ANALISIS ASAM NUKLEAT
Klanita Sabira, Teknologi Bioproses (1206212350)
ABSTRAK
Pada analisis asam nukleat yaitu utamanya adalah DNA dan RNA, terdapat dua macam analisis. Analisis pertama adalah analisis kualitatif dengan metode gel elektroforesis, staining, sequencing,
hibridisasi, dan sentrifugasi. Metode tersebut pada prinsipnya adalah untuk menganalisis urutan dan mengidentifikasi DNA atau RNA yang menjadi sampel. Analisis kedua adalah analisis kuantitatif yaitu mengukur kadar atau konsentrasi molekul asam nukleat dengan metode blotting
yaitu northern dan southern blotting dan metode spektrofotometri.
1.1. Pendahuluan
Asam nukleat merupakan makromolekul yang tersusun dari polimer nukleotida. Asam nukleat memiliki fungsi utama dalam tubuh yaitu antara lain sebagai materi genetik dan juga koenzim.
Asam nukleat yang berperan sebagai materi genetik adalah DNA dan RNA. Sedangkan yang berperan sebagai koenzim antara lain adalah adalah ATP atau Adenosine Triphospate, NAD atau Nicotinamide-adenine Dinucleotide, dan lain-lain. Nukleotida sebagai monomer dari asam nukleat tersusun dari basa nitrogen, sebuah gula pentosa, dan gugus fosfat.
Analisis asam nukleat secara umum dilakukan melalui tahap isolasi DNA dan RNA dari sampel. Pemurnian sampel dan penilaian kualitas adalah tahap yang penting untuk dilakukan pada percobaan. Untuk menganalisis asam nukleat dapat digunakan beberapa teknik analisis.
1.2. Elektroforesis
DNA dan RNA adalah molekul asam nukleat yang digunakan untuk menyimpan dan menghantarkan informasi genetik di dalam sel. Untuk menganalisis DNA dan RNA, dibutuhkan tahap ekstraksi molekul sampel dari sel atau jaringan.
Teknik elektroforesis digunakan untuk memisahkan dan mempurifikasi makromolekul. Makromolekul yang dijadikan objek elektroforesis adalah protein dan asam nukleat yang memiliki perbedaan ukuran, kadar ion, dan molekul-molekul penyusunnya. Molekul-molekul tersebut diletakkan dalam di dalam medan listrik sehingga akan bermigrasi karena adanya perbedaan muatan. Molekul protein dan asam nukleat yang bermuatan negatif akan bergerak dari kutub negatif menuju kutub positif dari gel elektroforesis. Elektroforesis merupakan teknik untuk memisahkan molekul-molekul seperti protein atau fragmen asam nukleat pada basa berdasarkan kecepatan migrasi melewati gel elektroforesis. Secara prinsip, elektroforesis merupakan tahap memisahkan campuran bahan-bahan berdasarkan perbedaan sifatnya. Dalam elektroforesis gel, pemisahan dilakukan terhadap campuran bahan dengan muatan listrik yang berbeda-beda
Terdapat beberapa jenis elektroforesis yang telah dapat digunakan untuk menganalisis makromolekul termasuk asam nukleat. Beberapa diantaranya adalah elektroforesis gel agarosa, elektroforesis gel poliakrilamida, elektroforesis gel 2D, dan elektroforesis isoenzim. Metode elektroforesis gel agarosa merupakan metode yang paling umum (konvensional) yang dapat digunakan untuk menganalisis asam nukleat.
Elektroforesis gel dapat digunakan untuk memisahkan asam nukleat berdasarkan ukurannya di dalam agar atau gel poliakrilamida. Metode ini dapat memisahkan pecahan-pecahan asam nukleat dengan ukuran 20bp hingga 20 kb. Gel agarose ideal digunakan untuk pemisahan DNA, produk PCR, dan gen DNA atau RNA sebelum dilakukan kloning, pengurutan (sequencing),
Southern atau Northern Blotting. Gel poliakrilamida dapat digunakan untuk elektroforesis gel poliakrilamida atau PAGE.
Semua teknik elektroforesis membutuhkan arus listrik untuk menggerakkan molekul bermuatan melalui matriks atau gel. Padaelektroforesis setiap makromolekul, prinsipnya molekul yang lebih kecil akan bergerak lebih cepat dan karena itu akan lebih jauh pada gel. Asam nukleat yang akan dianalisis dimasukkan ke dalam gel agarose. Gel agarose tersebut akan berperean sebagai matrix untuk menampung dan memisahkan molekul-molekul target. Gel tersebut dicelupkan dalam ruang/peralatan elektroforesis beserta larutan penyangga yang memiliki arus listrik. Larutan penyangga dibutuhkan untuk meminimalisir perubahan PH yang diakibatkan medan listrik dan untuk mencegah gel menjadi terlalu panas akibat adanya arus listrik.
Gambar 1. Ilustrasi proses elektroforesis
Dalam metode elektroforesis, dibutuhkan pewarna untuk memudahkan penampakan molekul asam nukleat. Pewarna ini dibutuhkan karena molekul asam nukleat tidak memiliki warna. Terdapat beberapa pewarna yang dapat digunakan, beberapa diantaranya adalah bromophenol blue dan ethidium bromida. Pewarna bromophenol blue biasa digunakan untuk memonitor pergerakan molekul di dalam gel. Pewarna ethidium bromida merupakan pewarna fluoresens yang digunakan untuk proses staining pada DNA di gel agarose dan gel poliakrilamida.
Gambar 2. DNA sampel yang telah dianalisis
1.3. Staining
Metode staining digunakan untuk visualisasi DNA setelah diseparasi oleh gel elektroforesis. Terdapat banyak jenis pewarna yang dapat digunakan keperluan ini, beberapa diantaranya adalah etidium bromida, SYBR Gold, SYBR Green, SYBR Safe, dan Eva Green.
1.3.1. Etidium Bromida
Etidium bromida merupakan pewarna yang paling umum digunakan untuk memvisualisasikan DNA. Pewarna ini dapat digunakan dalam gel, baik pada larutan penyangga elektroforesis ataupun pada gel. Molekul-molekul pewarna ini menempel pada rantai DNA dan bersifat fluoresens dia bawah cahaya UV. Namun etidium bromida bersifat karsinogen, karena itu penggunaannya harus ditangani dengan baik.
1.3.2. SYBR Gold
Pewarna SYBR Gold dye digunakan untuk DNA rantai tunggal, rantai ganda, atau RNA. SYBR Gold merupakan salah satu alternatif pewarna etidium bromida dan dinilai lebih sensitif daripada pewarna etidium bromida. Tingkat fluoresens pewarna SYBR Gold di bawah sinar UV 1000 kali lebih tinggi daripada etidium bromida saat berikatan dengan asam nukleat. Pewarna ini dapat juga digunakan pada gel formaldehida.
1.3.3. SYBR Green
Pewarna SYBR Green I dan II dapat berikatan dengan DNA dan berpotensial sebagai mutagen, karena itu pewarna ini harus ditangani dengan hati-hati. SYBR Green I lebih cocok untuk digunakan pada DNA rantai ganda, sedangkan SYBR Green II lebih cocok digunakan untuk DNA rantai tunggal or RNA.
1.3.4. SYBR Safe
SYBR Safe merupakan pewarna yang dirancang agar menjadi pewarna yang lebih aman daripada pewarna etidium bromida dan pewarna SYBR lainnya. Pewarna ni tidak bersifat beracun dan aman untuk dibuang langsung ke dalam sistem pembuangan limbah. Pewarna SYBR Safe dapat digunakan dengan blue-light transillluminator yang mengakibatkan lebih sedikit kerusakan terhadap DNA yang diamati dan lebih efisien untuk proses kloning selanjutnya.
1.3.5. Eva Green
Eva Green adalah pewarna hijau-fluoresens yang digunakan pada PCR (Polymerase Chain Reaction). Selain itu, pewarna ini juga cocok digunakan untuk gel yang memiliki titik leleh yang rendah. Pewarna Eve Green bersifat sangat stabil di dalam suhu tinggi dan memiliki tingkat fluoresens yang tinggi saat berikatan dengan DNA. Pewarna Eva Green juga dinilai memiliki tingkat toksisitas yang rendah.
1.4. Pengurutan (Sequencing)
Sequencing adalah penentuan urutan basa DNA dalam segmen molekul DNA yang relatif pendek . Pengurutan (sequencing) asam nukleat memungkinkan kita mengetahui kode genetik dari molekul DNA.
Ada dua metode yang dapat digunakan untuk mengurutkan molekul DNA. Metode Maxam-Gilbert dan metode Sanger. Kedua metode tersebut menghasilkan fragmen-fragmen DNA dengan panjang bervariasi, yang satu sama lain berbeda sebanyak satu basa tunggal. Dari fragmen-fragmen tersebut kita dapat menarik kesimpulan mengenai sequence asam nukleat molekul DNA yang diperiksa. Tekhnik yang digunakan adalah gel-gel poliakrilamid pendenaturasi (denaturing polyacrylamide gels). Gel agarosa dapat memisahkan molekul-molekul DNA dengan perbedaan panjang 30-50 basa, sedangkan gel poliakrilamid dapat memisahkan molekul-molekul DNA dengan perbedaan panjang satu basa. Gel-gel pendenaturasi menyebabkan molekul DNA menjadi beruntai tunggal dan tetap dalam keadaan seperti itu sepanjang proses elektroforesis. Gel pendenaturasi mengandung urea dan dijalankan dengan suhu yang ditinggikan. Kedua hal tersebut mendorong terjadinya pemisahan kedua rantai molekul DNA.
1.4.1. Metode Maxam-Gilbert
Metode sekuensing DNA yang pertama dikenal adalah metode kimia yang dikembangkan oleh A.M. Maxam dan W. Gilbert pada tahun 1977. Pada metode ini fragmen-fragmen DNA yang akan disekuens harus dilabeli pada salah satu ujungnya, biasanya menggunakan fosfat radioaktif atau suatu nukleotida pada ujung 3’. Metode Maxam-Gilbert dapat diterapkan baik untuk DNA untai ganda maupun DNA untai tunggal dan melibatkan pemotongan basa spesifik yang dilakukan dalam dua tahap.
Molekul DNA terlebih dahulu dipotong-potong secara parsial menggunakan piperidin. Pengaturan masa inkubasi atau konsentrasi piperidin akan menghasilkan fragmen-fragmen DNA yang bermacam-macam ukurannya. Selanjutnya, basa dimodifikasi menggunakan bahan-bahan kimia tertentu. Dimetilsulfat (DMS) akan memetilasi basa G, asam format menyerang A
dan G, hidrazin akan menghidrolisis C dan T, tetapi garam yang tinggi akan menghalangi reaksi T sehingga hanya bekerja pada C. Dengan demikian, akan dihasilkan empat macam fragmen, masing-masing dengan ujung G, ujung A atau G, ujung C atau T, dan ujung C.
Gambar 3. Target DMS dan Hidrazin pada urutan basaDNA
1.4.2. Metode Sanger
Metode Sanger pada dasarnya memanfaatkan dua sifat salah satu subunit enzim DNA polimerase yang disebut fragmen klenow. Kedua sifat tersebut adalah kemampuannya untuk menyintesis DNA dengan adanya dNTP dan ketidakmampuannya untuk membedakan dNTP dengan ddNTP. Jika molekul dNTP hanya kehilangan gugus hidroksil (OH) pada atom C nomor 2 gula pentosa, molekul ddNTP atau dideoksi nukleotida juga mengalami kehilangan gugus OH pada atom C nomor 3 sehingga tidak dapat membentuk ikatan fosfodiester. Artinya, jika ddNTP disambungkan oleh fragmen klenow dengan suatu molekul DNA, maka polimerisasi lebih lanjut tidak akan terjadi atau terhenti. Basa yang terdapat pada ujung molekul DNA ini dengan sendirinya adalah basa yang dibawa oleh molekul ddNTP.
Sekuensi DNA menggunakan metode dideoksi dilakukan pada empat reaksi yang terpisah. Keempat reaksi ini berisi dNTP sehingga polimerisasi DNA dapat berlangsung. Namun, pada masing-masing reaksi juga ditambahkan sedikit ddNTP sehingga kadang-kadang polimerisasi akan terhenti di tempat -tempat tertentu sesuai dengan ddNTP yang ditambahkan. Jadi, di dalam tiap reaksi akan dihasilkan sejumlah fragmen DNA yang ukurannya bervariasi tetapi ujung 3’nya selalu berakhir dengan basa yang sama.
1.5.
SentrifugasiPrinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi
Sentrifugasi merupakan proses penting dalam isolasi dan pemisahan sel. Sentrifugasi pada pemisahan dan isolasi sel dapat menggunakan berbagai metode, yaitu metode sentrifugasi perbedaan kecepatan, sentrifugasi bobot jenis bertingkat, sentrifugasi zonal, dan sentrifugasi isopiknik. Metode sentrifugasi perbedaan kecepatan memiliki prinsip pemisahan sel berdasarkan perbedaan ukuran organel sel dan densitas partikel. Patikel organel yang lebih rapat akan membentuk pelet jika pada kecepatan yang lebih tinggi dibandingkan partikel organel yang lebih besar atau renggang walaupun memiliki massa yang sama besar. Makin besar ukuran sebuah partikel, maka makin besar gaya sentrifugal yang dialaminya. Oleh karena itu partikel yang memiliki ukuran yang lebih besar akan terendapkan lebih awal di dasar tabung.
1.6.
HibridisasiTeknik hibridisasi meliputi dua proses, yaitu proses denaturasi atau pemisahan dua rantai asam nukleat yang komplementer dari proses renaturasi atau perpaduan kembali dua rantai asam nukleat. Proses denaturasi biasanya dilakukan dengan cara pemanasan DNA untuk memecah
ikatan hidrogen yang terdapat di antara pasangan basa sehingga rantai asam nukleat akan terpisah. Proses ini kemudian diikuti dengan proses renaturasi dengan cara pendinginan.
Untuk pengujian dengan hibridisasi diperlukan suatu probe asam nukleat yang komplementer dicampurkan dengan fragmen asam nukleat yang terdapat pada bahan solid pada kondisi yang mendukung terjadinya hibridisasi. Proses hibridisasi dapat juga dilakukan dalam larutan (bukan bahan solid). Baik DNA yang hendak didiagnosis (target) maupun probe dimasukkan dalam larutan buffer. Kedua DNA tersebut bebas bergerak dan proses hibridisasinya berlangsung 5-10 kali lebih cepat daripada di bahan solid.
Gambar 4. Hibridisasi asam nukleat
Proses hibridisasi dan visualisasi diawali dengan transfer DNA dari gel agarose ke nilon berpori atau membrane nitroselulosa. Pada metode ini mula-mula gel didenaturasi dengan larutan dasar dan diletakkan pada suatu nampan. Selanjutnya di atas gel hasil elektroforesis diletakkan nilon berpori atau membrane nitroselulosa, kemudian di atasnya diberi pemberat. Semua fragment hasil pemotongan dengan enzim restriksi yang pada awalnya berada pada gel akan ditransfer secara kapiler ke membrane tersebut dalam bentuk untai tunggal.
1.7. Spektrofotometri
Spektrofotometri adalah suatu metode analisis untuk mengukur konsentrasi senyawa berdasarkan kemampuan senyawa tersebut mengabsorbsi berkas sinar atau cahaya. Alat ini terdiri dari spektrofotometer dan fotometer. Spektrofotometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu, sementara fotometer adalah pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau diabsorbsi.
Spektrofotometer dilengkapi sumber cahaya atau gelombang elektromagnetik, baik cahaya UV (ultra-violet) atau pun cahaya nampak (visible). Komponen utama dari alat ini adalah sumber cahaya, pengatur intensitas, monokromator, kuvet, detektor, penguat arus dan indikator atau layar. Keberadaan DNA dalam suatu organisme secara kuantitatif dapat diketahui dengan metode spektrofotometri. Uji kuantitatif DNA adalah analisis untuk menentukan kandungan atau jumlah DNA yang terdapat dalam suatu zat atau komponen zat yang sebelumnya telah diketahui keberadaan DNA plasmidnya dalam larutan contoh dengan cara uji kualitatif. Analisis kuantitatif merupakan salah satu teknik analisis yang bertujuan untuk menentukan jumlah atau seberapa banyak suatu zat atau komponen zat.
Jumlah DNA didefinisikan dengan berat molekul bukan oleh volume. Untuk mengetahui jumlah DNA, maka DNA hasil isolasi harus dianalisis dengan spektrofotometer UV dengan panjang gelombang 260 nm. Kualitas DNA yang berhubungan dengan kemurnian terhadap kontaminan protein dapat dilihat dari perbandingan absorbansi suspensi DNA pada panjang gelombang 260 nm terhadap 280 nm. Penentuan panjang gelombang maksimum perlu dilakukan untuk mengetahui dimana terjadi absorpsi maksimum dan untuk meningkatkan proses absorpsi larutan terhadap sinar. Panjang gelombang yang digunakan untuk mengetahui kandungan DNA atau RNA menggunakan spektrofotometri UV adalah 260 nm, sedangkan untuk mengetahui kandungan protein menggunakan spektrofotometri UV dengan panjang gelombang 280 nm.
Rasio OD260 atau OD280 antara 1,8 - 2,0 mencerminkan DNA yang relatif murni dan terbebas dari kontaminan protein. Nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dapat dikonversikan menjadi konsentrasi, yaitu nilai 1 pada OD260 = 50 ug DNA rantai ganda tiap mililiter.
1.8. Blotting
Blot adalah suatu teknik memindahkan bagian protein yang telah dipisahkan, RNA atau DNA dari gel ke lembaran tipis atau matriks membran agar bagian protein tersebut mengalami imobilisasi. RNA Blotting dan DNA Blotting umumnya disebut dengan istilah Northern Blotting dan Southern Blotting.
1.8.1. Northern Blotting
Northern Blotting digunakan untuk menganalisis urutan RNA (RNA sequence) tertentu diantara kumpulan molekul RNA. Pada dasarnya metode ini adalah kombinasi dari denaturasi RNA elektroforesis gel dan staining. Dalam proses ini RNA dipisahkan berdasarkan ukuran dan kemudian ditransfer ke membran yang kemudian diperiksa dengan pelengkap berlabel urutan kepentingan. Hasilnya dapat digambarkan melalui berbagai cara tergantung pada label yang digunakan, namun hasil yang paling dalam penyataan band yang mewakili ukuran RNA terdeteksi dalam sampel. Intensitas band-band ini berkaitan dengan jumlah RNA target dalam sampel yang dianalisis. Prosedur ini umumnya digunakan untuk mempelajari kapan dan berapa banyak ekspresi gen yang terjadi dengan mengukur berapa banyak RNA hadir dalam sampel yang berbeda.
Langkah pertama dari metode ini adalah denaturasi atau pemisahan RNA di dalam sampel menjadi rantai tunggal. Hal ini memastikan bahwa rantai RNA tidak dalam posisi terlipat dan tidak terdapat ikatan diantara rantai molekul. Selanjutnya molekul RNA dipisahkan berdasarkan ukuran melalui metode gel elektroforesis. Setelah pemisahan, RNA ditransfer dari gel ke blot membran. Setelah itu membran dilalui proses probe, DNA atau RNA yang digunakan pada proses ini dipastikan harus memiliki urutan yang sesuai dengan urutan sampel. Dengan begitu, probe dapat terhibridisasi atau terikat pada pecahan RNA di membran. Setelah hibridisasi, probe mengizinkan molekul RNA yang diinginkan dapat terdeteksi diantara molekul RNA lainnya pada membran.
Gambar 5. Ilustrasi tahapan metode Northern Blotting
1.8.2. Southern Blotting
Southern Blotting adalah metode untuk menganalisis urutan DNA tertentu dalam sampel DNA. DNA sampel sebelum atau setelah pencernaan enzim restriksi dipisahkan dengan elektroforesis gel dan kemudian ditransfer ke membran dengan blotting melalui aksi kapiler. Membran tersebut kemudian dikenakan probe DNA berlabel yang memiliki urutan basa pelengkap untuk urutan DNA sampel.
Gambar 6. Ilustrasi tahapan metode Southern Blotting Metode ini digunakan untuk memindahkan protein DNA ke suatu pengangkut sehingga dapat dipisahkan, dan sering juga diikuti penggunaan suatu gel elektroforesis. Southern blot berkombinasi dengan elektroforesis gel agarosa untuk separasi ukuran DNA.
Southern blotting digunakan untuk penemuan gen dan pemetaan DNA, evolusi dan studi pengembangan, forensik dan diagnostik. Dalam tingkat genetik untuk memodifikasi pada
organisme. blot analysis bermanfaat untuk mengidentifikasi bentuk berbeda, menentukan memasukkan atau menyisipkan jumlah salinan dan untuk mendeteksi jumlah penyusunan DNA yang mengalami perubahan.
2.1. Kesimpulan
Analisis asam nukleat dapat dilakukan melalui uji kualitatif dan uji kuantitatif. Pada uji kualitatif, analisis asam nukleat ditujukan untuk mengetahui urutan DNA atau RNA yang ingin diuji dan mengidentifikasi keberadaan makromolekul. Dalam uji kuantitatif, dapat diperoleh konsentrasi DNA atau RNA sampel dan dapat dilakukan identifikasi DNA atau RNA tertentu terhadap molekul-molekul DNA atau RNA lain.
Terdapat banyak teknik analisis yang dapat digunakan untuk mendeteksi serta mempelajari makromolekul asam nukleat. Beberapa diantaranya adalah gel elektroforesis, molekul sequencing, staining, hibridisasi, sentrifugasi, spektrofotometri, dan blotting. Metode-metode analisis tersebut memungkinkan adanya pegamatan, pemisahan, dan penandaan molekul-molekul asam nukleat berupa DNA dan RNA.
Daftar Pustaka
Campbell NA, Reece JB. 2008. Biology. 8th ed. Upper Saddle River (NJ): BenjaminCummings. 1393 p.
Strachan T, Read AP. 1999. Human Molecular Genetics. 2nd edition. New York: Wiley-Liss.
Anonim. NA Detection and Indentification. [online] available at:
<http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-us/applications/AlternativeProductStructure_11756/> [accessed 17 February 2014]
Anonim. Northern Blotting. [online] available at:
<http://www.protocol-online.org/prot/Molecular_Biology/RNA/Northern_Blotting/> [accessed 17 February 2014]
Anonim. Northern Blotting. [online] available at:
<http://www.nature.com/scitable/definition/northern-blot-287> [accessed 17 February 2014]
Anonim. Nucleic Acid Electrophoresis. [online] available at: <http://www.bio-rad.com/en-us/applications-technologies/nucleic-acid-electrophoresis> [accessed 16 February 2014]
Anonim. Nucleic Acid Analysis. [online] available at: <http://www.bio-rad.com/en-us/applications-technologies/nucleic-acid-analysis> [accessed at 18 February 2014]
Guruatma, Khalsa, 2010. Mama Ji's Molecular Kitchen. [online] available at: < http://askabiologist.asu.edu/southern-blotting> [accessed 17 February 2014]
Theresa Phillips. Visualising DNA. [online] available at:
<http://biotech.about.com/od/buffersandmedia/tp/DNAStains.htm> [accessed 17 February 2014]
Theresa Phillips. DNA Sequencing Methods. [online] available at:
