Tugas Makalah
Bioteknologi Molekuler
ANALISIS DNA DAN RNA DENGAN MENGGUNAKAN TEKNIK ELEKTROFERESIS GEL
DISUSUN OLEH KELOMPOK I:
M. ILHAM (H311 14 001) ELVA SIHAYA (H311 14 002) SRI RAMDANI (H311 14 006) RISMA ACHMAD (H311 14 007) FENTI SAMPE SIALLA’ (H311 14 012)
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS HASANUDDIN
KATA PENGANTAR
Puji syukur kami panjatkan kehadirat Allah SWT, yang atas rahmat-Nya sehingga kami dapat menyelesaikan penyusunan makalah yang berjudul “Analisis DNA Dan RNA Dengan Menggunakan Teknik Elektroferesis Gel”. penyusunan makalah ini merupakan salah satu tugas yang diberikan dalam mata kuliah Bioteknologi Molekuler di Departemen Kimia Fakultas Matematika Dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas hasanuddin.
Dalam penyusunan makalah ini kami merasa masih banyak kekurangan baik pada teknis penulisan maupun materi, mengingat akan kemampuan dimiliki. Untuk itu, kritik dan saran dari semua pihak sangat kami harapkan demi penyempurnaan pembuatan makalah ini.
Dalam penyusunn makalah ini kami menyampaikan ucapan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada pihak-pihak yang membantu menyelesaikan makalah ini.
Makassar, 17 Oktober 2017
DAFTAR ISI
2.1 Pengertian DNA dan RNA………...
2.2 Perbedaan DNA dan RNA...
2.3 Pengertian 2.3.4 Teknik Elektroforesis Analisis DNA, RNA maupun
Protein………... 2.3.5Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Pemisahan
Kesimpulan………
DAFTAR PUSTAKA………...
BAB 1 PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Elektroforesis merupakan metode yang sudah dipakai oleh banyak peneliti
terutama yang semakin pesat dinegara-negara berkembang akan selalu diikuti pula
dengan kemajuan ilmu pengetahuan yang semakin marak dibidang teknologi.
Salah satu diantaranya adalah pengembangan di bidang Biologi Molekul. Bidang
ilmu pengetahuan Bidang Molekuler ini telah dimulai pada akhir abad ke 19,
setelah metode elektroforesis ditemukan dan dipakai untuk menganalisa berbagai
kegiatan penelitian di bidang Kimia, Biologi (Genetika, Taksonomi dan
Bio-sistematik).
Metode elektroforesis mulai berkembang akhir abad ke-19 setelah
ditemukan penelitian yang menunjukkan adanya efek dari listrik terhadap
partikel-partikel atau molekul-molekul yang bermuatan listrik, dalam hal ini termasuk juga
DNA, RNA dan protein. Elektroforesis berasal dari bahasa Yunani yang
mempunyai arti transport atau perpindahan melalui partikel partikel listrik.
Metode elekroforesis telah digunakan dan dikembangkan didalam teknik analisa
sangat pesat sekali di zaman kemajuan teknologi, disebabkan karena
pengerjaannya sangat sederhana dan sangat mudah. Di dalam ilmu biologi
maupun biologi molekuler, metode elektrorofesis banyak digunakan untuk
taksonomi, sistematik dan genetik dari hewan ataupun tumbuhan. Elektroforesis
dapat dibagi menjadi tiga yaitu elektroforesis kertas, elektroforesis gel, dan
elektroforesis kapiler. Dalam makalah ini dibahas elektroforesis gel.
1.2 Rumusan Masalah
Adapun rumusan masalah makalah ini yaitu :
1. Apakah yang dimaksud dengan DNA dan RNA ?
2. Apa perbedaan DNA dan RNA
3. Bagaimanakah teknik analisis DNA, RNA menggunkan metode
elektroferesis gel ?
1.3 Tujuan
Adapun tujuan makalah ini yaitu :
1. Mengetahui pengertian DNA dan RNA ?
2 Mengetahui perbedaan DNA dan RNA
3 Mengetahui teknik analisis DNA, RNA menggunkan metode
BAB II PEMBAHASAN
2. 1 Pengertian DNA dan RNA
Asam nukleat adalah polinukleotida yang terdiri dari unit-unit
mononukleotida, jika unit-unit pembangunnya dioksinukleotida maka asam
nukleat itu disebut dioksiribonukleat (DNA) dan jika terdiri dari unit-unit
mononukleotida disebut asam ribonukleat (RNA).
DNA, Deoxyribose Nucleic Acid adalah asam nukleotida, biasanya dalam
bentuk heliks ganda yang mengandung instruksi genetik yang menentukan
perkembangan biologis dari seluruh bentuk kehidupan sel. DNA seringkali dirujuk
sebagai molekul hereditas karena ia bertanggung jawab untuk penurunan sifat
genetika dari kebanyakan ciri yang diwariskan. Pada manusia, ciri-ciri ini
misalnya dari warna rambut hingga kerentanan terhadap penyakit. Selama
pembelahan sel, DNA direplikasi dan dapat diteruskan ke keturunan selama
reproduksi (Campbell,2000).
DNA dan RNA mempunyai sejumlah sifat kimia dan fisika yang sama
sebab antara unit-unit mononukleotida terdapat ikatan yang sama yaitu melalui
jembatan fosfodiester antara posisi 3′ suatu mononukleotida dan posisi 5′ pada
(DNA) dan asam ribonukleat (RNA) memberikan dasar kimia bagi pemindahan
keterangan di dalam semua sel.
Dua tipe utama asam nukleat adalah asam dioksiribonukleat (DNA) dan
asam ribonukleat (RNA). DNA terutama ditemui dalam inti sel, asam ini
merupakan pengemban kode genetik dan dapat memproduksi atau mereplikasi
dirinya dengan tujuan membentuk sel-sel baru untuk memproduksi organisme itu
dalam sebagian besar organisme, DNA suatu sel mengerahkan sintesis molekul
RNA, satu tipe RNA, yaitu messenger RNA (mRNA), meninggalkan inti sel dan
mengarahkan tiosintesis dari berbagai tipe protein dalam organisme itu sesuai
dengan kode DNA-nya.
2.2 Perbedaan DNA dan RNA
Meskipun banyak memiliki persamaan dengan DNA, RNA memiliki
perbedaan dengan DNA, antara lain yaitu:
a). Bentuk serta Ukuran DNA dan RNA
Pada umumnya molekul RNA lebih pendek dari molekul DNA. DNA
berbentuk double helix, sedangkan RNA berbentuk pita tunggal. Meskipun
demikian pada beberapa virus tanaman, RNA merupakan pita double namun tidak
terpilin sebagai spiral. Rantai DNA memiliki lebar 22-24 Å, sementara panjang
satu unit nukleotida 3,3 Å[2]. Walaupun unit monomer ini sangatlah kecil, DNA
dapat memiliki jutaan nukleotida yang terangkai seperti rantai. Misalnya,
kromosom terbesar pada manusia terdiri atas 220 juta nukleotida.
b) Fungsi DNA dan RNA
DNA berfungsi memberikan informasi atau keterangan genetik, sedangkan
1. RNA d, menerima informasi genetik dari DNA, prosesnya dinamakan
transkripsi, berlangsung didalam inti sel.
2. RNA t, mengikat asam amino yang ada di sitoplasma.
3. RNA r, mensintesa protein dengan menggunakan bahan asam amino,
proses ini berlangsung di ribosom dan hasil akhir berupa polipeptida.
Namun demikian, peran penting RNA terletak pada fungsinya sebagai
perantar antara DNA dan protein dalam proses ekspresi genetik karena ini berlaku
untuk semua organisme hidup. Dalam peran ini, RNA diproduksi sebagai salinan
kode urutan basa nitrogen DNA dalam proses transkripsi. Kode urutan basa ini
tersusun dalam bentuk 'triplet', tiga urutan basa N, yang dikenal dengan nama
kodon. Setiap kodon berelasi dengan satu asam amino (atau kode untuk berhenti),
monomer yang menyusun protein. Lihat ekspresi genetik untuk keterangan
lebih lanjut.
Gambar 2.1 Komponen DNA dan RNA Komponen :
Gula pada DNA deoksiribosa , sedangkan RNA adalah ribosa
Struktur dasar RNA mirip dengan DNA. RNA merupakan polimer yang
tersusun dari sejumlah nukleotida. Setiap nukleotida memiliki satu gugus fosfat,
satu gugus gula ribosa, dan satu gugus basa nitrogen (basa N). Polimer tersusun
dari ikatan berselang-seling antara gugus fosfat dari satu nukleotida dengan gugus
gula ribosa dari nukleotida yang lain.
Rangka utama untai DNA terdiri dari gugus fosfat dan gula yang
berselang-seling. Gula pada DNA adalah gula pentosa (berkarbon lima), yaitu
2-deoksiribosa. Dua gugus gula terhubung dengan fosfat melalui ikatan fosfodiester
antara atom karbon ketiga pada cincin satu gula dan atom karbon kelima pada
gula lainnya. Salah satu perbedaan utama DNA dan RNA adalah gula
penyusunnya; gula RNA adalah ribosa.
d) Lokasi DNA dan RNA
DNA pada umumnya terdapat di kromosom, sedangkan RNA tergantung
dari macamnya, yaitu:
RNA d(RNA duta), terdapat dalam nukleus, RNA d dicetak oleh salah satu
pita DNA yang berlangsung didalam nukleus.
RNA p(RNA pemindah) atau RNA t(RNA transfer), terdapat di sitoplasma.
e) Struktur DNA dan RNA
Gambar 2.2 Struktur DNA dan RNA Basa nitrogen :
Purin — DNA adalah Adenin dan Guanin, pada RNA adalah Adenin dan
Guanin
Pirimidin — DNA adalah Timin dan sitosin, pada RNA adalah Urasil dan
sitosin
Kadar: pada DNA: tetap (tidak dipengaruhi oleh kecepatan sintesis protein),
RNA:berubah-ubah, tergantung aktivitas sintesis protein.
Perbedaan RNA dengan DNA terletak pada satu gugus hidroksil tambahan
pada cincin gula ribosa (sehingga dinamakan ribosa). Basa nitrogen pada RNA
sama dengan DNA, kecuali basa timin pada DNA diganti dengan urasil pada
nukleotida.Selain itu, bentuk konformasi RNA tidak berupa pilin ganda
sebagaimana DNA, tetapi bervariasi sesuai dengan tipe dan fungsinya.
DNA terdiri atas dua untai yang berpilin membentuk struktur heliks ganda.
Pada struktur heliks ganda, orientasi rantai nukleotida pada satu untai berlawanan
dengan orientasi nukleotida untai lainnya. Hal ini disebut sebagai antiparalel.
Masing-masing untai terdiri dari rangka utama, sebagai struktur utama, dan basa
nitrogen, yang berinteraksi dengan untai DNA satunya pada heliks. Kedua untai
pada heliks ganda DNA disatukan oleh ikatan hidrogen antara basa-basa yang
terdapat pada kedua untai tersebut. Empat basa yang ditemukan pada DNA adalah
adenin (dilambangkan A), sitosin (C, dari cytosine), guanin (G), dan timin (T).
Adenin berikatan hidrogen dengan timin, sedangkan guanin berikatan dengan
sitosin (Fessenden dan Joan, 1986) .
2.3 Pengertian Elektroforesis
Elektroforesis adalah teknik pemisahan suatu partikel atau spesiesatau ion
atau partikel koloid berdasarkan kemampuan berpindah melalui medium
konduktif, biasanya berupa larutan bufer, sebagai respon adanya suatu medan
listrik. Secara teknis, elektroforesis merupakan istilah yang diberikan untuk
migrasi partikel yang bermuatan akibat diberikan arus listrik searah atau DC
(Direct Current).Teknik elektroforesis ditentukan oleh ciri molekular ionik dan
adanya muatan sebagai sifat fisik. Arah dan laju pergerakan tergantung pada spot
dan intensitas muatan ionik. Bufer elektroda digunakan untuk konduktor arus
dengan menjadi jembatan konduksi diantara dua elektroda sehingga
memungkinkan terjadinya aliran medan listrik.
Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada
bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik
dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut
akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan gerak molekul
tergantung pada nisbah muatan terhadap massanya serta tergantung pada bentuk
molekulnya.
Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz, yang terkait dengan
sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati dan kondisi elektris lingkungan:
F adalah gaya Lorentz, q adalah muatan yang dibawa oleh objek, E adalah medan listrik.
Secara umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan,
mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen DNA.Pergerakan molekul terutama
tergantung di muatan yang ada pada permukaan partikel, tanda dan besarnya
muatan pembawa oleh variasi group ionogenik.Tergantung kepada kekuatan
molekul listrik dan pH dari medium dalam mengkateristik, sehingga pemisahan
molekul dapat terjadi karena efek seleksi dan medium yang sesuai.
Elektroforesi gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi
molekular. Prinsip dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat
dipisahkan oleh medan listrik. Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut
dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya gerak listrik di dalam
matriks gel. Laju perpindahan tersebut bergantung pada ukuran molekul
bersangkutan. Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun
dapat pula digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan molekul
sebelum digunakan dalam metode-metode lain seperti spektrometer massa, PCR,
kloning, sekuensing DNA, atau immuno-blotting yang merupakan metode-metode
2.3.1 Bagian-bagian dari Elektroforesis
Gambar 2.3 Elektroforesis Gel Agarosa
Gambar 2.4 Elektroforesis Gel Akrilamida a. Gel
Salah satu komponen dari elektroforesis adalah gel. Gel merupakan media
yang berfungsi sebagai matriks Penyaring molekul. Pemilihan gel bergantung
pada ukuran molekul yang akan di elektroforesis.
1. Gel poliakrilamida denaturasi, berfungsi untuk memurnikan penanda
oligonukleotida dan menganalisis hasil ekstensi primer.
2. Gel agarosa, berfungsi untuk memisahkan rantai DNA yang berukuran
besar.
Biasanya, gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang
lebih besar (lebih dari 50 bp)dan digunakan secara horizontal. Gel poliakrilamida
digunakan untuk fragmen kecil (kurang dari 50 bp) dan digunakan secara vertikal.
Jarak antara dua fragmen DNA yang berbeda ukuran dapat ditentukan berdasarkan
konsentrasi matriks agarosa.Secara umum, molekul yang lebih kecil bergerak
lebih cepat dan bermigrasi lebih jauh dari molekul kecil karena memiliki gesekan
yang lebih rendah saat bergerak menuju elektroda positif.
Gel agarosa dimurnikan dari polisakarida alga Rhodophyla. Gelidian dan
Glaucaria adalah komponen yang dimodifikasi residu galaktosanya. Didalam
hubungan dengan polisakarida, agropefin dibentuk agar. Agarose larut pada buffer
(TAE) yang mendidih dan ditunggu untuk dingin, Hasil ini dicetak pada cetakan
gel yang ditempatkan pada suhu ruang.
Gambar 2.5 Agarosa
Poliakrilamida dibentuk dari akrilamida dan N,N’-methyle-bis-akrilamida
perisulphate dan N,N,N,N'-tetramethylethylenediamin (TEMED). TEMED adalah
katalis yang dibentuk dari radikal bebas ionperisulfate dan diinisiasi
polymerization dari akrilamida. Poliakrilamida dapat dikondisikan sebagai
polimer yang netral, kationik, anionik, atau amfoter dengan sifat fisika dan kimia,
panjang dan berat molekul yang bervariasi.
Gambar 2.6 Polimerisasi akrilamida
Perbedaan penggunaan pada gel agarosa dengan gel akrilamida adalah :
1. Gel Poliakrilamid
a. Lebihefektifuntukpemisahanfragmen DNA antara 5-50bp
b. Power: ekstrimtinggi.
c. Ukuranperbedaan DNA yang terpisah sampai 1bp.
d. Pembuatannya lebih sulit dibanding gel agarosa, karena biasanya
digunakan poliakrilamid dengan resolusi yang tinggi.
e. Medan gerak secara vertical dan listriknya konstan.
2. Gel Agarosa
b. Mempunyailajupemisahanlebihcepat.
c. Dapat memisahkan fragmen DNA antara 50 bp – 50kb tergantung
dari konsentrasi gel agarosa yang digunakan.
d. Medan gerak biasanya horizontal.
b. Buffer
Buffer atau larutan penyangga yang digunakan pada proses elektroforesis
berfungsi untuk menjaga kesetimbangan pH dan memberikan ion untuk
konduktivitas saat proses elektroforesis.
Jenis-jenis buffer yang digunakan pada proses elektroforesis, yaitu :
1. Elektroforesis DNA :
a. Buffer TAE (Tris-acetate-EDTA), atau
b. TBE (Tris-borate-EDTA )
c. Loading buffer
2. Elektroforesis Protein yaitu Buffer Tris
a. Proses Elektroforesis
Elektroforesis gel agarosa memiliki beberapa komponen yang terdiri dari:
1. Comb: digunakan untuk membentuk well pada gel agarosa.
2. Tray: digunakan untuk sebagai cetakan gel agarosa.
3. Chamber: digunakan sebagai wadah gel agarosa.
4. Sumber listrik: digunakan untuk memberi arus saat proses elektroforesis.
Proses elektrolisis terbagi menjadi tiga tahap yaitu, tahap pembuatan
1. Pembuatan matriks gel
Untuk mempersiapkan gel, agarosa bubuk dicampur dengan buffer
elektroforesis dengan konsentrasi yang diinginkan, dan dipanaskan dalam oven
microwave untuk mencairkannya. Etidium bromida ditambahkan ke gel
(konsentrasi akhir 0,5 ug / ml) untuk memfasilitasi visualisasi DNA setelah
elektroforesis. Setelah pendinginan larutan menjadi sekitar 60oC, larutan
dituangkan ke nampan pengecoran berisi sisir sampel dan pemadatan akan terjadi
pada suhu kamar. Setelah gel telah dipadatkan, sisir diambil dengan hati-hati agar
jangan sampai merobek bagian bawah sumur.
Gambar 2. 7 Pembuatan Matriks Gel Agarosa 2. Elektroforesis
Gel yang berada dalam nampan plastik, dimasukkan ke ruang horizontal
elektroforesis dan ditutupi dengan buffer. Campuran sampel yang mengandung
DNA dicampur loading buffer kemudian dipipet ke dalam sumur sampel, tutup
dan kekuasaan lead ditempatkan pada aparatus dan dialirkan arus. Aliran arus
dapat dipastikan dengan mengamati gelembung dari elektroda. DNA akan
bermigrasi ke arah elektroda positif, yang biasanya berwarna merah, yang
katoda
anoda
Gel agarosa
buffer
Gambar 2.8 Proses Elektroforesis b. Visualisasi atau stainning
Dalam elektroforesis juga digunakan bahan-bahan seperti Etidium
Bromida yang bersifat karsinogenik dan Brom Fenol Blue. Hal tersebut karena
Etidium Bromida dapat meningkatkan daya fluoresensi dari DNA sehingga dapat
terlihat jelas, sedangkan Brom Fenol Blue berfungsi sebagai pewarna untuk
memantau kecepatan molekul DNA pada gel. Jarak perpindahan DNA dalam gel
dapat diperkirakan melalui pemantauan visual dengan menggunakan pewarna
pelacak seperti pewarna bromofenol biru dan xilena cyanol.
2.3.2 Fungsi Elektroforesis
Berikut ini adalah beberapa fungsi dari elektroforesis, yaitu:
a. menyediakan informasi mengenai ukuran, konfirmasi dan muatan dari
protein dan asam nukleat
b. sebagai metode pemisahan yang dapat digunakan untuk menentukan
komponen dari protein atau asam nukleat setiap individu
c. Pada bidang kepolisian teknik ini digunakan nuntuk pemeriksaan DNA,
karakteristik khusus, misalnya sidik jari. Sehingga membantu polisi dalam
mengungkap sebuah kasus.
Dalam biologi molekuler, elektroforesis merupakan salah satu cara untuk
memvisualisasikan keberadaan DNA, plasmid, dan produk PCR.
2.3.3 Analisis DNA dan RNA dengan Teknik Elektroforesis Gel
Elektroforesis adalah teknik yang digunakan untuk memisahkan dan
memurnikan suatu makromolekul khususnya protein dan asam nukleat
berdasarkan perbedaan ukuran. Elektroforesis merupakan metode yang paling
banyak dipakai saat ini dalam percobaan biokimia dan biologi molekuler protein
(Jean and Francois G., 2010)
Elektroforesis gel agarosa adalah teknik paling baik yang pernah dibuat
dan secara rutin digunakan di laboratorium klinis untuk analisis protein dan DNA
pada berbagai cairan biologis (serum, urine, CSF). Teknik ini merupakan teknik
yang menggunakan prinsip elektroforesis zona. Seperti yang diketahui, molekul
protein bermigrasi pada medium padat/gel yang direndam dengan suatu larutan
penyangga di bawah pengaruh medan listrik. Migrasi ini tergantung pada muatan
listrik, titik isoelektrik bersih dan massa molekul protein (Jean and Francois G.,
Prinsip kerja elektroforesis gel dimulai saat makromolekul yang
bermuatan listrik ditempatkan pada medium berisi tenaga listrik.
Molekul-molekul tersebut akan bermigrasi menuju kutub positif atau kutub negatif
berdasarkan muatan yang terkandung di dalamnya. Molekul-molekul yang
bermuatan negatif (anion) akan bergerak menuju kutub positif (anoda), sedangkan
molekul-molekul yang bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub
negatif (katoda) (Lee & Bahaman, 2010).
Elektroforesis digunakan untuk menyediakan informasi mengenai ukuran,
konfirmasi dan muatan dari protein dan asam nukleat. Elektroforesis dalam skala
besar memungkinkan untuk digunakan sebagai metode pemisahan yang dapat
digunakan untuk menentukan komponen dari protein atau asam nukleat setiap
individu (Fairbanks & Andersen, 1999).
Elektroforesis gel memisahkan makromolekul berdasaran laju
perpindahannya melewati suatu gel di bawah pengaruh medan listrik.
Elektroforesis gel memisahkan suatu campuran molekul DNA menjadi pita-pita
yang masing-masing terdiri atas molekul DNA dengan panjang yang sama
(Campbell dkk, 2002).
Ada tiga jenis gel yang dapat digunakan dalam elektroforesis DNA, yaitu
(Lee & Bahaman, 2010):
1. Gel poliakrilamida denaturasi, berfungsi untuk memurnikan penanda
oligonukleotida dan menganalisis hasil ekstensi primer.
2. Gel alkalin agarosa, berfungsi untuk memisahkan rantai DNA yang
3. Gel agarose formaldehid denaturasi, berfungsi untuk menyediakan sistem
elektroforesis yang digunakan untuk fraksi RNA pada ukuran standar
Biasanya, gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang lebih
besar (lebih dari 200 bp) dan gel poliakrilamida digunakan untuk fragmen kecil
(kurang dari 200 bp). Jarak antara dua fragmen DNA yang berbeda ukuran dapat
ditentukan berdasarkan konsentrasi matriks agarose. Mobilitas/pergerakan DNA
relatif tergantung pada faktor-faktor tertentu, terutama pada konsentrasi agarosa
dalam gel, kekuatan arus yang digunakan, kekuatan ionik dari larutan buffer, dan
konformasi fragmen DNA itu sendiri. Molekul DNA bermigrasi melalui pori-pori
kecil yang terbentuk dalam padatan gel agarosa. Secara umum, molekul yang
lebih kecil bergerak lebih cepat dan bermigrasi lebih jauh dari molekul kecil
karena memiliki gesekan yang lebih rendah saat bergerak menuju elektroda
positif. Konsentrasi yang rendah pada gel agarosa memberikan resolusi yang lebih
baik untuk fragmen besar, dengan memberikan pemisahan yang lebih besar antara
band yang secara ukuran tidak terlalu jauh berbeda. Konsentrasi gel yang lebih
tinggi, di sisi lain, dapat mengurangi kecepatan migrasi fragmen panjang yang
sementara itu dapat memfasilitasi pemisahan yang lebih baik pada fragmen DNA
kecil (Lee & Bahaman, 2010).
Namun, fragmen yang lebih besar dapat bermigrasi secara lebih cepat daripada
fragmen yang lebih kecil, karena tegangan pada gel yang ditingkatkan. Selain itu,
DNA memiliki muatan yang konsisten untuk rasio massa, sehingga ukuran
molekul DNA merupakan faktor utama yang mempengaruhi migrasi melalui
matriks gel. Terlepas dari kenyataan bahwa penerapan tegangan tinggi dapat
resolusi pemisahan (di atas sekitar 5 sampai 8 V/cm). Untuk alasan itu, resolusi
terbaik dari fragmen yang lebih besar dari 2 kb dicapai dengan menerapkan tidak
lebih dari 5 V/cm pada gel (Lee & Bahaman, 2010).
Gambar 2.10 Rangkaian Alat Elektroforesis Gel Elektroforesis gel memiliki beberapa komponen yang terdiri dari
Comb: digunakan untuk membentuk well pada gel agarose.
1. Tray: digunakan untuk sebagai cetakan gel agarose.
2. Chamber: digunakan sebagai wadah gel agarose.
3. Sumber listrik: digunakan untuk memberi arus saat proses elektroforesis
Dalam elektroforesis juga digunakan bahan-bahan sepert Etidium Bromida yang
bersifat karsinogenik dan Brom Fenol Blue. Hal tersebut karena Etidium Bromida
sedangkan Brom Fenol Blue berfungsi sebagai pewarna untuk memantau
kecepatan molekul DNA pada gel (Birren and Lai, 1993).
2.3.4 Teknik Elektroforesis Analisis DNA, RNA maupun Protein
Elektroforesis DNA dilakukan misalnya untuk menganalisis
fargmen-fragmen DNA hasil pemotongan dengan enzim restriksi. Fragmen molekul DNA
yang telah dipotong-potong dapat ditentukan ukurannya dengan cara membuat gel
agarosa yaitu suatu bahan semi-padat ditentukan ukurannya dengan cara membuat
dari rumput laut. Gel agarosa dibuat dengan melarutkannya dalam suatu buffer.
Agar dapat larut dengan baik, pelarutannya dibantu dengan pemanasan, misalnya
menggunakan oven gelombang mikri (microwave oven). Dalam keadaan panas,
gel akan berupa cairan sehingga mudah dituang ke atas suatu lempeng (plate)
yang biasanya terbuat dari Perspex. Sebelum mendingin dan memadat, pada ujung
gel tersebut dibuat lubang-lubang dengan menggunakan lembaran Perspex tipis
yang dibentuk menyerupai sisir. Sisir tersebut di tancapkan pada salah satu ujung
gel yang masih cair. Dengan demikian, pada waktu gel memadat dan sisirnya
diambil terbentuklah lubang-lubang kecil. Kedalam lubang-lubang kecil itulah
sampel molekul DNA dimasukkan. Gel agarosa yang sudah terbentuk kemudian
dimasukkan ke dalam suatu tanki yang berisi buufer yang sama dengan yang
digunakan untuk membuat gel. Buffer dapat dibuat misalnya dengan tris-asetat
EDTA (TAE) atau tris-borat-EDTA (TBE) (Yuwono, 2007).
Setelah DNA dimasukkan kedalam lubang sampel, arus listrik dialirkan
kutub yang sejajar dengan lubang sampel DNA berupa kutub negative, sedangkan
kutub lainnya posistif. Oleh karena DNA bermuatan negative maka
kemudian direndam dalam larutan yang mengandung etidium bromida. Etidium
bromida akan menginteraksi (menyisip ke dalam) DNA, penggunaan etidium
bromida dimasukkan untuk membantu visualisasi karena etidium bromida akan
memendarkan sinar ultraviolet. Jika gel disinari dengan ultraviolet dari bawah
maka akan tampak citra berupa pita-pita pada gel. Pita-pita tersebut adalah
molekul-molekul DNA yang bergerak sepanjang gel setelah dielektroforesis.
Molekul RNA dapat dianalisis dengan prinsip yang sama, yaitu menggunakan gel
agarosa, namun dengan menggunakan buffer yang berbeda yaitu yang
mengandung formaldehid (Yuwono, 2007).
Gambar 2.11 Perangkat Elektroforesis SDS-PAGE
Elektroforesis protein pada dasarnya dilakukan dengan prinsip serupa
seperti yang digunakan dalam elektroforesis DNA, namun gel yang digunakan
adalah gel poliakrilamid. Seringkali dalam pembuatan gel akrilamid ditambahkan
sodium dodecyl sulphate (SDS) yang merupakan senyawa untuk mendisosiasikan
protein menjadi subunitnya. Metode elektroforesis yang demikian disebut
SDS-PAGE (sodium dodecyl sulphate polyacrylamid gel electrophoresis). Berbeda
halnya dengan DNA, protein yang dielektroforesis dapat dianalisis dengan
bersama-sama dengan sampel. Pengecatan protein dapat juga dilakukan dengan
larutan perak nitrat yang lebih sensitive disbanding dengan Coomassie blue
(Yuwono, 2007).
2.3.5 Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Pemisahan Komponen Pada Elektroforesis DNA
Berikut ini merupakan faktor-faktor yang mempengaruhi pemisahan
komponen pada elektroforesis DNA, adalah :
1. Ukuran molekul DNA
Molekul yang lebihbesarakanbergeraklebihlambat, misalnya DNA linier
lebihcepatdibanding DNA sirkuler. Jarakmigrasimolekul DNA pada gel
adalahlajuterbalikproporsional log-10 darijumlahpasangan basa.
Gambar di atas menunjukkan hasil khas elektroforesis DNA dalam kaitannya
dengan ukuran fragmen DNA dan jarak yang dimigrasikan melalui gel
agarose. Di sebelah kiri, ada sampel penanda yang bisa dijadikan kontrol dan
sebagai referensi untuk panjang DNA (pada pasangan basa). Di sebelah kanan
penanda, ada tiga contoh sampel DNA yang berbeda: Contoh A, Contoh B dan
Contoh C. Gambar menunjukkan betapa kecil fragmen DNA bergerak lebih
jauh di seluruh gel agarose daripada fragmen DNA yang lebih besar. Jarak ini
dapat digunakan untuk mengidentifikasi atau mencocokkan sekuens DNA
tertentu. Grafik di sebelah kanan gambar menunjukkan hubungan nonlinier,
hubungan antara ukuran fragmen DNA dan jarak yang dimigrasikan. Ini
adalah kurva negatif karena fragmen DNA semakin besar, mereka bermigrasi
lebih sedikit jaraknya melalui gel.
2. Konsentrasi gel agarose
Fragmen DNA
yangbervariasiukuranmolekulnyaakanberberaksesuaidengankonsentrasidari gel
agarosa yang digunakan.
3. Konformasi DNA
Laju migrasi juga tergantung pada bentuk/konformasi DNA, kita tahu
bahwa ada 3 macam bentuk DNA yaitu super-helix circular (I), circular-opened
(II), dan linier (III).Meskipun ketiga bentuk itu mempunyai berat yang sama tetapi
laju migrasip ada gel elektroforesis berbeda. Perbedaan laju migrasi ini karena:
Terutama konsentrasi gel agarose
Kekuatan aruslistrik dan ionik buffer yang digunakan
Densitas kembaran super heliks pada bentuk I
Padabeberapakondisibentuk I lebihcepatdisbandingbentuk III
Tergantung juga kenaikan kuantitas EtBr: konsentrasiEtBr meningkat,
pengikatan DNA meningkat pula sehinggamobilitasmeningkattajam,
contoh untuk bentuk I
Konsentrasi EtBr kritis antara 0.1mg/ml-0.5ml/mg
4. Penggunaan Voltage danarahdaribidangelektris
Voltage rendah menyebabkan laju migrasi DNA linier proporsional.
Idealnya untuk DNA ± 2kb pada gel agarose bergerak ± 5v/cm. Arah dari bidang
elektris konstans untuk DNA 50-100kb bergerak dengan laju yang sama, akan
berubah secara periodic sesuai kecepatan pergerakan DNA akan berubah juga.
5. Komposisibasa DNA atau temperatur
Baikkomposisibasamaupun temperatur tidakbegituberpengaruh, mobilitas
DNA stabilpada temp. 4-30°C. Dan elektroforesis gel agarosa dilakukan pada
suhu kamar
6. Keberadaan pewarna DNA
Iintercalating agentethidium bromide (EtBr) adalah pewarna fluoresen untuk
EtBr dapat mengurangi mobilitas DNA linier sampai 15%.Hanya sedikit DNA ±
1ng dapat dideteksi secara langsung dengancara gel diletakkan pada media
UV-transil luminator. EtBr dapat digunakan untuk mendeteksi single- atau
double-stranded asam nukleat (DNA atau RNA). Meskipun, affinity dariEtBr-dye ini
untuk single-stranded asam nukleat relatif rendah dan pendaran fluorensen
minimum.
7. Komposisi buffer elektroforesis
Buffer elektroforesis yang digunakan harus sesuai dengan pelarut yang
digunakan untuk pembuatan gel agarose. Misal:
a. Tris-asetat; umum dipakai untuk preparative, kemampuannya paling rendah,
tetapi efektif untuk isolasi DNA dari gel agarosa baik elektro elusi maupun
gel ekstraksi.
b. Tris-borat; resolusi cukup baik, tapi untuk mengisolasi kembali DNA dari
BAB III PENUTUP
3.1 Kesimpulan
Adapun kesimpulan dari makalah ini yaitu
1. unit-unit pembangun dioksinukleotida maka asam nukleat itu disebut
dioksiribonukleat (DNA) dan jika terdiri dari unit-unit mononukleotida
disebut asam ribonukleat (RNA).
2. Perbedaan DNA dan RNA dapat lihat berdasarkan bentuk serta ukuran ,
fungsi, komponen, lokasi DNA dan RNA
3. Pemisahan DNA ataupun RNA dilakukan dengan menggunakan
elektroforesis gel. Molekul DNA dan RNA terpisah berdasarkan ukuran
ketika dilewatkan pada matriks gel dengan aliran listrik. DNA dan RNA
memiliki muatan negatif, dan saat berada dalam aliran listrik, akan
bermigrasi melalui gel menuju kutub positif, hanya saja Buffer yang
digunakan dielektoforesis gel berbeda untuk DNA biasanya menggunakan
buffer tris-asetat EDTA (TAE) atau tris-borat-EDTA (TBE), sedangkan
DAFTAR PUSTAKA
Campbell, N.A, J.B. Reece, and L.G. Mitchell, 2000. Biology. 6th ed. Jakarta :
Erlangga.
Fessenden, RJ dan Joan F. 1986. Kimia Organik. Jakarta: Erlangga.
Jean, Francois Giot. 2010. Agarose Gel Electrophoresis – Aplications in Clinical Chemistry. Journal of Medical Biochemistry 2010; 29 (1).
Lee, S.V., Bahaman, A.R. 2010. Modified gel preparation for distinct DNA fragment analysis in agarose gel electrophoresis. Tropical Biomedicine 27(2): 351-354 (2010).
Tarigan, Simson. 2011. Penggunaan Polymerase Chain Reaction Enzyme Linked Oligonucelotide Sorbent Assay (PCR-ELOSA) untuk Deteksi Agen Penyakit. WARTAZOA, 21(1), 1-8.
Yuwono, T., 2007. Biologi Molekular. Jakarta: Erlangga.
Sumber lain :
http://diazonium.wordpress.com/2012/05/18/tabel-perbedaan-dna-rna/diakses tanggal 9 Oktober 2017.
