SKRIPSI. Amelinda Angela F

PENGEMBANGAN DAN VALIDASI METODE ANALISIS

PENGHAMBATAN AKTIVITAS ENZIM ALFA AMILASE OLEH

PHASEOLAMIN DARI EKSTRAK WHITE KIDNEY BEAN

(PHASEOLUS VULGARIS) DI PT NUTRIFOOD INDONESIA

SKRIPSI

Amelinda Angela

F24070089

FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2011

ANALYTICAL METHOD DEVELOPMENT AND VALIDATION OF

PHASEOLAMIN FROM WHITE KIDNEY BEAN (PHASEOLUS VULGARIS)

EXTRACT INHIBITORY ACTIVITY AGAINST α-AMYLASE

IN PT NUTRIFOOD INDONESIA

Amelinda Angela and Dahrul Syah Department of Food Science and Technology,

Faculty of Agricultural Engineering and Technology, Bogor Agricultural University, IPB Darmaga Campus, PO BOX 220, Bogor, West Java, Indonesia

Phone: +62 818 089 789 46, E-mail: amelinda.angela@gmail.com

ABSTRACT

Phaseolamin is an α-amylase inhibitor extracted from white kidney bean (Phaseolus vulgaris). Some researches show that phaseolamin has several functional effects such as enhancing weight loss, decreasing body fat mass, decreasing waist circumference, decreasing energy intake, decreasing insulin level in blood, and increasing carbohydrate tolerance in diabetics. Based on its functions, phaseolamin can be developed as a functional food ingredient. PT Nutrifood Indonesia is one of the companies that use phaseolamin in their product. However, to maintain the product quality, phaseolamin inhibitory activity has to be determined. This research aims to determine the optimum phaseolamin and α-amylase preincubation condition, develop an analytical method to measure phaseolamin inhibitory activity against α-amylase that can be used in PT Nutrifood Indonesia, and validate the method. The parameters to determine an optimum preincubation condition were phaseolamin concentration and preincubation duration. This research used Bernfeld method to measure the reducing sugars, product from the reaction between α-amylase and starch, that can be used in a calculation to determine the α-amylase activity with and without the phaseolamin. The phaseolamin inhibitory activity is expressed as percentage of inhibition. The analytical method should be validated so it can be used in the company. The parameter that was used to validate was precision. The result showed that 20 mg/ml concentration of phaseolamin and 60 minute preincubation gave the optimum preincubation condition. According to the result, Relative Standard Deviation (RSD) of analysis was smaller than 0.67 times RSD of Horwitz. It showed that the analytical method can be used to measure phaseoamin inhibitory activity precisely.

AMELINDA ANGELA. F24070089. Pengembangan dan Validasi Metode Analisis Penghambatan Aktivitas Enzim Alfa Amilase oleh Phaseolamin dari Ekstrak White Kidney Bean

(Phaseolus Vulgaris) di PT Nutrifood Indonesia. Di bawah bimbingan Dahrul Syah. 2011

RINGKASAN

Karbohidrat merupakan salah satu zat gizi dalam pangan yang penting bagi manusia. Manusia memerlukan enzim α-amilase pada proses metabolisme karbohidrat untuk memecah senyawa sakarida yang kompleks menjadi senyawa sakarida sederhana yang mudah diserap oleh tubuh manusia. Namun, beberapa bahan pangan dikenal mengandung senyawa inhibitor yang dapat menurunkan aktivitas enzim amilase. Salah satu bahan pangan yang dikenal mengandung senyawa inhibitor α-amilase adalah kacang merah (Phaseolus vulgaris). Senyawa inhibitor tersebut kemudian dipurifikasi dan diberi nama phaseolamin.

PT Nutrifood Indonesia merupakan salah satu perusahaan yang memanfaatkan phaseolamin sebagai salah satu bahan baku dalam produknya. Produk tersebut diklaim dapat mengurangi penyerapan karbohidrat dengan adanya phaseolamin. Kualitas produk yang dihasilkan dapat dijamin dengan memperhatikan kualitas bahan baku yang digunakan. Salah satu parameter penting dalam menjaga kualitas produk berbahan baku phaseolamin yang dihasilkan oleh PT Nutrifood Indonesia adalah kualitas phaseolamin yang digunakan. Dalam hal ini, kualitas phaseolamin ditentukan berdasarkan aktivitas phaseolamin dalam menghambat aktivitas enzim α-amilase.

Metode pengukuran penghambatan phaseolamin terhadap aktivitas enzim α-amilase yang sudah ada memiliki variasi dalam kondisi preinkubasi enzim dan inhibitor yang digunakan. Oleh karena itu, perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk menentukan kondisi preinkubasi yang paling tepat dalam metode pengukuran tersebut. Selain itu, metode tersebut harus divalidasi agar hasil yang didapatkan dapat dipertanggung jawabkan. Tujuan dari magang penelitian ini adalah menghasilkan suatu metode analisis tervalidasi yang dapat mengukur besarnya penghambatan phaseolamin terhadap aktivitas enzim α-amilase, pada kondisi preinkubasi tertentu, sehingga dapat menjaga kualitas produk yang dihasilkan oleh PT Nutrifood Indonesia.

Enzim α-amilase (EC 3.2.1.1) merupakan enzim yang dapat memecah ikatan α-1,4-glikosidik pada pati dan menghasilkan glukosa, maltosa, atau dekstrin, serta glukoamilase. Aktivitas enzim α-amilase umumnya dapat diukur dengan dua cara yaitu dengan mengukur sisa pati yang tidak terhidrolisis oleh enzim amilase atau jumlah gula pereduksi yang dihasilkan oleh hidrolisis enzim α-amilase terhadap pati. Kedua cara tersebut dapat digunakan dalam mengukur penghambatan phaseolamin terhadap aktivitas enzim α-amilase. Di antara ketiga metode tersebut, metode yang paling sering digunakan dalam pengukuran aktivitas penghambatan phaseolamin terhadap enzim α-amilase adalah mengukur gula pereduksi yang terbentuk dengan reagen DNS.

Penghambatan aktivitas enzim α-amilase oleh phaseolamin dapat diukur dengan menginkubasikan terlebih dahulu enzim dan inhibitor tersebut. Konsentrasi inhibitor dan waktu preinkubasi yang digunakan dalam metode pengukuran yang dilakukan pada penelitian sebelumnya berbeda-beda. Oleh karena itu, perlu dilakukan percobaan untuk menentukan konsentrasi inhibitor dan waktu preinkubasi yang optimum dalam metode yang dikembangkan. Preinkubasi dilakukan pada pH 6.9 karena nilai pH tersebut sesuai dengan nilai pH cairan tubuh saat mengonsumsi phaseolamin meskipun bukan merupakan pH optimum untuk penghambatan.

Berdasarkan hasil yang diperoleh, persen penghambatan maksimum dihasilkan dengan konsentrasi phaseolamin sebesar 50 mg/ml dan waktu preinkubasi selama 80 menit. Sementara itu, persen penghambatan optimum didapatkan dari konsentrasi phaseolamin sebesar 20 mg/ml dan waktu preinkubasi selama 60 menit. Oleh karena itu, kondisi preinkubasi yang akan digunakan dalam metode ini adalah konsentrasi phaseolamin sebesar 20 mg/ml dan waktu preinkubasi selama 60 menit.

Validasi metode pengukuran aktivitas penghambatan phaseolamin terhadap aktivitas enzim α-amilase menggunakan parameter keseksamaan dan ketangguhan. Namun, parameter yang hanya dapat dilakukan adalah keseksamaan karena parameter ketangguhan membutuhkan analis dan laboratorium yang berbeda. Berdasarkan hasil yang diperoleh, RSD hasil perhitungan analisis (1.23) memiliki nilai yang lebih kecil dibandingkan dengan 0.67 kali RSD Horwitz (1.38). Hal ini menunjukkan bahwa

metode yang digunakan dapat mengukur aktivitas penghambatan phaseolamin terhadap enzim α-amilase secara seksama.

Metode ini memerlukan validasi lebih lanjut dengan parameter ketangguhan. Namun, karena keterbatasan analis dan laboratorium, maka parameter ketangguhan tidak dapat dilakukan. Oleh karena itu, perlu dilakukan validasi dengan parameter ketanguhan untuk menunjukkan bahwa metode ini cukup tangguh untuk dilakukan di laboratorium yang berbeda.

PENGEMBANGAN DAN VALIDASI METODE ANALISIS

PENGHAMBATAN AKTIVITAS ENZIM ALFA AMILASE OLEH

PHASEOLAMIN DARI EKSTRAK WHITE KIDNEY BEAN

(PHASEOLUS VULGARIS) DI PT NUTRIFOOD INDONESIA

SKRIPSI

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN

pada Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan,

Fakultas Teknologi Pertanian,

Institut Pertanian Bogor

Oleh

AMELINDA ANGELA

F24070089

FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2011

Judul Skripsi : Pengembangan dan Validasi Metode Analisis Penghambatan Aktivitas

Enzim Alfa Amilase oleh Phaseolamin dari Ekstrak White Kidney Bean (Phaseolus

vulgaris) di PT Nutrifood Indonesia

Nama : Amelinda Angela

NIM : F24070089

Menyetujui, Dosen Pembimbing,

(Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc.) NIP 19680505 199203.2.002

Mengetahui :

Plt Ketua Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan,

(Dr. Ir. Nurheni Sri Palupi, M.Si.) NIP 19610802 198703.2.002

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN

SUMBER INFORMASI

Saya menyatakan dengan sebenar-benarnya bahwa skripsi dengan judul Pengembangan dan Validasi Metode Analisis Penghambatan Aktivitas Enzim Alfa Amilase oleh Phaseolamin dari Ekstrak White Kidney Bean (Phaseolus Vulgaris) di PT Nutrifood Indonesia adalah hasil karya saya sendiri dengan arahan Dosen Pembimbing Akademik, dan belum diajukan dalam bentuk apapun pada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.

Bogor, Oktober 2011 Yang membuat pernyataan

Amelinda Angela F24070089

© Hak cipta milik Amelinda Angela, tahun 2011 Hak cipta dilindungi

Dilarang mengutip dan memperbanyak tanpa izin tertulis dari

Institut Pertanian Bogor, sebagian atau seluruhnya dalam bentuk apapun, baik cetak, fotokopi, mikrofilm, dan sebagainya.

BIODATA PENULIS

Amelinda Angela. Lahir di Pekanbaru, 16 Agustus 1990 dari ayah Harry Ng dan ibu Lennywati Teddy, sebagai putri kedua dari tiga bersaudara. Penulis menamatkan SMA pada tahun 2007 dari SMA Kristen 1 BPK PENABUR Jakarta dan pada tahun yang sama diterima di IPB melalui jalur Seleksi Penerimaan Mahasiswa Baru. Penulis memilih Program Studi Ilmu dan Teknologi Pangan, Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian. Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif dalam berbagai kegiatan termasuk menjadi asisten Praktikum Biokimia dan Kimia Pangan pada tahun 2010. Penulis juga mengikuti kegiatan pelatihan kepemimpinan “Leadership Scholarship 4” yang diselenggarakan oleh PT Nutrifood Indonesia pada tahun 2009 dan “Young Leaders of Indonesia 2010” yang diselenggarakan oleh McKinsey Company Indonesia. Penulis juga merupakan salah satu penerima beasiswa dari Tanoto Foundation pada tahun 2010. Pada tahun yang sama, penulis mengikuti lomba inovasi bisnis dan pangan “Univation of Padjajaran” yang diselenggarakan oleh Universitas Padjajaran dan memperoleh juara Harapan 2. Penulis juga mengikuti kompetisi “1st

Indonesian Food Bowl Quiz” pada tahun 2011 dan menjadi juara 3. Selain kompetisi di bidang pangan, penulis juga mengikuti lomba di bidang kewirausahaan tingkat internasional yaitu “POLYU Innovation and Entrepreneurship Global Student Challenge 2011” yang diselenggarakan oleh The Hong Kong Polythecnic University di Hong Kong. Penulis berhasil lolos ke babak semifinal dan iklan rencana bisnis yang diikutsertakan pada lomba yang sama juga berhasil terpilih menjadi lima iklan terbaik.

iii

KATA PENGANTAR

Puji dan syukur dipanjatkan ke hadapan Allah YME atas karuniaNya sehingga skripsi ini berhasil diselesaikan. Penelitian dengan judul Pengembangan dan Validasi Metode Analisis Penghambatan Aktivitas Enzim Alfa Amilase oleh Phaseolamin dari Ekstrak White Kidney Bean

(Phaseolus Vulgaris) dilaksanakan di PT Nutrifood Indonesia sejak bulan Februari sampai Juni 2011.

Dengan telah selesainya penelitian hingga tersusunnya skripsi ini, penulis ingin menyampaikan penghargaan dan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada:

1. Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc. sebagai dosen pembimbing atas saran dan bimbingan yang diberikan kepada penulis.

2. Dr. Ir. Slamet Budijanto, M.Agr. dan Dr. Ir. Endang Prangdimurti, M.Si. sebagai dosen penguji atas saran dan bimbingan yang diberikan kepada penulis.

3. Bapak Andri Camus sebagai pembimbing lapang atas kesempatan dan saran yang diberikan kepada penulis.

4. Orangtua, kakak, adik, serta keluarga penulis yang senantiasa memberikan dukungan kepada penulis.

5. Mbak Ratna, Mbak Momon, Mbak Ninuk, Mbak Eni, Mas Galih, Mas Bogie, Mbak Agnes, Teh Onah, Arif, Sigit, Rina, Mbak Nia, Mas Ijong, Kang Aris, Kang Jaji, Mbak Novi, Ibu Lucia, Mas Hujri, Kak Rosephin, Kak Rina, Kak Riza, dan berbagai pihak di divisi R&D PT Nutrifood Indonesia yang tidak dapat disebutkan satu per satu atas bantuan yang diberikan kepada penulis. 6. Marisa, Elisabeth, dan Trancy atas dukungan, saran, kritik, serta kebersamaannya selama masa

perkuliahan.

7. Daniel, Cherish, Michael, Iman, Reggie, Vita, Dinda, Belinda, Arum, Wima, Vendry, Arif, Mita, Mumun, Dela, Marvin, Ria, Bertha, Ronald, Eliana, Ricky Sinaga, Kak Manik, Khafid, Andreas, Andrew, dan teman-teman ITP 44 lainnya yang tidak dapat disebutkan satu per satu atas saran, bantuan, dukungan, dan kebersamaannya selama masa perkuliahan.

8. Hanna, Yuris, Wita, Laras, dan Taufik atas kebersamaannya selama praktik magang.

9. Merlinda, Christina, Charlie, Duta, Marine, Ivan A, Aileen, Vica, Stella, dan Renata atas perhatian dan dukungan yang diberikan kepada penulis.

Akhirnya penulis berharap semoga tulisan ini bermanfaat dan memberikan kontribusi yang nyata terhadap perkembangan ilmu pengetahuan di bidang pangan.

Bogor, Oktober 2011

iv

DAFTAR ISI

Halaman

KATA PENGANTAR ...iii

DAFTAR TABEL ... v

DAFTAR GAMBAR ... vi

DAFTAR LAMPIRAN ... vii

I. PENDAHULUAN ... 1

A. LATAR BELAKANG ... 1

B. TUJUAN ... 3

II. PROFIL PERUSAHAAN ... 4

III. TINJAUAN PUSTAKA ... 7

A. INHIBITOR ENZIM ... 7

B. PHASEOLAMIN ... 8

C. VALIDASI METODE ... 11

IV. METODE PENELITIAN... 14

A. ALAT DAN BAHAN ... 14

B. PELAKSANAAN EKSPERIMEN ... 14

V. HASIL DAN PEMBAHASAN ... 17

A. KONSENTRASI OPTIMUM INHIBITOR ... 17

B. WAKTU OPTIMUM PREINKUBASI ... 19

C. VALIDASI METODE ANALISIS ... 22

VI. SIMPULAN ... 26

VII. REKOMENDASI ... 27

DAFTAR PUSTAKA ... 28

v

DAFTAR TABEL

Halaman Tabel 1. Aktivitas penghambatan phaseolamin terhadap α-amilase dari berbagai sumber...10 Tabel 2. Parameter analitik yang harus dipertimbangkan untuk tipe prosedur analitik yang

berbeda...23 Tabel 3. Hasil uji keseksamaan keterulangan persen penghambatan phaseolamin

terhadap aktivitas enzim α-amilase...24 Tabel 4. Rekomendasi keseksamaan dari APVMA (2004)...25

vi

DAFTAR GAMBAR

Halaman Gambar 1. Phaseolus vulgaris...2

Gambar 2. Enam brand unggulan PT Nutrifood Indonesia...5 Gambar 3. Grafik teoretikal (1/v terhadap 1/[S]) untuk enzim Michaelian dengan dan

tanpa kehadiran inhibitor...7 Gambar 4. Struktur rantai karbon α unit monomer α-AI1 (merah) dan LoLI (biru)...9 Gambar 5. Diagram alir pelaksanaan eksperimen...14 Gambar 6. Penghambatan aktivitas enzim α-amilase oleh inhibitor α-amilase yang

dipurifikasi dari Phaseolus vulgaris...17 Gambar 7. Grafik hubungan antara konsentrasi phaseolamin dengan persen

penghambatan aktivitas enzim α-amilase hasil percobaan...18 Gambar 8. Struktur kompleks enzim α-amilase dengan α-AI1...19 Gambar 9. Plot Lineweaver-Bulk enzim α-amilase tanpa dan dengan inhibitor α-AI1...20 Gambar 10. Rantai samping enzim dan inhibitor yang terlibat dalam pembentukan kompleks.21 Gambar 11. Grafik hubungan antara waktu preinkubasi dengan persen penghambatan

vii

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman Lampiran 1. Data percobaan konsentrasi optimum inhibitor...32 Lampiran 2. Data percobaan waktu optimum preinkubasi...34 Lampiran 3. Hasil analisis ragam data percobaan konsentrasi optimum inhibitor

(10, 20, 30, 40, dan 50 mg/ml)...36 Lampiran 4. Hasil analisis ragam data percobaan waktu optimum preinkubasi

I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Karbohidrat merupakan salah satu zat gizi dalam pangan yang penting bagi manusia. Manusia memerlukan enzim α-amilase pada proses metabolisme karbohidrat untuk memecah senyawa sakarida yang kompleks menjadi senyawa sakarida sederhana yang mudah diserap oleh tubuh manusia. Namun, beberapa bahan pangan dikenal mengandung senyawa inhibitor yang dapat menurunkan aktivitas enzim α-amilase.

Salah satu bahan pangan yang dikenal mengandung senyawa inhibitor α-amilase adalah

white kidney bean (Phaseolus vulgaris) (Jaffe et al. 1973). Menurut Jenkins et al. (1986) diacu

dalam Thompson dan Gabon (1987), laju pencernaan karbohidrat pada white kidney bean (Phaseolus vulgaris) lebih rendah, secara in vivo dan in vitro, dibandingkan dengan roti gandum. Hal ini dapat disebabkan oleh adanya, selain senyawa antinutrisi, senyawa inhibitor enzim α-amilase yang terkandung dalam white kidney bean. Senyawa inhibitor tersebut kemudian dipurifikasi dan diberi nama phaseolamin (Marshall dan Lauda 1975).

Gambar 1. Phaseolus vulgaris

Menurut Marshall dan Lauda (1975), sebagian besar senyawa inhibitor yang berasal dari tanaman, termasuk phaseolamin, tidak memiliki aktivitas dalam penghambatan enzim α-amilase pada tanaman, sehingga dapat disimpulkan bahwa senyawa inhibitor tersebut tidak berperan dalam mengatur aktivitas α-amilase dalam tanaman tersebut. Sementara itu, senyawa-senyawa inhibitor tersebut aktif dalam menghambat aktivitas enzim α-amilase pada serangga dan binatang lainnya, sehingga dapat disimpulkan bahwa senyawa-senyawa inhibitor tersebut berfungsi dalam memberikan perlindungan kepada tanaman terhadap serangan serangga dan binatang.

Dewasa ini, pangan yang memiliki laju penyerapan karbohidrat yang tinggi sangat dihindari. Laju penyerapan karbohidrat pada suatu bahan pangan yang tinggi yang tinggi dapat memicu penyakit diabetes mellitus (Crapo 1984). Gunawan dan Tandra (1998) diacu dalam Marsono et al. (2005) menyatakan bahwa terjadi peningkatan prevalensi penyakit diabetes mellitus

2 di Indonesia dan diperkirakan penderitanya di Indonesia mencapai lima juta pada tahun 2020. Pencegahan penyakit ini dapat dilakukan dengan pengaturan diet yang tepat, yaitu membatasi asupan kalori dan memilih makanan yang memiliki Indeks Glisemik yang rendah karena makanan tersebut dapat memberikan respon glukosa yang rendah setelah dikonsumsi.

Pada studi awalnya, phaseolamin dinilai potensial sebagai anti-obesitas dan anti-diabetes atau disebut juga sebagai senyawa starch blockers. Senyawa starch blockers merupakan senyawa yang dapat menghambat pemecahan senyawa karbohidrat yang terdapat dalam bahan pangan dan menyebabkan penurunan daya cerna karbohidrat sehingga terjadi penurunan energi yang dihasilkan oleh karbohidrat atau penurunan laju penyerapan glukosa dalam tubuh (Celleno et al. 2007). Namun, pada tahun 1980, studi lebih lanjut menemukan bahwa ekstrak senyawa inhibitor komersial tidak mempengaruhi pencernaan pati karena rendahnya aktivitas penghambatan α-amilase dalam tubuh manusia dan adanya lektin dan tripsin inhibitor dalam ekstrak tersebut (Rosenberg 1982 diacu dalam Tormo et al. 2004).

Perkembangan lebih lanjut, dengan metode ekstraksi yang lebih baik seperti ekstraksi karbon dioksida, fraksinasi, dan perlakuan panas, menghasilkan senyawa starch blockers yang efektif dalam tubuh manusia, seperti beberapa senyawa phaseolamin komersial yang ada sekarang ini. Salah satu senyawa phaseolamin komersial menunjukkan fungsi yang potensial sebagai solusi terapi dalam mengatasi obesitas dan hipertrigliseridemia (Udani et al. 2004). Oleh karena itu, phaseolamin memilki sifat fungsional yang dapat dikembangkan menjadi suatu bahan baku produk pangan fungsional.

PT Nutrifood Indonesia merupakan salah satu perusahaan yang memanfaatkan phaseolamin sebagai salah satu bahan baku dalam produknya. Produk tersebut diklaim dapat mengurangi penyerapan karbohidrat dengan adanya phaseolamin. Kualitas produk yang dihasilkan dapat dijamin dengan memperhatikan kualitas bahan baku yang digunakan. Kualitas bahan baku dapat ditentukan berdasarkan fungsi bahan baku tersebut dalam produk. Oleh karena itu, salah satu parameter penting dalam menjaga kualitas produk berbahan baku phaseolamin yang dihasilkan oleh PT Nutrifood Indonesia adalah kualitas phaseolamin yang digunakan. Dalam hal ini, kualitas phaseolamin ditentukan berdasarkan aktivitas phaseolamin dalam menghambat aktivitas enzim α-amilase.

Metode pengukuran penghambatan phaseolamin terhadap aktivitas enzim α-amilase yang sudah ada memiliki variasi dalam kondisi preinkubasi enzim dan inhibitor yang digunakan. Oleh karena itu, perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk menentukan kondisi preinkubasi yang paling tepat dalam metode pengukuran tersebut. Validasi metode umumnya dilakukan oleh lembaga-lembaga penerima jasa analisis atau lembaga pendidikan. Selain lembaga-lembaga yang disebutkan, laboratorium penguji di suatu perusahaan juga harus mengunakan metode tervalidasi karena validasi metode merupakan bagian penting dalam jaminan mutu hasil pengujian dalam suatu laboratorium. Dalam hal ini, hal yang perlu diperhatikan, antara lain: (1) Penggunaan metode, misal metode baku, metode non-baku, dan modifikasi metode baku, (2) IQC (Internal

Quality Control), (3) Pemenuhan terhadap persyaratan ISO/IEC 17025:2005, dan (4) Partisipasi

dalam uji profisiensi.

Laboratorium penguji di PT Nutrifood Indonesia sudah terakreditasi dan memiliki sertifikat ISO/IEC 17025:2005. Oleh karena itu, metode yang digunakan atau yang akan dikembangkan di laboratorium tersebut harus divalidasi. Metode pengukuran penghambatan phaseolamin terhadap aktivitas enzim α-amilase merupakan pengembangan dari metode non-baku, sehingga validasi perlu dilakukan agar hasil yang didapatkan dapat dipertanggung jawabkan.

3

B. Tujuan

Tujuan dari magang penelitian ini adalah menghasilkan suatu metode analisis tervalidasi yang dapat mengukur besarnya penghambatan phaseolamin terhadap aktivitas enzim α-amilase, pada kondisi preinkubasi tertentu, sehingga dapat menjaga kualitas produk yang dihasilkan oleh PT Nutrifood Indonesia.

II. PROFIL PERUSAHAAN

Berdiri sejak tahun 1979, PT Nutrifood Indonesia memproduksi dan memasarkan berbagai produk makanan dan minuman kesehatan berkualitas internasional dengan berbagai merek terkemuka. Kantor pusat Nutrifood berada di Jakarta. Nutrifood memiliki jaringan distribusi yang menjangkau lebih dari tiga puluh negara di dunia. Nutrifood adalah perusahaan yang secara inovatif menginspirasi dan membantu setiap individu untuk mencapai keseimbangan hidup dengan menjalankan pola hidup sehat yang menyenangkan dan memperhatikan asupan nutrisi sehingga dapat menikmati hidup sehat lebih lama

Kegiatan PT Nutriood Indonesia didukung oleh tiga pilar: 1. Produk dan layanan berkualitas

Nutrifood secara inovatif menyediakan produk dan layanan premium yang bermutu tinggi, memberi kemudahan dan menyenangkan, serta efektif berdasarkan pendekatan ilmiah.

2. Manajemen yang profesional

Nutrifood didukung oleh tim ahli yang profesional serta memiliki komitmen tinggi, berpengalaman dan inovatif dalam memaksimalkan kualitas produk dan layanan.

3. Program yang melibatkan pemangku kepentingan

Nutrifood secara inovatif dan proaktif melakukan edukasi dan promosi gaya hidup sehat dan bernutrisi yang melibatkan pemangku kepentingan utama (key stakeholders).

Nutrifood berusaha untuk menjadi pionir dan pemimpin pasar dalam memberikan solusi atau cara yang tepat kepada pelanggan kami untuk meraih kehidupan yang lebih sehat, lebih nikmat dan penuh arti, baik untuk saat ini maupun di masa mendatang. Untuk mewujudkan misi tersebut, Nutrifood berusaha memahami pelanggan dalam setiap fase kehidupan yang dialaminya, mengidentifikasi kebutuhan unik mereka, dan memberikan solusi; terutama melalui produk dan pelayanan bernutrisi untuk meraih kehidupan yang lebih sehat dan berkualitas. Nutrifood hadir untuk menginspirasi kehidupan yang bernutrisi.

Nilai-nilai bisnis utama dari Nutrifood adalah :

 Nutrifood menekankan pada integritas dan keberlangsungan bisnis jangka panjang. Nutrifood berusaha mempertimbangkan dampak jangka panjang dalam setiap pengambilan keputusan, berkomitmen dalam memberikan solusi yang telah teruji efektif.

 Nutrifood bergerak sebagai boutique company yang memiliki karakter, unik, inovatif, dan premium.

 Nutrifood percaya bahwa pencegahan lebih baik daripada mengobati. Oleh karena itu, Nutrifood memberikan produk dan jasa yang bersifat preventif untuk dimanfaatkan oleh pelanggan.

 Nutrifood percaya bahwa kesehatan dan kenikmatan dapat berjalan selaras. Berbagai produk dan jasa yang diberikan merupakan kombinasi dari sesuatu yang sehat, nikmat dan mudah untuk dikonsumsi.

Dalam menjalankan setiap aktivitasnya, Nutrifood selalu berpegang pada prinsip I-CARE, yaitu:

 Integrity: Dapat diandalkan dan konsisten dalam nilai pribadi, pekerjaan dan universal.  Collaboration: Bekerjasama untuk mencapai tujuan bersama.

 innovAtion: Berpikir kreatif dan berinovasi.  Respect: Menghargai perbedaan.

5 Beberapa sertifikasi yang telah didapatkan oleh PT Nutrifood Indonesia, yaitu:

 1994 : Nutrifood mendapat sertifikat ISO 9002 :1987, sekaligus menjadi perusahaan makanan pertama di Indonesia yang mendapat ISO.

 1997 : National Sales mendapatkan sertifikat ISO 9002:1994  2001 : Laboratorium mendapatkan sertifikat ISO 17025:2000  2005 : Holding company mendapat sertifikat ISO 9001:2000

 2005 : National Sales mendapatkan kembali sertifikat ISO 9001:2000  2008 : Manufaktur Nutrifood mendapat sertifikat ISO 22000:2005

 2008 : Laboratorium mendapatkan kembali sertifikat ISO/IEC 17025:2005  2009 : Nutrifood non manufaktur mendapat sertifikat ISO 9001:2008

 2010 : Sertifikasi sistem jaminan halal dari LP-POM MUI, sedangkan Sertifikat Halal bagi semua produk Nutrifood didapatkan sesuai tahun peluncurannya.

Gambar 2. Enam brand unggulan PT Nutrifood Indonesia

PT Nutrifood Indonesia bersama keenam brand unggulannya memiliki komitmen untuk memberikan kontribusi positif kepada masyarakat dan lingkungan. Berikut adalah keenam brand unggulan PT Nutrifood Indonesia:

1. Tropicana Slim

Tropicana Slim (TS) terdiri dari berbagai produk bebas gula, susu tanpa lemak, pelengkap masakan, dan healthy meal, seperti TS Gula Rendah Kalori Classic, TS Corn Oil, dan DiabetaMil. 2. HiLo

Susu HiLo memiliki beberapa varian yang diformulasikan khusus untuk memenuhi kebutuhan nutrisi di usia masing-masing, seperti HiLo School, HiLo Teen, HiLo Active, dan HiLo Gold. 3. NutriSari

NutriSari terdiri dari tiga varian produk, yaitu NutriSari Ready to Drink, NutriSari Jelly, dan NutriSari Serbuk dengan berbagai varian rasa.

4. L-Men

6 5. WRP

Memiliki serangkaian produk yang dirancang untuk menurunkan dan mempertahankan berat badan, membentuk tubuh, mempercantik kulit, dan membantu diet bagi ibu menyusui, seperti WRP Nutritious Drink, WRP Diet Tea, WRP skin 2 C, dan WRP New Mom.

6. WRP Diet Center

WRP Diet Center merupakan sebuah diet center moderen yang menyediakan serangkaian solusi efektif serta prasarana lengkap untuk meraih penampilan tubuh yang sempurna melalui metode pembentukan tubuh dan perawatan kulit yang sehat, aman, dan dirancang khusus untuk setiap individu.

III. TINJAUAN PUSTAKA

A. Inhibitor Enzim

Enzim merupakan protein yang memiliki aktivitas katalitik yang aktif secara spesifik. Spesifitas enzim disebabkan oleh adanya sisi aktif enzim yang hanya dapat mengikat molekul substrat tertentu. Terdapat enam jenis enzim berdasarkan reaksi kimia yang dikatalisis, yaitu oksidoreduktase, transferase, hidrolase, liase, isomerase, dan ligase. Enzim α-amilase termasuk dalam jenis enzim hidrolase karena memerlukan air dalam memecah ikatan spesifik α-1,4-glikosidik. Beberapa faktor yang dapat mempengaruhi aktivitas enzim adalah konsentrasi substrat, konsentrasi enzim, pH, suhu, aw, kofaktor enzim, dan inhibitor (Whitaker 1996).

Inhibitor merupakan senyawa yang dapat menghambat aktivitas enzim saat ditambahkan ke dalam reaksi enzim-substrat. Terdapat dua jenis inhibitor, yaitu inhibitor reversibel dan irreversibel. Inhibitor reversibel dapat dengan cepat membentuk kompleks ekuilibrium difusi non-kovalen terkontrol dengan enzim dan kompleks ini dapat terdisosiasi dengan dialisis atau filtrasi gel. Sementara itu, inhibitor irreversibel membentuk ikatan kovalen dengan enzim yang tidak dapat terdisosiasi (Lehninger 1990).

Terdapat empat jenis penghambatan oleh inhibitor reversibel, yaitu penghambatan kompetitif, non-kompetitif, unkompetitif, dan alosterik. Inhibitor kompetitif umumnya memiliki struktur yang menyerupai substratnya sehingga inhibitor juga dapat mengikat sisi aktif enzim dan menghambat perubahan substrat oleh enzim. Penghambatan ini dapat dikurangi dengan menambahkan konsentrasi substrat. Sementara itu, inhibitor non-kompetitif berikatan pada enzim di luar sisi aktifnya sehingga penambahan substrat tidak mempengaruhi aktivitas penghambatan enzim (Suhartono 1989).

Gambar 3. Grafik teoretikal (1/v terhadap 1/[S]) untuk enzim Michaelian dengan dan tanpa kehadiran inhibitor (Stojan 2005)

Inhibitor unkompetitif merupakan senyawa yang berikatan secara reversibel dengan kompleks enzim-substrat dan tidak dapat berikatan dengan molekul enzim bebas (Suhartono

1/[Konsentrasi Substrat]

Tanpa inhibitor Unkompetitif Non-kompetitif

8 1989). Penghambatan alosterik terjadi saat inhibitor berikatan dengan enzim multi-subunit (Whitaker 1996).

Beberapa organisme melibatkan inhibitor dalam sistem pengaturan metabolik dan fisiologis sehingga beberapa inhibitor terdapat secara alami. Inhibitor tripsin umumnya terdapat pada sereal dan kacang-kacangan. Sementara itu, terdapat tiga jenis inhibitor α-amilase alami, yaitu protein yang diproduksi oleh tanaman seperti sereal dan kacang-kacangan, polipeptida sederhana yang diproduksi oleh beberapa spesies Streptomyces, dan karbohidrat sederhana yang mengandung N yang diproduksi oleh Streptomyces (Ho et al. 1994 diacu dalam Whitaker 1996).

B. Phaseolamin

White kidney bean (Phaseolus vulgaris) mengandung senyawa yang dapat menghambat

aktivitas enzim α-amilase secara non-kompetitif. Senyawa inhibitor tersebut memiliki tiga bentuk, yaitu isoform 1 (α-AI1), isoform 2 (α-AI2), dan α-amylase inhibitor like (α-AIL). Senyawa yang memiliki aktivitas anti α-amilase pada manusia dan terdapat paling banyak pada white kidney bean adalah isoform α-AI1 (Iguti dan Lajolo 1991 diacu dalam Obiro et al. 2008). Senyawa ini dikenal luas sebagai phaseolamin.

Pada tanaman Phaseolus vulgaris, phaseolamin hanya ditemukan di bagian biji dan terkonsentrasi pada aksis. Jumlahnya di dalam aksis tiga kali lipat dibandingkan dengan jumlahnya di dalam kotiledon biji (Moreno 1990 diacu dalam Obiro et al. 2008). Menurut Moreno dan Chrispeels (1989) diacu dalam Obiro et al. (2008), phaseolamin terakumulasi dalam biji white

kidney bean sejumlah 9-11% dari protein biji. Persentase ini dapat menggambarkan rendemen

phaseolamin yang dihasilkan dari ekstraksi white kidney bean, meskipun metode ekstraksi juga menentukan jumlah rendemen yang dihasilkan. Selain itu, jumlah phaseolamin yang didapatkan dari white kidney bean yang sudah dikeringkan juga berkurang, sehingga phaseolamin lebih baik diekstrak dari white kidney bean yang tidak mengalami perlakuan pengeringan (Moreno 1990 diacu dalam Obiro et al. 2008).

Pada penelitian yang dilakukan oleh Marshall dan Lauda (1975) dan Lee et al. (2002), phaseolamin didapatkan dari proses purifikasi ekstrak white kidney bean (Phaseolus vulgaris) varietas Great Northern. Proses purifikasi tersebut mencakup lima tahap, yaitu ektraksi kasar, pemanasan, dialysis, kromatografi DEAE-cellulose, kromatografi Sephadex G-100, dan kromatografi CM-cellulose.

Phaseolamin merupakan senyawa glikoprotein dengan berat molekul sebesar 56,7 kDa (Lee dan Whitaker 2000 diacu dalam Obiro et al. 2008). Phaseolamin juga cenderung tidak larut dalam etanol 70% dan aktivitas penghambatannya terhadap enzim α-amilase hilang setelah dipanaskan pada suhu 100oC. Phaseolamin dengan konsentrasi sebesar 1,08 mg/ml tidak memiliki kemampuan untuk menggumpalkan sel darah merah manusia, meskipun ekstrak kasar white kidney bean dengan konsentrasi sebesar 0,02 mg/ml, dalam kondisi yang sama, dapat menggumpalkan sel darah merah manusia (Marshall dan Lauda 1975).

Phaseolamin mengandung kurang lebih 10% karbohidrat (Marshall dan Lauda 1975). Namun, menurut Sawada et al. (2002) diacu dalam Obiro et al. (2008), kompleks N-glikosilasi pada phaseolamin tidak memiliki efek terhadap aktivitas penghambatannya karena kompleks tersebut berada pada posisi yang tidak berinteraksi dengan enzim α-amilase saat pembentukan kompleks enzim-inhibitor. Selain itu, Gibbs dan Alli (1998) diacu dalam Obiro et al. (2008) juga menyatakan bahwa penghilangan gugus karbohidrat pada phaseolamin tidak memberi pengaruh

9 terhadap aktivitas penghambatannya. Gambar 4 menunjukkan struktur phaseolamin yang ditumpuk dengan struktur Lathyrus ochrus Isolektin I (LoLI) untuk membandingkan kedua struktur. Ion logam dan rantai samping asam amino yang terlibat dalam pengikatan karbohidrat oleh lektin berwarna kuning, sedangkan residu yang berinteraksi dengan sisi aktif enzim α-amilase berwarna hijau. Lokasi ketiga gugus N-glikosilasi ditunjukkan dengan warna ungu.

Gambar 4. Struktur rantai karbon α unit monomer α-AI1 (merah) dan LoLI (biru) (Bompard-Gilles et al. 1996)

Beberapa penelitian menunjukkan bahwa aktivitas penghambatan phaseolamin terhadap enzim α-amilase bergantung pada pH, suhu, waktu inkubasi, dan adanya ion-ion pada saat interaksi antara enzim dan inhibitor berlangsung (Obiro 2008). Nilai pH optimum penghambatan adalah 4,5 (Le Berre-Anton et al. 1997 diacu dalam Obiro et al. 2008), 5,5 (Marshall dan Lauda 1975), dan 5,0 (Kotaru et al. 1987 diacu dalam Obiro et al.2008). Suhu optimum penghambatan adalah 37oC.

Waktu inkubasi yang dibutuhkan untuk mencapai penghambatan optimum tergantung pada pH yang digunakan. Le Berre-Anton et al. (1997) diacu dalam Obiro et al. (2008) menyatakan bahwa waktu inkubasi optimum adalah 10 menit pada nilai pH optimum untuk penghambatan, yaitu 4,5. Sementara itu, Marshall dan Lauda (1975) menyatakan bahwa waktu inkubasi optimum adalah 20 menit pada nilai pH optimum aktivitas α-amilase, yaitu 6,9. Waktu inkubasi yang lebih lama pada nilai pH 6,9 menunjukkan bahwa inhibitor harus dikonsumsi sebelum atau dengan makanan untuk mencapai kondisi penghambatan secara in vivo (Obiro 2008).

Beberapa jenis ion mempengaruhi aktivitas penghambatan. Lajolo dan Filho (1985) diacu dalam Obiro et al. (2008) menyatakan nahwa peningkatan aktivitas penghambatan phaseolamin terhadap amilase saliva dipengaruhi oleh keberadaain ion-ion dengan urutan sebagai berikut: nitrat > klorida > bromida > iodida > tiosianat. Gibbs dan Alli (1998) diacu dalam Obiro et al. (2008) menyatakan bahwa ion klorida penting untuk mencapai penghambatan maksimum dan ion kalsium meningkatakan laju inisial pengikatan inhibitor terhdapa amilase. Mereka juga menyatakan bahwa ion-ion K, Mg, sulfat, dan Na tidak berpengaruh dalam aktivitas penghambatan dan begitu pula peningkatan kekuatan ionik.

Phaseolamin hanya memiliki aktivitas penghambatan spesifik terhadap enzim α-amilase yang berasal dari saliva manusia, pankreas manusia, dan pankreas babi. Aktivitas enzim α-amilase yang berasal dari tanaman dan mikroorganisme tidak dipengaruhi oleh phaseolamin. Tabel 1

10 menunjukkan aktivitas penghambatan phaseolamin terhadap enzim α-amilase yang berasal dari berbagai sumber. Adanya sedikit efek penghambatan terhadap enzim α-amilase yang berasal dari

Bacillus amyloliquefaciens dapat disebabkan oleh sisa-sisa enzim proteolitik saat menyiapkan

enzim bakteri tersebut (Marshall dan Lauda, 1975).

Tabel 1. Aktivitas penghambatan phaseolamin terhadap α-amilase dari berbagai sumber (Marshall dan Lauda, 1975)

Sumber α-amilase Aktivitas Penghambatan* (%)

Bacillus amyloliquefaciens 3 Bacillus subtilis 0 Bacillus licheniformis 0 Aspergillus oryzae 3 Barley malt 0 Rye 0 Helix pomatia 97 Pankreas babi 97 Saliva manusia 94 Pankreas manusia 100

*Perbandingan dengan aktivitas enzim α-amilase kontrol tanpa inhibitor

Penelitian tentang mekanisme penghambatan phaseolamin terhadap enzim α-amilase menunjukkan bahwa senyawa inhibitor secara efektif menghambat penyerapan karbohidrat dengan mencegah akses substrat terhadap bagian aktif enzim (Obiro et al. 2008). Kompleks inhibitor-enzim sebagian besar terbentuk oleh ikatan hidrogen, ikatan hidrofobik, dan ikatan antar protein (Bompard-Gilles et al. 1996 diacu dalam Obiro et al. 2008).

Menurut Obiro et al. (2008), berdasarkan beberapa penelitian terkini, phaseolamin dapat diaplikasikan sebagai inhibitor enzim α-amilase secara in vivo. Beberapa efek fungsional yang diberikan oleh phaseolamin terhadap manusia, antara lain menurunkan berat badan dan mengecilkan lingkar pinggang (Wu 2010), menurunkan massa lemak dalam tubuh (Celleno et al. 2007), dan menurunkan kadar insulin dalam plasma darah sehingga memiliki aktivitas anti-diabetes (Boivin et al. 1987 diacu dalam Obiro et al. 2008; Udani et al. 2004).

Beberapa studi telah dilakukan terkait toksisitas phaseolamin baik secara akut maupun kronis. Toksisitas akut merupakan respon toksisitas yang langsung muncul setelah dikonsumsi dan diinduksi dalam sekali pemaparan. Toksisitas akut diukur berdasarkan nilai dosis letal (LD50), yaitu jumlah dosis yang menyebabkan kematian subjek uji sebesar 50% dari populasi setelah satu kali mengonsumsi senyawa tersebut (Pariza 1996 dalam Obiro et al. 2008). Menurut Harikumar et

al. 2005 diacu dalam Obiro et al. 2008), tidak ada toksisitas akut yang teramati secara evaluasi

klinis, biokimia dan histopatologikal analisis pada level sekali konsumsi phaseolamin.

Pengukuran toksisitas kronis membutuhkan waktu studi yang lebih lama, umumnya 20-24 bulan, dengan pemberian phaseolamin kepada tikus percobaan secara kontinu. Dosis toleransi maksimum adalah level dimana sampel dapat diberikan kepada binatang tanpa memicu tanda-tanda toksisitas yang terlihat jelas (Pariza 1996 diacu dalam Obiro et al. 2008). Hasil-hasil penelitian menunjukkan bahwa phaseolamin yang memiliki aktivitas sebesar 3000 unit α-amilase inhibitor/g, < 3400 unit hemaglutinasi/g dan < 40 unit tripsin inhibitor aman dikonsumsi pada level

11 subkronis 85 mg/kg berat badan per hari atau 6,0 g untuk individu dengan berat badan sebesar 70 kg (Obiro et al. 2008).

Enzim α-amilase (EC 3.2.1.1) merupakan enzim yang dapat memecah ikatan α-1,4-glikosidik pada pati dan menghasilkan glukosa, maltosa, atau dekstrin, serta glukoamilase. Aktivitas enzim α-amilase umumnya dapat diukur dengan dua cara yaitu dengan mengukur sisa pati yang tidak terhidrolisis oleh enzim α-amilase atau jumlah gula pereduksi yang dihasilkan oleh hidrolisis enzim α-amilase terhadap pati. Kedua cara tersebut dapat digunakan dalam mengukur penghambatan phaseolamin terhadap aktivitas enzim α-amilase (Fossum dan Whitaker 1974).

Metode yang digunakan Fuwa (1954), Marshall dan Lauda (1975), dan Xiao et al. (2006) dalam mengukur aktivitas enzim α-amilase adalah dengan mengukur warna kompleks iodin dengan pati. Semakin besar aktivitas penghambatan phaseolamin, maka jumlah pati yang terhidrolisis semakin sedikit sehingga komplek iodin dengan pati yang terbentuk semakin banyak dan menghasilkan warna biru. Warna kompleks tersebut dapat dikuantifikasi dengan pengukuran menggunakan spektrofotometer.

Metode lain yang dapat digunakan adalah pengukuran gula pereduksi yang terbentuk akibat hidrolisis pati oleh enzim α-amilase. Terdapat dua pereaksi yang umum digunakan dalam pengukuran gula pereduksi, yaitu reagen DNS (Fossum dan Whitaker 1974, Lee et al. 2002, dan Xiao et al. 2006) dan alkaline copper (Fuwa 1954, Green III et al. 1989, dan Roychan dan Chaudari 2001). Kedua pereaksi ini dapat bereaksi dengan gula pereduksi yang terbentuk dan menghasilkan komples warna yang juga dapat dikuantifikasi dengan pengukuran menggunakan spektrofotometer. Adanya penghambatan aktivitas enzim α-amilase oleh phaseolamin dapat diamati oleh perbedaan nilai absorbansi yang dihasilkan.

Di antara ketiga metode tersebut, metode yang paling sering digunakan dalam pengukuran aktivitas penghambatan phaseolamin terhadap enzim α-amilase adalah mengukur gula pereduksi yang terbentuk dengan reagen DNS. Penghambatan aktivitas enzim α-amilase oleh phaseolamin dapat diukur dengan menginkubasikan terlebih dahulu enzim dan inhibitor tersebut. Konsentrasi inhibitor dan waktu preinkubasi yang digunakan dalam metode pengukuran yang dilakukan oleh Fossum dan Whitaker (1974), Lee et al. (2002), dan Xiao et al. (2006) berbeda-beda. Oleh karena itu, perlu dilakukan percobaan untuk menentukan konsentrasi inhibitor dan waktu preinkubasi yang optimum dalam metode yang dikembangkan. Preinkubasi dilakukan pada pH 6.9 karena nilai pH tersebut sesuai dengan nilai pH cairan tubuh saat mengonsumsi phaseolamin meskipun bukan merupakan pH optimum untuk penghambatan.

C. Validasi Metode

Validasi metode analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya (Harmita 2004). Validasi metode meliputi penentuan parameter statistik suatu metode untuk menentukan kecocokan penggunaan metode tersebut untuk tujuan tertentu. Sebagian besar metode divalidasi sesuai dengan konsensus standar organisasi. Menurut International Conference on Harmonisation (1995), terdapat sepuluh parameter yang dapat digunakan dalam menentukan validitas suatu metode, yaitu kecermatan, keseksamaan, spesifitas, batas deteksi, batas kuantitasi, linearitas, jangkauan, ketangguhan, kekuatan, dan sensitivitas.

12 1. Kecermatan

Kecermatan adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analis dengan kadar analit yang sebenarnya (Harmita 2004). Kecermatan suatu metode bergantung pada sebaran galat sistematik di dalam tahapan metode tersebut. Oleh karena itu, galat sistematik harus dikurangi untuk mendapatkan metode dengan kecermatan yang tinggi. Beberapa cara untuk mengurangi galat sistematik, antara lain menggunakan peralatan yang telah dikalibrasi, menggunakan pereaksi dan pelarut standar, dan pelaksanaannya yang cermat sesuai prosedur.

Kecermatan dapat ditentukan dengan berbagai cara, seperti melakukan percobaan recovery, prosedur kalibrasi adisi standar, menguji materi standar, dan sebagainya. Selain itu, dapat juga dilakukan perbandingan hasil percobaan metode yang akan divalidasi dengan hasil yang didapatkan dari metode tervalidasi yang sudah ada (Crowther et al. 2000).

2. Keseksamaan

Keseksamaan adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan antara beberapa seri pengukuran dari beberapa kali pengambilan sampel homogen dalam kondisi pengukuran yang sama (Crowther et al. 2000). Keseksamaan dapat dibedakan menjadi tiga tingkat, yaitu keterulangan (repeatability), keseksamaan intermediat (intermediate precision), dan ketertiruan (reproducibility). Keterulangan menunjukkan keseksamaan yang didapatkan dalam kondisi percobaan yang sama dengan interval waktu yang singkat. Keseksamaan intermediat menunjukkan keseksamaan yang didapatkan dalam variasi laboratorium, seperti perbedaan hari, analis, alat, dan sebagainya. Sementara itu, ketertiruan menunjukkan keseksamaan antar laboratorium.

Keseksamaan suatu analit bergantung pada analis, kondisi laboratorium, konsentrasi analit, jenis dan sifat kontaminan, batas deteksi, dan stabiitas analit (Garfield et al. 2000). Menurut Horwitz (1979) diacu dalam Garfield et al. (2000), semakin rendah konsentrasi suatu analit, maka semakin besar pengaruh faktor-faktor tersebut terhadap ketertiruan suatu metode. Setiap penurunan konsentrasi analit sebanyak 10%, maka koefisien variasi akan bertambah sebanyak dua kali lipatnya. Hubungan ini tidak dipengarui oeh jenis analit, matriks, metode analisi, dan teknik pengukuran (Horwitz 1979 diacu dalam Garfield et al. 2000).

3. Batas deteksi dan batas kuantitasi

Batas deteksi suatu prosedur analisis adalah jumlah analit terkecil dalam sampel yang dapat dideteksi tetapi tidak dapat dikuantitasi sebagai nilai tertentu. Batas kuantitasi adalah jumlah analit terkecil dalam sampel yang dapat dikuantitasi dengan kecermatan dan keseksamaan yang sesuai. Penentuan batas deteksi dan batas kuantitasi bergantung pada ada atau tidaknya penggunaan instrumen dalam metode yang akan divalidasi. Metode yang menggunakan instrumen tertentu dapat ditentukan batas deteksi dan batas kuantitasinya dengan cara melakukan analisis blanko berulang. Sementara itu, batas deteksi dan batas kuantitasi metode tanpa instrumen dapat ditentukan dengan cara mendeteksi analit dalam sampel pada pengenceran bertingkat (Harmita 2004).

13 4. Spesifitas, linearitas, dan jangkauan

Selektivitas atau spesifisitas adalah kemampuan metode dalam mengukur zat tertentu secara cermat dan seksama dengan adanya komponen lain yang mungkin ada dalam matriks sampel. Selektivitas seringkali dapat dinyatakan sebagai derajat penyimpangan (degree of bias) metode yang dilakukan terhadap sampel yang mengandung bahan yang ditambahkan berupa cemaran, hasil urai, senyawa sejenis, senyawa asing lainnya, dan dibandingkan terhadap hasil analisis sampel yang tidak mengandung bahan lain yang ditambahkan. Selektivitas metode ditentukan dengan membandingkan hasil analisis sampel yang mengandung cemaran, hasil urai, senyawa sejenis, senyawa asing lainnya atau pembawa plasebo dengan hasil analisis sampel tanpa penambahan bahan-bahan tersebut.

Linieritas adalah kemampuan metode analisis dalam menghasilkan respon yang mmiliki hubungan proporsional dengan konsentrasi analit dalam sampel (Crowther et al. 2000). Sementara itu, jangkauan suatu prosedur analisis adalah rentang antara konsentrasi terendah dan konsentrasi tertinggi analit dalam sampel yang memiliki kecermatan, keseksamaan, dan linearitas yang diinginkan.

5. Ketangguhan, kekuatan, dan sensitivitas

Ketangguhan (ruggedness) suatu metode adalah derajat ketertiruan hasil uji yang diperoleh dari analisis sampel yang sama dalam berbagai kondisi uji normal, seperti laboratorium, analisis, instrumen, bahan pereaksi, suhu, hari yang berbeda, dan sebagainya. Ketangguhan umumnya dinyatakan sebagai tidak adanya pengaruh perbedaan operasi atau lingkungan kerja pada hasil uji. Ketangguhan metode merupakan ukuran ketertiruan pada kondisi operasi normal antara lab dan antar analis (Harmita 2004).

Kekuatan (robustness) adalah ukuran kapasitas suatu metode untuk tetap tidak dipengaruhi oleh variasi kecil pada parameter metode serta menunjukkan indikasi bahwa metode yang digunakan dapat dipercaya pada kondisi normal (Crowther et al. 2000). Sementara itu, sensitivitas adalah kemampuan suatu metode untuk mengukur suatu analit secara akurat dengan adanya interferensi yang terdapat dalam matriks sampel.

IV. METODE PENELITIAN

A. Alat dan Bahan

Bahan-bahan yang digunakan adalah phaseolamin komersial, enzim α-amilase porcine

pancreatin, larutan soluble starch 1% dalam 0.02 M buffer natrium fosfat (pH 6.9), 0.02 M buffer

natrium fosfat (pH 6.9), air demineralisasi, larutan maltosa standar, asam 3,5-dinitrosalisilat, NaOH, dan Na-K-tartarat. Alat-alat yang digunakan adalah neraca analitik, water bath, dan spektrofotometer UV-Vis Double Beam.

B. Pelaksanaan Eksperimen

Pelaksanaan eksperimen pada penelitian ini terdiri dari beberapa tahap (Gambar 5), yaitu pengukuran aktivitas penghambatan enzim α-amilase dengan cara mengukur kadar pati sisa dengan iodin, optimalisasi kondisi preinkubasi enzim dan inhibitor, pengukuran aktivitas penghambatan enzim α-amilase dengan metode Fossum dan Whitaker (1974), dan validasi metode dengan parameter keseksamaan. Konsentrasi inhibitor dan waktu preinkubasi yang digunakan dalam metode pengukuran aktivitas penghambatan enzim α-amilase dengan metode Fossum dan Whitaker (1974) adalah konsentrasi inhibitor dan waktu preinkubasi optimum yang didapatkan dari tahap penelitian sebelumnya. Tahap-tahap penelitian yang dibahas dalam skripsi ini hanya mencakup optimalisasi kondisi preinkubasi enzim dan inhibitor, pengukuran aktivitas penghambatan enzim α-amilase dengan metode Fossum dan Whitaker (1974), dan validasi metode dengan parameter keseksamaan.

Pengukuran aktivitas penghambatan enzim α-amilase (dengan mengukur kadar pati sisa dengan iodin) Optimalisasi kondisi preinkubasi enzim dan inhibitor

(konsentrasi inhibitor dan waktu preinkubasi) Pengukuran aktivitas penghambatan enzim α-amilase

(dengan metode Fossum dan Whitaker 1974) Validasi metode dengan parameter keseksamaan

(Bagian yang dibahas dalam skripsi ini) Gambar 5. Diagram alir pelaksanaan eksperimen

1. Penentuan konsentrasi optimum inhibitor

Sebanyak 1 ml larutan enzim (0,1 mg/ml) dan 1 ml larutan inhibitor (0, 10, 20, 30, 40, dan 50 mg/ml) dipipet ke dalam tabung reaksi dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 60 menit.

15 Setelah itu, 1 ml larutan soluble starch ditambahkan ke dalam tabung reaksi dan inkubasi dilanjutkan selama 3 menit. Reaksi dihentikan dengan menambahkan reagen DNS sebanyak 1 ml. Kemudian, tabung reaksi dipanaskan dalam air mendidih selama 15 menit, didinginkan, ditambahkan 6 ml air demineralisasi, dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm. Blanko dibuat terpisah dengan cara kerja yang sama kecuali larutan enzim ditambahkan setelah penambahan reagen DNS.

Kurva standar maltosa dibuat dengan memasukkan 0, 0.05, 0.25, 0.45, 0.65, dan 0.85 ml larutan maltosa dengan konsentrasi 2 mg/ml ke dalam satu seri tabung reaksi. Air demineralisasi ditambahkan ke dalam masing-masing tabung sehingga volume total tiap tabung adalah 2 ml. Sebanyak 1 ml reagen DNS ditambahkan, kemudian tabung dipanaskan dalam air mendidih selama 5 menit, didinginkan, ditambahkan 7 ml air demineralisasi dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm.

2. Penentuan waktu preinkubasi optimum

Terdapat dua percobaan, yaitu percobaan A (dengan inhibitor) dan percobaan B (tanpa inhibitor). Pada percobaan A, 1 ml larutan enzim (0,1 mg/ml) dan 1 ml larutan inhibitor (dengan konsentrasi optimum yang didapatkan sebelumnya) dipipet ke dalam tabung reaksi dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 40, 60, 80, 100, dan 120 menit. Setelah itu, 1 ml larutan

soluble starch ditambahkan ke dalam tabung reaksi dan inkubasi dilanjutkan selama 3 menit.

Reaksi dihentikan dengan menambahkan reagen DNS sebanyak 1 ml. Kemudian, tabung dipanaskan dalam air mendidih selama 5 menit, didinginkan, ditambahkan 7 ml air demineralisasi dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm.

Sementara itu, pada percobaan B, 1 ml larutan enzim (0,1 mg/ml) dan 1 ml larutan

soluble starch dipipet ke dalam tabung reaksi dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 3 menit. Reaksi dihentikan dengan menambahkan reagen DNS sebanyak 1 ml. Kemudian, tabung reaksi dipanaskan dalam air mendidih selama 15 menit, didinginkan, ditambahkan 7 ml air demineralisasi, dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm. Blanko setiap percobaan dibuat terpisah dengan cara kerja yang sama kecuali larutan enzim ditambahkan setelah penambahan reagen DNS. Setiap percobaan dilakukan triplo.

Kurva standar maltosa dibuat dengan memasukkan 0, 0.05, 0.25, 0.45, 0.65, 0.85, dan 1.15 ml larutan maltosa dengan konsentrasi 2 mg/ml ke dalam satu seri tabung reaksi. Air demineralisasi ditambahkan ke dalam masing-masing tabung sehingga volume total tiap tabung adalah 2 ml. Sebanyak 1 ml reagen DNS ditambahkan, kemudian tabung dipanaskan dalam air mendidih selama 5 menit, didinginkan, ditambahkan 7 ml air demineralisasi dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm.

3. Preinkubasi inhibitor dan enzim

Terdapat dua percobaan, yaitu percobaan A (dengan inhibitor) dan percobaan B (tanpa inhibitor). Pada percobaan A, 1 ml larutan enzim (0,1 mg/ml) dan 1 ml larutan inhibitor dengan konsentrasi inhibitor optimum preinkubasi yang didapatkan sebelumnya dipipet ke dalam tabung reaksi dan diinkubasi pada suhu 37oC selama waktu optimum preinkubasi yang didapatkan sebelumnya. Setelah itu, 1 ml larutan soluble starch ditambahkan ke dalam tabung reaksi dan inkubasi dilanjutkan selama 3 menit.

16 Sementara itu, pada percobaan B, 1 ml larutan enzim (0,1 mg/ml) dan 1 ml larutan

soluble starch dipipet ke dalam tabung reaksi dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 3 menit. Setiap percobaan dilakukan triplo.

4. Pengukuran aktivitas penghambatan enzim (Fossum dan Whitaker 1974, dengan modifikasi)

Larutan reagen DNS disiapkan dengan cara melarutkan 75 g Na-K-tartarat ke dalam 50 ml NaOH 2 M sambil dipanaskan. Kemudian, di gelas piala terpisah, 2.7375 g asam 3,5-dinitrosalisilat dilarutkan dalam 125 ml air demineralisasi. Kedua larutan dicampur sambil dipanaskan hingga tercampur merata. Volume larutan ditepatkan hingga 250 ml dengan air demineralisasi. Reagen disimpan dalam botol kaca berwarna coklat (Bernfeld 1954 dalam Geethalakshmi et al. 2010).

Reaksi enzimatis pada percobaan A dan B dihentikan dengan menambahkan 1 ml larutan reagen DNS. Kemudian, tabung reaksi dipanaskan dalam air mendidih selama 15 menit, didinginkan, ditepatkan volumenya hingga 10 ml dengan air demineralisasi air demineralisasi, dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm. Blanko setiap perlakuan dibuat terpisah dengan cara kerja yang sama kecuali larutan enzim ditambahkan setelah penambahan larutan reagen DNS.

Kurva standar maltosa dibuat dengan memasukkan 0, 0.10, 0.25, 0.40, 0.55, 0.70, 0.85, dan 1.00 ml larutan maltosa dengan konsentrasi 4 mg/ml ke dalam satu seri tabung reaksi. Air demineralisasi ditambahkan ke dalam masing-masing tabung sehingga volume total tiap tabung adalah 2 ml. Sebanyak 1 ml reagen DNS ditambahkan, kemudian tabung dipanaskan dalam air mendidih selama 5 menit, didinginkan, ditambahkan 7 ml air demineralisasi dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm.

Perhitungan aktivitas enzim α-amilase dihitung dengan rumus: Jumlah maltosa yang terbentuk (mg) ÷ Berat molekul maltosa (60,32 g/mol) ÷ Waktu inkubasi (menit) ÷ Jumlah enzim yang digunakan (ml) x 1000 (faktor konversi). Aktivitas enzim α-amilase dinyatakan sebagai UI/ml, yaitu jumlah mikromol maltosa yang dapat dibebaskan oleh 1 ml enzim α-amilase dari substrat soluble starch per menit (Deshpande et al. 1982). Persen penghambatan dihitung dengan rumus: ((Aktivitas enzim amilase tanpa inhibitor – Aktivitas enzim α-amilase dengan inhibitor) ÷ Aktivitas enzim α-α-amilase tanpa inhibitor) x 100%.

5. Validasi metode

Parameter yang digunakan untuk validasi metode pengukuran aktivitas penghambatan enzim adalah keseksamaan dan ketangguhan (Fuentes et al. 2011). Namun, parameter yang akan dilakukan dalam percobaan ini hanya keseksamaan karena adanya keterbatasan analis dan laboratorium. Keseksamaan metode ini didapatkan dari keterulangannya. Percobaan A dilakukan sebanyak 7 kali ulangan dengan setiap ulangan dilakukan triplo. Sementara itu, percobaan B dilakukan triplo. Hasil yang didapatkan kemudian dicari rata-rata, simpangan baku, dan koefisiensi variasinya.

Inhibitor amilase (mg/ml)

V. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Konsentrasi Optimum Inhibitor

Konsentrasi inhibitor merupakan parameter yang penting untuk sebuah metode pengukuran aktivitas penghambatan enzim oleh senyawa inhibitor,. Menurut Mehrabadi et al. (2009), konsentrasi senyawa inhibitor enzim amilase mempengaruhi aktivitas penghambatan enzim α-amilase. Dosis senyawa inhibitor α-amilase yang berasal dari Triticale sebesar 0.25 mg dapat menghambat aktivitas enzim α-amilase sebesar 10%. Sementara itu, dengan dosis yang lebih tinggi, yaitu 1.5 mg, aktivitas enzim α-amilase terhambat sebesar 80% (Mehrabadi et al. 2009).

Metode pengukuran penghambatan phaseolamin terhadap aktivitas enzim α-amilase yang digunakan dalam percobaan yang dilakukan oleh Tormo et al. (2004) menggunakan phaseolamin yang didapatkan dari hasil purifikasi Phaseolus vulgaris dengan konsentrasi sebesar 0.15 – 1.5 mg/ml. Konsentrasi 0.15 mg/ml menghasilkan penghambatan sebesar 70%, sedangkan konsentrasi 1.5 mg/ml menghasilkan penghambatan sebesar 94% (Gambar 6). Phaseolamin yang digunakan dalam percobaan yang dilakukan adalah phaseolamin komersial, sehingga perlu dilakukan penyesuaian konsentrasi. Lima variasi konsentrasi phaseolamin yang digunakan dalam percobaan ini adalah 10, 20, 30, 40, dan 50 mg/ml.

Gambar 6. Penghambatan aktivitas enzim α-amilase oleh inhibitor α-amilase yang dipurifikasi dari Phaseolus vulgaris (Tormo et al. 2004)

Berdasarkan hasil yang diperoleh (Gambar 7), persen penghambatan maksimum didapatkan dari penggunaan konsentrasi phaseolamin sebesar 50 mg/ml. Namun, pada konsentrasi 50 mg/ml, phaseolamin mudah mengendap sehingga mempersulit penggunaannya. Persen penghambatan yang dinilai optimum untuk suatu metode pengukuran penghambatan aktivitas enzim adalah sebesar 80% karena penghambatan yang terjadi signifikan dan gula pereduksi yang terbentuk masih dapat terukur (Mehrabadi et al. 2009). Konsentrasi phaseolamin yang menghasilkan nilai persen penghambatan sebesar 80% adalah 20 dan 40 mg/ml. Berdasarkan analisis ragam yang

Pen g h a m ba ta n a kt ivi ta s a mil as e (% )

18 dilakukan (Lampiran 3), nilai persen penghambatan yang dihasilkan oleh kedua konsentrasi inhibitor ini tidak berbeda secara signifikan pada taraf signifikansi 0.05. Pada phaseolamin dengan konsentrasi 20 mg/ml, phaseolamin yang digunakan lebih sedikit dibandingkan dengan konsentrasi 40 mg/ml sehingga konsentrasi 20 mg/ml lebih efisien.

Gambar 7. Grafik hubungan antara konsentrasi phaseolamin dengan persen penghambatan aktivitas enzim α-amilase hasil percobaan

Pada percobaan yang dilakukan oleh Tormo et al. (2004), konsentrasi phaseolamin yang dibutuhkan untuk menghasilkan persen penghambatan sebesar 80% adalah 0.6 mg/ml. Sementara itu, konsentrasi phaseolamin yang menghasilkan persen penghambatan 80% pada percobaan ini adalah 20 mg/ml. Perbedaan konsentrasi yang cukup besar disebabkan oleh adanya perbedaan metode, kondisi preinkubasi, dan phaseolamin yang digunakan. Tormo et al. (2004) menggunakan alat diagnosa amilase dan metode Wallenfels et al. (1978) dengan waktu preinkubasi selama 30 menit. Selain itu, phaseolamin yang diuji oleh Tormo et al. (2004) berasal dari hasil purifikasi dari ekstrak Phaseolus vulgaris. Sementara itu, percobaan ini menggunakan metode Bernfeld (1955) dengan reagen DNS untuk mengukur gula pereduksi yang terbentuk, waktu preinkubasi selama 60 menit, dan phaseolamin komersial. Hal ini menunjukkan bahwa perbedaan metode, waktu preinkubasi, dan jenis phaseolamin yang digunakan dapat mempengaruhi pengukuran aktivitas penghambatan phaseolamin terhadap α-amilase.

Koefisien determinasi yang didapatkan dari hasil analisis ragam adalah sebesar 97.98% (Lampiran 3). Koefisien determinasi menunjukkan persentase keragaman data yang dijelaskan oleh model (Saefuddin et al. 2009). Koefisien determinasi yang tinggi menunjukkan adanya hubungan yang erat antara konsentrasi inhibitor dengan persen penghambatan yang dihasilkan oleh inhibitor. Hal ini sesuai dengan pernyataan Mehrabadi et al. (2009) bahwa konsentrasi senyawa inhibitor enzim α-amilase mempengaruhi aktivitas penghambatan enzim α-amilase.

Menurut hasil penelitian yang dilakukan Mehrabadi et al. (2009), hubungan antara konsentrasi inhibitor enzim α-amilase dengan aktivitas penghambatan enzim tidak linear. Namun, semakin besar konsentrasi yang digunakan, maka semakin besar aktivitas penghambatannya. Tormo et al. (2004) juga melaporkan hal yang sama. Pada hasil yang didapatkan (Gambar 7), aktivitas penghambatan yang dihasilkan oleh konsentrasi phaseolamin sebesar 30 mg/ml lebih rendah dibandingkan dengan konsentrasi 20 mg/ml. Hal ini dapat disebabkan oleh phaseolamin

19 yang sulit larut dalam larutan penyangga pada konsentrasi yang terlalu tinggi, sehingga phaseolamin dapat mengendap dan menyebabkan kesalahan dalam percobaan karena phaseoamin tidak terdispersi secara sempurna dalam larutan penyangga.

Tidak terdapat data mengenai kelarutan phaseolamin komersial. Namun, senyawa α-AI1 merupakan protein, sehingga kelarutannya bergantung pada titik isoelektriknya (pI). Saat pH larutan berada di atas titik isoelektrik protein, maka residu asam amino yang terletak di permukaan akan bersifat negatif sehingga protein juga menjadi bersifat negatif dan akan tertinggal di fase larutan. Sebaliknya, jika pH larutan berada di bawah titik isoelektrik protein, protein akan menjadi tidak larut dan tertinggal di fase interfasial (Dennison dan Lovrient 1997 diacu dalam Wang et

al.2011). Menurut Lajolo dan Filho (1985) diacu dalam Wang et al.(2011), titik isoelektrik α-AI1

adalah sebesar 5.2.

Nilai pH larutan penyangga yang digunakan untuk melarutkan phaseolamin dalam percobaan ini adalah 6.9, di atas titik isoelektrik phaseolamin, sehingga phaseolamin dapat larut. Namun, pada saat melakukan percobaan, phaseolamin di atas 20 mg/ml yang dilarutkan dalam larutan penyangga tidak terdispersi secara sempurna jika dilihat dengan kasatmata. Oleh karena itu, konsentrasi phaseolamin sebesar 20 mg/ml dinilai paling baik karena pada konsentrasi tersebut phaseolamin masih dapat larut dan dapat digunakan dalam metode pengukuran.

B. Waktu Optimum Preinkubasi

Penghambatan phaseolamin terhadap enzim α-amilase terjadi saat preinkubasi phaseolamin dan enzim α-amilase sebelum penambahan substrat. Hal ini menunjukkan bahwa kompleks enzim α-amilase dengan phaseolamin terbentuk saat preinkubasi (Santimone et al. 2004). Kompleks enzim dengan inhibitor ditunjukkan pada Gambar 8. Enzim α-amilase porcine pancreatin ditunjukkan dalam bentuk α-heliks berwarna merah dan β-strands berwarna biru. Ikatan penghubung ditunjukkan dengan warna kuning, sedangkan α-AI1 berwarna ungu.

Gambar 8. Struktur kompleks enzim α-amilase dengan α-AI1 (Bompard-Gilles et al. 1996) Studi awal yang mengukur aktivitas penghambatan phaseolamin terhadap enzim α-amilase menunjukkan bahwa sebesar 8.16 x 10-6 µmol phaseolamin dapat menghambat 6.63 x 10-6 µmol enzim α-amilase, sehingga stokiometri penghambatan yang didapatkan adalah satu banding satu

20 (Marshall et al. 1975). Namun, perhitungan stokiometri pada studi awal ditentukan berdasarkan berat molekul phaseolamin sebesar 49 kDa. Sementara itu, menurut Lee dan Whitaker (2000) diacu dalam Obiro et al. (2008), berat molekul phaseolamin adalah sebesar 56.7 kDa, sehingga stokiometri penghambatan yang sebenarnya adalah dua banding satu.

Phaseolamin merupakan senyawa dimer dan berinteraksi dengan dua molekul enzim. Setiap monomer senyawa AI1 mengikat sisi aktif molekul enzim. Interaksi terbesar dengan enzim α-amilase terjadi pada depresi berbentuk V pada sisi aktif enzim. Inhibitor α-AI1 menghambat pencernaan karbohidrat secara efektif dengan mencegah akses substrat terhadap sisi aktif enzim (Bompard-Gilles et al. 1996). Menurut Wilcox dan Whitaker (1984) diacu dalam Bompard-Gilles

et al. (1996), penghambatan enzim α-amilase oleh α-AI1 berlangsung lambat karena dibutuhkan

waktu untuk terjadinya perubahan konformasi. Perubahan ini menyebabkan berubahnya sisi aktif enzim sehingga substrat tidak dapat terikat pada sisi aktif enzim α-amilase. Menurut Bompard-Gilles et al. (1996), α-AI1 menghambat enzim α-amilase secara kuat dengan koefisien disosiasi sebesar 3.5x10-11 M pada pH netral.

Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Marshall dan Lauda (1975) dan Frels dan Rupnow (1975), penghambatan phaseolamin terhadap enzim α-amilase bersifat non-kompetitif. Plot Lineweaver-Bulk enzim α-amilase tanpa dan dengan inhibitor α-AI1 dapat dilihat pada Gambar 9. Berdasarkan plot tersebut, terlihat bahwa inhibitor α-AI1 menghambat enzim α-amilase secara non-kompetitif.

Gambar 9. Plot Lineweaver-Bulk enzim α-amilase tanpa(○) dan dengan (●) inhibitor α-AI1 (Marshall dan Lauda 1975)

Kompleks phaseolamin dengan enzim α-amilase terbentuk oleh adanya 15 ikatan hidrogen antara phaseolamin dengan sisi aktif enzim (Obiro et al. 2008). Rantai samping enzim dan inhibitor yang terlibat dalam pembentukan kompeks dapat dilihat di Gambar 10. Dua hairpin loops inhibitor yang berikatan dengan sisi aktif enzim berwarna hijau dan ungu, sedangkan warna biru menunjukkan residu asam amino dari enzim yang terlibat dalam interaksi. Bola berwarna biru menunjukkan molekul air yang terdapat dalam molekul enzim bebas. Kompleks ini bersifat reversibel sehingga diperlukan waktu preinkubasi optimum. Terdapat lima variasi waktu preinkubasi yang digunakan dalam tahap ini, yaitu 40, 60, 80, 100, dan 120 menit. Variasi waktu tersebut ditentukan berdasarkan literatur yang menyebutkan bahwa waktu preinkubasi optimum pada pH 6.9 bervariasi antara 40 sampai 120 menit (Obiro et al. 2008).

21 Gambar 10. Rantai samping enzim dan inhibitor yang terlibat dalam pembentukan kompleks

(Bompard-Gilles et al. 1996)

Berdasarkan hasil yang diperoleh (Gambar 11), persen penghambatan maksimum didapatkan dari waktu preinkubasi selama 80 menit. Namun, dengan waktu preinkubasi selama 80 menit, persen penghambatan yang dihasilkan hampir mencapai 100% sehingga gula pereduksi yang dapat terdeteksi sangat kecil dan dapat mempengaruhi ketelitian hasil percobaan. Sementara itu, waktu preinkubasi yang menghasilkan nilai persen penghambatan sebesar 80% adalah 60 dan 100 menit. Berdasarkan hasil analisis ragam (Lampiran 4), tidak terdapat perbedaan yang signifikan pada taraf signifikansi 0.05 antara kedua waktu preinkubasi tersebut. Metode yang lebih efisien ditunjukkan dengan waktu preinkubasi yang lebih singkat namun tetap menghasilkan persen penghambatan yang optimum. Oleh karena itu, waktu preinkubasi yang dinilai optimum untuk digunakan adalah selama 60 menit.

Gambar 11. Grafik hubungan antara waktu preinkubasi dengan persen penghambatan aktivitas enzim α-amilase hasil percobaan

Koefisien determinasi yang didapatkan dari hasil analisis ragam adalah sebesar 98.77% (Lampiran 4). Koefisien determinasi menunjukkan persentase keragaman data yang dijelaskan oleh model (Saefuddin et al. 2009). Koefisien determinasi yang tinggi menunjukkan adanya

0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100 120 P er se n p en g h a m b a ta n ( % )