selalu ditemukan pada setiap produksi. Berdasarkan analisis profil DNA genetik menggunakan ERIC-PCR terlihat bahwa E. coli dari tempe berbeda dengan E. coli patogen atau yang berasosiasi dengan isolat medis.
Saran
Hasil penemuan E. coli pada penelitian ini harus dikaji secara lebih mendalam (uji patogenesitas) dan perlu dikonfirmasi lebih lanjut mengingat banyaknya jenis E. coli yang bersifat patogen.
17
DAFTAR PUSTAKA
Antara S, Gunam IBW. 2002. Dunia Mikroba (Bahaya Mikrobiologis pada Makanan). Pusat Kajian Keamanan Pangan. Denpasar (ID): Universitas Udayana.
Aoki H, Uda I, Tagami K, Furuya Y, Endo Y, Fujimoto K. 2003. The production of a new tempe-like fermented soybean containing a high level of γ- aminobutyric acid by anaerobic incubation with Rhizopus. Biosci Biotechnol Biochem. 67: 1018–1023.
Astuti M, Meliala A, Dalais FS, Wahlqvist ML. 2000. Tempe, a nutritious healthy food from Indonesia. Asia Pac J Clin Nurt. 9(4):322-325.
Ayu E, Suwanto A, Barus T. 2014. Klebseilla pneumonia from indonesian tempeh were genetically different from that of phathogenic isolates. J Microbiol Indones. 8(1):9-15. doi: 10.5454/mi.8.1.2.
Babu PD, Bhakyaraj R, Vidhyalaksmi R. 2009. A low cost nutritious food “tempeh”.
World J Dairy food Sci. 4(1): 22-27.
Barus T, Suwanto A, Wahyudi AT, Wijaya H. 2008. Role of bacteria in tempe bitter taste formation; microbiological and molecular biological analysis based on 16S rRNA gene. J Microbiol Indones. 2(1):17-21.
Barus T, Hanjaya I, Sadeli J, Lay BW, Suwanto A, Yulandi A. 2013. Genetic diversity of Klebsiella spp. isolated from tempe based on enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction (ERIC-PCR).
Hayati J Biosci. 20(4):171-176. doi:10.4308/hjb.20.4.171.
Barus T. 2008. Peran komunitas bakteri dalam pembentukan rasa pahit pada tempe: analisis mikrobiologi dan terminal restriction fragment length polymorpism (T-RFLP). [disertasi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Buzby JC, Robert T, Jordan Lin CT, MacDonald JM. 1996. Bacterial Foodborne Disease, Medical Costs and Productivity Losses. Food and Consumer Economics Division, Economic Research Service, (US): Departement of Agriculture.
Case RJ, Boucher Y, Dahllof I, Holmstrom C, Doolittle WF, Kjelleberg S. 2007.
Use of 16S rRNA and rpoB genes as molecular markers for microbial ecology studies. Appl Environ Microbiol. 73(1):278–88.
Clarridge III JE. 2004. Impact of 16S rRNA gene sequence analysis for identification of bacteria on clinical microbiology and infectious diseases. J Clin Microbiol. 17:840-862.
Clesceri LS, Greenberg AE, Eat on AD. 1998. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 20th ed. Washington DC (US):
American Publ ic Health Associati on Washington DC.
Chudzik KB, Niedbach J, Stosik M. 2003. REP-PCR fingerprinting as a tool for the analysis of genomic diversity in Escherichia coli strains isolated from an aqueous/freshwater environment. Cell Mol Biol Lett. 8:793-798.
de Brujin FJ. 1992. Use of repetitive (repetitive extragenic poliandromic and enterobacterial repetitive intergenic consensus) sequence and the polymerase chain reaction to fingerprinting the genomes of Rhizobium meliloti isolates and other soil bacteria. Appl Environ Microbiol. 58:2180-2187.
18
Denter J, Rehm RJ, Bisping B. 1998. Changes in the contents of fat-soluble vitamins and provitamins during tempe fermentation. J Food Microbiol.
45:129-134.
Efriwati. 2013. Dinamika populasi dan keragaman bakteri asam laktat (BAL) dan khamir selama produksi tempe. [disertasi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Efriwati, Suwanto A, Rahayu G, Nuraida L. 2013. Population dynamics of yeasts and lactic acid bacteria (LAB) during tempeh production. Hayati J Biosci.
20(2):57-64. doi:10.4308/hjb.20.2.57.
Garbutt J. 1997. Essentials of Food Microbiology. London (GB): Arnold.
Githiri M, Okemo P, Kimiywe J. 2009. Hygienic Practices and Occurrence of Coliforms and Staphylococcus on Food at a Public Hospital in Kenya.. J Appl Biosci. 27: 1727-1731.
Ghozali DS, Handharyani E, Rimbawan. 2010. Pengaruh tempe terhadap kadar gula darah dan kesembuhan luka pada tikus diabetik. Cermin Dunia Kedokteran.
37(3):167-173.
Gyles CL, Prescott JF, Songer G, Thoen CO. 2010. Pathogenesis of Bacterial Infections in Animals, 4th ed. Iowa (US): Wiley-Blackwell.
Haron H, Ismail A, Azlan A, Shahar S, Loh Su Peng. 2009. Daidzein and genestein
contents in tempeh and selected soy products. Food Chem. 115:1350- 1356.doi:10.1016/j.foodchem. 2009.01.053.
Hulton CSJ, Higgins CF, Sharp PM. 1991. ERIC sequences: a novel family of repetitive elements in the genomes of Escherichia coli, Salmonella typhimurium and other enterobacteria. Mol Microbiol. 5:825-834.
Keuth S, Bisping B. 1994. Vitamin B12 production by Citrobacter freundii or Klebsiella pneumonia during tempeh fermentation and proof of enterotoxin absence by PCR. Appl Environ Microbiol. 60(5):1495-1499.
Kittel FB, Padhye VV, Doyle MP. 1991. Characterization and inactivation of verotoxin-1 produced by Escherichia coli O157:H7. J Agr Food Chem.
39:141-145.
Lupski JR, Weinstock GM. 1992. Short, interspersed repetitive DNA sequences in prokaryotic genomes. J Bacteriol. 174(14):4525–4529.
Madigan MT, Martinko JM, Parker J. 1997. Biology of Microorganisms. 8th ed.
New Jersey (US): Prentice-Hall.
Madigan MT, Martinko JM. 2006. Biology of Microoganism. 11thed . New Jersey (US): Prentice Hall
Marchesi JR, Sato T, Weihtman J, Martin TA, Fry JC, Hiom SJ, Wade WG. 1998.
Design and evaluation of useful bacterium-specific PCR primers that amplify genes coding bacterial 16S rRNA. Appl Envirol Microbiol. 64:795-799.
Meacham KJ, Zhang L, Foxman B. Bauer RJ, Mars CF. 2003. Evaluation of genotyping large numbers of Eschericia coli isolates by enterobacterial repetitive intergenic consensus-PCR. J Clin Microbiol. 41(11):5224- 5226.doi:10.1128/JCM.41.11.5224-5226.2003.
Nataro JP, Kaper JB. 1998. Diarrhegenic Escherichia coli. J Clin Microbiol.
11(2):142-201.
Niemann S, Dammann KT, Nagel A, Puhler A, Selbitscka W. 1999. Genetic basis of enterobacterial repetitive intergenic consensus (ERIC)-PCR fingerprint pattern in Sinorhizium meliloti and identification of S. meliloti employing
19 PCR primers derived from an ERIC-PCR fragment. Arch Microbiol. 172:22- 30.
Nout MJR, Kiers JL. 2005. Tempe fermentation, innovation, and functionality:
update into the third millenium. Appl Environ Microbiol. 98:789-805.
Nurrahman, Astuti M. Suparmo, Soesatyo MHNE. 2013. The role of black soybean tempe in increasing antioxidant enzyme activity and human lymphocyte proliferation in vivo. IJCMAS. 2(9):316-327.
Olive DM, Bean P. 1999. Principles and applications of methods for DNA-Based typing of microbial organisms. J Clin Microbiol. 37:1661-1669.
Pangastuti A. 2008. Analisis komunitas bakteri selama tahapan perkembangan larva udang putih (Litopenaeus vannamei).[tesis].Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Rademaker JLW, de Bruijn FJ. 1997. Characterization and Classification of Microbes by REP-PCR Genomic Fingerprinting and Computer Assisted Pattern Analysis,. DNA Markers: Protocols, Applications and Overviews.
New York (US): Wiley and Sons. hlm 151-171.
Rimbach G, Saadatmandi CB, Frank J, Fuchs D, Wenzel U, Daniel H, Hall WL, Weinberg PD. 2008. Dietary isoflavones in the prevention of cardiovascular disease-A molecular prespective. Food and Chem Toxicol. 46:1308-1319.
Sambrook J, Russell DW. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed, New York (US): Cold Spring Harbor Laboratory Pr.
Seumahu CA. 2012. Analisis metagenom untuk pencirian komunitas bakteri dan fungi pada tempe [disertasi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Schluenzen F, Tocilj A, Zarivach R, Harms J, Gluehmann M, Janell D, Bashan A, Bartels H, Agmon I, Franceschi F, et al. 2000. Structure of functionally activated small ribosomal subunit at 3.3 angstroms resolution. Cell.
102(5):615–23.
Shangkuan YH, Yang JF, Lin HC, Shaio MF. 2000. Comparison of PCR-RFLP, ribotyping and ERIC-PCR for typing Bacillus anthraci and Bacillus cereu strains. J Appl Microbiol. 89:452-462.
Songer JG, Post KW. 2005. Veterinary Microbiology: Bacterial and Fungal Agents of Animal Disease. St Louis (US): Elsevier Saunders Missouri.
Stenutz R, Weintraub A, Widmalm G. 2006. The structures of Escherichia coli O- polysaccharide antigens. FEMS Microbiol Rev. 30:382- 403.doi:10.1111/j.1574-6976.2006.00016.x
Stephenson DP, Moore RJ, Allison GE. 2009. Comparison and utilization of repetitive-element PCR techniques for typing Lactobacillus isolates from the chicken gastrointestinal tract. Appl Environ Microbiol. 75(21):6764-6776.
Suardana IW, Sumiarto B, Lukman DW. 2007. Isolasi dan identifikasi Escherichia coli 0157:H7 pada daging sapi di Kabupaten Badung Provinsi Bali. J Vet . 8(1):16-23.
Suwito W. 2009. Escherichia coli verotoksigenik (VTEC) yang diisolasi dari susu sapi. JITV. 14(3):237-243.
Szczuka E, Kaznowski A. 2003. Typing of clinical and environment Aeromonas sp.
strain by random amplified polymorphic DNA PCR, repetitive extragenic poliandromic PCR, enterobacterial repetitive intergenic consensus sequence PCR. J Clin Microbiol. 42:220-228.
20
Taranto MP, Vera JL, Hugenholtz J, De Valdez GF, Sesma F. 2003. Lactobacillus reuteri CRL1098 produces cobalamin. J Bacteriol. 185(18):5643-5647.
Todar K. 2008. Pathogenic Eschericia coli. Todar’s Online Textbook of Bacteriology University of Wisconsin-Madison Department of Bacteriology.
Tersedia pada: http://textbookofbacteriology.net/E. coli.html.
Utari DM. 2010. Kandungan asam lemak, zink, dan copper pada tempe, bagaimana potensinya untuk mencegah penyakit degeneratif?. Gizi Indon. 33(2):108-115.
Ventura M, Meylan V, Zink R. 2003. Identification and tracing of Bifidobacterium species by use of enterobacterial repetitive intergenic consensus sequences. J Appl Microbiol. 69(7): 4296-4301.doi: 10.1128/AEM.69.7.4296–4301.2003.
Versalovic J, Keuth T, Lupski JR. 1991. Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes. Nucleic Acids Res. 19(24):6823-6831. doi:10.1093/nar/19.24.6823.
Waturangi DE, Joanita I, Yogi Y, Thomas S. 2012. Use of REP- and ERIC-PCR to reveal genetic heterogeneity of Vibrio cholerae from edible ice in Jakarta, Indonesia. Gut Pathog. 4(2):1-9. doi:10.1186/1757-4749-4-2.
21
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 07 September 1986 sebagai anak pertama dari enam bersaudara, dengan ayah bernama Saunin dan ibu bernama Hariroh. Pada tahun 2004, penulis lulus dari MA Annur Bekasi dan pada tahun yang sama diterima di Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Islam As-Syafi’iyah (UIA), lulus pada tahun 2008. Pada tahun 2012, penulis diterima di Program Studi Mikrobiologi (MIK).
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains (M.Si), penulis melakukan penelitian dengan judul “Profil Genetik Escherichia coli yang Diisolasi dari Tempe Indonesia Berdasarkan Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus-Polymerase Chanin Reaction (ERIC-PCR). Penelitian Ini dibimbing oleh Prof. ANTONIUS SUWANTO Ph.D dan Dr. Ir. TATI BARUS M.Si. Artikel penelitian ini sedang dalam proses publikasi di jurnal Microbiology Indonesia.
