KAJIAN MOLEKULER BAKTERI ASAM LAKTAT ISOLAT 9A HASIL ISOLASI DARI KOLON SAPI BALI MELALUI ANALISIS GEN 16S rRNA
SKRIPSI
Diajukan untuk Melengkapi Tugas-Tugas dan Memenuhi Persyaratan untuk Mencapai Gelar Sarjana Kedokteran Hewan
Diajukan oleh
Dewa Gede Agung Widyadnyana NIM. 1109005079
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN UNIVERSITAS UDAYANA
Setelah mempelajari dan menguji dengan sungguh-sungguh kami berpendapat bahwa tulisan ini baik ruang lingkup maupun kualitasnya dapat diajukan sebagai skripsi untuk memperoleh gelar Sarjana Kedokteran Hewan.
Ditetapkan di ... tanggal ...
Panitia Penguji:
Dr. drh. I Wayan Suardana, M. Si. Ketua
Dr. dr. I Dewa Made Sukrama, M.Si., Sp.MK. Dr. drh. I Nengah Kerta Besung, M.Si.
Sekretaris Anggota
drh. Tjokorda Sari Nindhia, S.KH, M.P. Luh Ade Wilan Krisna, S.Si., M.Ked.
KAJIAN MOLEKULER BAKTERI ASAM LAKTAT ISOLAT 9A HASIL ISOLASI DARI KOLON SAPI BALI MELALUI ANALISIS GEN 16S rRNA
SKRIPSI
Diajukan untuk Melengkapi Tugas-Tugas dan Memenuhi Persyaratan untuk Mencapai Gelar Sarjana Kedokteran Hewan
Oleh
Dewa Gede Agung Widyadnyana NIM. 1109005079
Menyetujui/Mengesahkah:
Pembimbing I
Dr. drh. I Wayan Suardana, M. Si. NIP. 197000122 199512 1 001
Pembimbing II
Dr. dr. I Dewa Made Sukrama, M.Si., Sp.MK. NIP. 19581010 198702 1 001
DEKAN FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN UNIVERSITAS UDAYANA
Dr. drh. Nyoman Adi Suratma, M.P. NIP. 19600305 198703 1 001
ix ABSTRAK
Bakteri asam laktat (BAL) merupakan bakteri yang mampu memfermentasi laktosa dan menghasilkan asam laktat sebagai produk utamanya. BAL berpotensi dalam memproduksi bakteriosin dan bersifat probiotik. Sapi bali yang memiliki banyak keunggulan salah satunya mampu memanfaatkan hijauan yang kurang bergizi, dan mempunyai daya cerna yang baik terhadap pakan, sehingga diharapkan dapat ditemukan BAL yang memiliki keunggulan dalam saluran pencernaan sapi bali. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antimikroba BAL isolat 9A asal kolon sapi bali sehingga bisa di manfaatkan sebagai kandidat probiotik serta untuk mengetahui analisis susunan nukleotida dan gambaran phylogenetic tree bakteri asam laktat isolat 9A. Penelitian diawali dengan kultivasi isolat BAL sebagai hasil penelitian sebelumnya dengan menumbuhkan pada media MRS broth, uji katalase dan pewarnaan Gram. Isolat BAL yang sudah terkonfirmasi dilanjutkan dengan uji aktivitas antimikroba, dengan bakteri pathogen (E. coli dan S. aureus) kemudian dilanjutkan analisis molekuler dengan amplifikasi gen 16S rRNA dengan primer B27F dan U1492R, yang selanjutnya dilakukan sekuensing dan hasil sekuensing di analisis dengan program MEGA 4.0. Hasil penelitian menunjukkan uji aktivitas antimikroba bakteri asam laktat isolat 9A menghambat pertumbuhan S. aureus yang paling tinggi 61,47%, terendah 37.56% dengan rata-rata 50.35%, dan tidak terjadi penghambatan pada pertumbuhan E. coli, dan BAL isolat 9A teridentifikasi sebagai Streptococcus bovis dengan similaritas 99% dan berada satu kluster denganStreptococcus bovisdengan nilai bootstrap sebesar 100.
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL...i
LEMBAR PENGESAHAN...ii
RIWAYAT HIDUP...iv
ABSTRAK... v
ABSTRACT...vi
UCAPAN TERIMAKASIH...vii
DAFTAR ISI...ix
DAFTAR GAMBAR...xi
DAFTAR TABEL...xii
BAB I PENDAHULUAN... 1
1.1 Latar Belakang... 1
1.2 Rumusan Masalah... 3
1.3 Tujuan Penelitian ... 3
1.4 Manfaat Penelitian ... 3
BAB II TINJAUAN PUSTAKA... 4
2.1 Bakteri Asam Laktat ... 4
2.2 Bakteri Asam Laktat dalam Saluran Pencernaan... 6
2.3 Aktivitas Antibakteri Bakteri Asam Laktat ... 6
2.4 Sapi Bali... 7
2.5 Analisis Molekuler... 8
2.5.1 Identifikasi Molekuler Gen 16S rRNA ... 8
2.5.2Polymerase Chain Reaction(PCR)... 9
2.5.3 Elektroforesis ... 9
2.5.4 Sekuensing ... 10
2.5.5 Program BLAST ... 10
2.6 Kerangka Konsep... 11
BAB III MATERI DAN METODE... 12
3.1 Bahan yang Digunakan... 12
3.2 Peralatan yang Digunakan ... 12
3.3 Prosedur Penelitian ... 12
3.3.1 Penumbuhan Bakteri ... 12
3.3.2 Uji Katalase ... 13
3.3.3 Pewarnaan Gram ... 13
3.3.4 Uji Aktivitas Antimikroba Bakteri Asam Laktat Isolat 9A... 13
3.3.5 Analisis Molekuler ... 14
a. Isolasi DNA Genom BAL... 14
b. Amplifikasi Gen 16S rRNA dengan Metode PCR ... 15
c. Elektroforesis dengan Agarose 1,5% ... 16
d. Sekuensing ... 16
xi
3.5 Waktu dan Lokasi Penulisan ... 16
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN... 18
4.1 Hasil... 18
4.1.1 Kultivasi Bakteri Asam Laktat Isolat 9A ... 18
4.1.2 Uji Aktivitas Antimikroba... 18
4.1.3 Identifikasi Gen 16S dengan PCR dan Elektroforesis ... 19
4.1.4 Susunan Nukleotida... 20
4.1.5 Hasil Analisis Sekuensing DNA ... 20
4.2 Pembahasan ... 28
BAB V SIMPULAN DAN SARAN... 33
5.1 Simpulan ... 33
5.2 Saran ... 33
DAFTAR TABEL
Tabel 1. Uji daya hambat BAL isolat 9A terhadap bakteri patogen ... 19 Tabel 2.Similarityisolat 9A dibandingkan dengan isolat BAL yang di akses
xiii
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Kerangka konsep penelitian ... 11 Gambar 2. Hasil pewarnaan Gram bakteri asam laktat isolat 9A dengan
perbesaran 1000X... 18 Gambar 3. Ketahanan BAL isolat 9A terhadap bakteri pathogenE. coli(A)
danS. aureus(B)... 19 Gambar 4. Amplifikasi gen 16S rRNA BAL. Isolat. 9A hasil isolasi kolon
sapi bali dengan Primer B27F dan U1492R pada agarose 1%. M: Marker 1kb. DNA ladder, 1: Isolat 9A ... 20 Gambar 5. Alignment urutan basa DNA pengkode 16S rRNA isolate BAL
9A dengan bakteri asam laktat dari Genbank... 26 Gambar 6. Pohon filogenetik berdasarkan sekuen penyandi 16S rRNA
1
BAB I PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Bakteri asam laktat (BAL) merupakan bakteri Gram positif, tidak berspora, berbentuk basil atau kokus, menghasilkan asam laktat sebagai hasil dari fermentasi karbohidrat, katalase negatif, mikroaerotoleran dan asidotoleran (Axelsson, 1998). Secara fisiologis dan aktivitas metabolismenya, bakteri asam laktat yang menghasilkan dua molekul asam laktat dari fermentasi glukosa disebut
bakteri asam laktat homofermentative, sedangkan bakteri asam laktat yang menghasilkan satu molekul asam laktat, dan satu molekul etanol serta satu molekul karbon dioksida (CO2) disebut bakteri asam laktat heterofermentative
(Surono, 2004).
Beberapa spesies dari bakteri asam laktat berpotensi dalam memproduksi bakteriosin dan bersifat probiotik (Ruzanna, 2011). Bakteriosin memiliki peranan penting dalam menanggulangi terjadinya suatu infeksi, serta memiliki kelebihan daripada senyawa antimikroba yang lain yaitu aman dan mampu mencegah atau menghambat resistensi (Marshall dan Arenas, 2003)
Sapi bali yang merupakan sapi asli Indonesia, merupakan hasil domestikasi banteng (Bos (Bibos) banteng) (Batan, 2006). Keunggulan sapi bali yaitu cepat berkembang biak/fertilitas tinggi, persentase karkas yang tinggi, mudah beradaptasi dengan lingkungannya, dapat hidup di lahan kritis karena dapat memanfaatkan hijuan yang kurang bergizi, dan mempunyai daya cerna yang baik terhadap pakan (Hardjosubroto, 1994). Diketahui bahwa pakan memberikan pengaruh terhadap ekologi dari bakteri asam laktat dalam saluran pencernaan (Suardana dan Suarsana, 2007).
2
2
(Lambert dan Hull, 1996). Sehingga akan menarik untuk mengidentifikasi BAL pada saluran cerna sapi bali.
Upaya identifikasi spesies bakteri asam laktat dapat dilakukan melalui pemeriksaan karakteristik morfologi, metabolit, fenotipik dan genotifik. Metode fenotipik dianggap kurang efisien dan kurang akurat karena mengandalkan ekspresi fenotip di bawah kondisi laboratorium dan dapat menyebabkan kesalahan identifikasi (misidentification) (Chenooll et al., 2003). Metode genotipik yang banyak diaplikasikan dalam studi identifikasi mikrobia adalah menggunakan analisis skuen gen 16S dan 23S rRNA (Anindita, 2013).
Protein16S rRNA berupa polinukleotida besar (1500-2000 pasang basa) dan
merupakan bagian dari subunit kecil dari ribosom prokariot. Protein 16S rRNA bersama dengan beberapa protein kecil tergabung dalam subunit kecil ribosom. Analisis terhadap gen penyandi 16S rRNA merupakan metode terpilih untuk identifikasi dan melihat filogenitas bakteri (Puspaningrum, 2008). Protein 16S rRNA dapat digunakan sebagai penanda molekuler karena molekul ini bersifat ubikuitus dengan fungsi yang identik pada seluruh organisme. Molekul ini juga dapat berubah sesuai jarak evolusinya, sehingga dapat digunakan sebagai kronometer evolusi yang baik. Molekul 16S rRNA memiliki beberapa daerah yang memiliki urutan basa yang relatif konservatif dan beberapa daerah urutan basanya variatif (Stackebrandt dan Goebel, 1995). Penggunaan gen 16S rRNA telah digunakan sebagai parameter sistemik molekuler yang universal, represertatif, dan praktis untuk mengkonstruksi keberadaan filogenentik pada tingkat spesies (Woeseet al., 1990dalam Khaeruni, 2005). Identifikasi molekuler dengan 16S rRNA penting untuk dilakukan agar diketahui identitas isolat bakteri asam laktat terpilih hingga tingkat spesies dan menjadi dasar untuk identifikasi karakter khas bakteri lebih lanjut.
Isolat bakteri asam laktat (BAL) 9A merupakan bakteri asam laktat hasil isolasi 20 sampel feses yang berasal dari kolon sapi bali. Isolat BAL 9A terkonfirmasi sebagai BAL didasarkan atas uji penumbuhan pada MRS, uji katalase, pewarnaan Gram dan diketahui memiliki killing zone terhadap
3
sebelumnya (Lindawati dan Suardana, 2014). Disisi lain, uji antimikroba dari isolat BAL 9A belum di ukur secara pasti disamping analisis untuk menentukan strain isolat BAL secara akurat belum dilakukan sehingga penelitian dengan judul “Kajian Molekuler Bakteri Asam Laktat Isolat 9A Hasil Isolasi dari Kolon Sapi Bali Melalui Analisis Gen 16S rRNA”menarik untuk dilakukan.
1.2 Rumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang di atas, dapat dirumuskan permasalahan sebagai berikut:
1. Bagaimanakah kemampuan aktivitas antimikroba bakteri asam laktat isolat 9A. 2. Bagaimanakah susunan nukleotida dan bagaimana gambaran phylogenetic tree
bakteri asam laktat isolat 9A yang di isolasi dari kolon sapi bali dengan analisis sekuen gen 16S rRNA.
1.3 Tujuan Penelitian
1. Menentukan kemampuan aktivitas antimikroba bakteri asam laktat isolat 9A.
2. Analisis susunan nukleotida dan gambaran phylogenetic tree bakteri asam laktat isolat 9A yang di isolasi dari kolon sapi bali dengan analisis sekuen gen 16S rRNA.
1.4 Manfaat Penelitian
Manfaat dari penelitian ini diharapkan bermanfaat secara akademik dan praktis sebagai berikut
1. Manfaat praktis, mendapatkan bakteri asam laktat yang memiliki kemampuan antimikroba sehingga bisa di manfaatkan sebagai kandidat probiotik.
4
4 BAB II
TINJUAN PUSTAKA
2.1 Bakteri Asam Laktat
Bakteri asam laktat (BAL) ditemukan pertama kali oleh Pasteur, seorang professor Kimia di University of Lille, tahun 1887. Lister mengisolasi bakteri asam laktat asal susu yang tengik. Selain itu bakteri asam laktat juga di temukan pada saluran pencernaan hewan maupun manusia (Surono, 2004). BAL pernah diisolasi dari feses bayi (Ruzanna, 2011), dan diisolasi dari cairan rumen sapi bali
(Suardana dan Suarsana, 2007).
Bakteri asam laktat merupakan bakteri Gram positif yang menghasilkan asam laktat sebagai hasil dari fermentasi karbohidrat, katalase negatif, mikroaerotoleran dan asidotoleran. Bakteri asam laktat juga memiliki ciri-ciri non-motil, tidak berspora, berbentuk basil atau kokus, dan bersifat anaerob aerotolerant (Axelsson, 1998). Bakteri asam laktat bisa tumbuh pada suhu 5-45°C. Sebagian besar bakteri asam laktat dapat tumbuh pada suasana lingkungan dengan pH 4.0-4.5, dan membutuhkan asam amino dan vitamin B untuk dapat tumbuh (Jayet al., 2005).
Bakteri asam laktat merupakan kelompok bakteri yang termasuk dalam filum
Firmicute. Bakteri yang termasuk dalam kelompok ini adalah Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Lactosphaera, Leuconostoc,
Melissococcus, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, VagococcusdanWeissella(Jayet al., 2005).
Secara fisiologis dan aktivitas metabolismenya, bakteri asam laktat dibedakan menjadi bakteri asam laktat homofermentative melibatkan jalur Embden Meyerhof, yaitu glikolisis yang menghasilkan asam laktat, 2 mol ATP dari satu molekul glukosa/heksosa dalam kondisi normal, tidak menghasilkan CO2, dan menghasilkan biomassa sel dua kali lebih banyak daripada bakteri asam laktat
5
menghasilkan etanol asam asetat, senyawa citarasa, dan mannitol serta 1 mol ATP dari heksosa dan tidak mempunyai enzim aldolase (Surono, 2004).
Bakteri asam laktat banyak ditemukan pada produk makanan olahan, baik produk hewani seperti daging dan ikan yang difermentasi, susu fermentasi, maupun pada produk nabati seperti fermentasi sayuran dan buah-buahan, serta silase. Selain itu bakteri asam laktat juga banyak terdapat pada organ dalam makhluk hidup, seperti pada saluran pembuangan, jalur genital, jalur intestin, maupun jalur respiratori pada manusia dan hewan (Stamer, 1979).
Berikut merupakan beberapa jenis bakteri asam laktat menurut Sumanti (2008) dalam Pradani dan Hariastuti (2009) antara lain sebagai berikut :
1. Streptococcus thermophilus, Streptococcus lactis dan Streptococcus cremoris. Semuanya ini adalah bakteri Gram positif, berbentuk bulat
(coccus) yang terdapat sebagai rantai dan semuanya mempunyai nilai ekonomis penting dalam industri susu.
2. Pediococcus cerevisae Bakteri ini adalah Gram positif berbentuk bulat, khususnya terdapat berpasangan atau berempat (tetrads). Walaupun jenis ini tercatat sebagai perusak bir dan anggur, bakteri ini berperan penting dalam fermentasi daging dan sayuran.
3. Leuconostoc mesenteroides dan Leuconostoc dextranicum. Bakteri ini adalah Gram positif berbentuk bulat yang terdapat secara berpasangan atau rantai pendek. Bakteri-bakteri ini berperanan dalam perusakan larutan gula dengan produksi pertumbuhan dekstran berlendir. Walaupun demikian, bakteri-bakteri ini merupakan jenis yang penting dalam 18 permulaan fermentasi sayuran dan juga ditemukan dalam sari buah, anggur, dan bahan pangan lainnya.
6
6
Streptococcus dan oleh karenanya menjadi lebih banyak terdapat pada sayuran.
Sebagai bakteri bermanfaat dalam saluran pencernaan, bakteri asam laktat berpotensi dalam memproduksi bakteriosin dan bersifat probiotik (Ruzanna, 2011). Bakteriosin memiliki peranan penting dalam menanggulangi terjadinya suatu infeksi, serta memiliki kelebihan dari pada senyawa antimikroba yang lain yaitu dapat bekerja secara selektif, aman dan mampu mencegah atau menghambat resistensi (Marshall dan Arenas, 2003). Kemampuan BAL dalam memproduksi senyawa antimikrobia menunjukkan pentingnya peranan BAL dalam melindungi makanan terhadap pembusukan yang disebabkan oleh bakteri dan kapang karena
BAL dapat menghambat pertumbuhan bakteri pembusuk, bakteri patogenik, dan bakteri penghasil bioamin yang mungkin mengkontaminasi produk bahan makanan fermentasi (Lawalata, 2012).
2.2 Bakteri Asam Laktat dalam Saluran Pencernaan
Saluran pencernaan manusia ataupun hewan diperkirakan mengandung flora
normal sampai 1012bakteri per gram isi saluran cerna dan setidak-tidaknya terdiri atas 500 species yang sebagian besar merupakan bakteri asam laktat (Drasar dan Hill, 1974 dalam Salminen dan Wright, 1998). Menurut Lambert dan Hull (1996) pada usus besar atau colon bisa ditemukan sebanyak 400-500 jenis bakteri yang jumlahnya dapat mencapai triliunan (1012-14) bakteri. BAL umumnya ditemukan sekitar 104-109bakteri per gram isi kolon.
Clostridium, Streptococcus, staphylococcus dan Lactobacillus adalah bakteri yang sering di temukan pada colon (Young dan Huffman, 2003 dalam Surono, 2004), Enterococcus merupakan bakteri asam laktat penghuni usus halus yang dominan disamping Lactobacillus.Jumlahnya mampu mencapai 1010sel/g dalam usus halus dan berkurang hingga 108sel/g dalam feses (Mitsuoka, 1989).
2.3 Aktivitas Antibakteri Bakteri Asam Laktat
7
senyawa antimikroba dapat bersifat bakterisidal (membunuh bakteri), bakteristatik (menghambat pertumbuhan bakteri), fungisidal (membunuh kapang), fungistatik (menghambat pertumbuhan kapang), dan germisidal (menghambat germinasi spora bakteri). Umumnya hampir semua senyawa yang diproduksi oleh BAL mampu menghambat pertumbuhan BAL lainnya dan beberapa di antaranya memiliki efek bakterisidal terhadap bakteri lain yaitu bakteri pembusuk dan patogenik asal makanan seperti Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, danClostridium botulinum(Gorris dan Bennik, 1994).
2.4 Sapi Bali
Sapi bali yang merupakan sapi asli Indonesia, merupakan hasil domestikasi banteng (Bos (Bibos) banteng) (Batan, 2006). Sapi bali masih diternakkan secara murni di Bali, tanpa campuran dari sapi luar. Oleh karena itu, ciri-ciri sapi bali masih sama dengan banteng yang hidup liar di hutan. Semenjak zaman Belanda, di Bali tidak pernah diimpor sapi dari luar, bahkan sampai saat ini masih dipertahankan, dengan maksud untuk menjaga kemurnian darah sapi bali. Sebagai plasma nutfah dan sebagai aset nasional sapi bali sangat perlu dipertahankan keberadaanya karena memiliki beberapa keunggulan yang diantaranya mempunyai sifat reproduksi dan kualitas karkas sangat baik, tahap pada kondisi lingkungan tropis dan pakan jelek, serta mempunyai fertilitas yang tinggi (Supriyantonoet al., 2008).
Saluran pencernaan semua hewan dapat dianggap sebagai tabung dari mulut sampai ke anus dan berfungsi untuk mencerna, mengabsorbsi, dan mengeluarkan sisa makanan yang tidak tercerna. Disamping itu, saluran pencernaan merupakan tempat perkembangbiakan mikroorganisme yang segera terbentuk setelah dilahirkan. Saluran pencernaan akan menjadi barrier koloni mikroorganisme non patogen dan patogen (Abun, 2008).
Mikroorganisme pada saluran cerna menurut Gorbach (2001) berfungsi memfermentasi karbohidrat yang tidak bisa dicerna terutama yang berasal dari
8
8
fermentasi tersebut, selanjutnya dapat digunakan sebagai sumber energi yang sangat penting bagi tubuh hospes.
2.5 Analisis Molekuler
2.5.1 Identifikasi Molekuler gen 16S rRNA
Teknik yang akurat untuk identifikasi molekular bakteri adalah identifikasi terhadap gen penyandi 16S rRNA, dikenal dengan sebutan ribotyping/ riboprinting.Identifikasi tersebut didasarkan pada tingkat kesamaan dalam sekuen gen 16S rRNA sebagai sidik jari genetik bakteri atau disebut sekuen sidik jari. Gen 16S rRNA dari setiap spesies bakteri memiliki bagian yang stabil dalam
sekuen dan satu sel bakteri memiliki ribuan kopi RNA. 16S rRNA berupa polinukleotida besar (1500-2000 basa) dan merupakan bagian dari subunit kecil dari ribosom prokariot. Protein 16S rRNA bersama dengan beberapa protein kecil tergabung dalam subunit kecil ribosom. Analisis terhadap gen penyandi 16S rRNA merupakan metode terpilih untuk identifikasi dan melihat filogenitas bakteri. Keuntungannya adalah RNA secara umum dimiliki oleh semua bakteri, sedikit berubah dalam waktu tertentu, merupakan unit yang konstan dan merupakan target yang sensitif karena terdapat dalam jumlah banyak dalam sel yang aktif. Jika sekuen nukleotida dari gen 16S rRNA dari dua tipe organisme sangat mirip atau memiliki sedikit perbedaan basa dalam rRNA, maka kedua organisme tersebut memiliki hubungan kekerabatan yang dekat, ditinjau dari kedekatan secara evolusinya (Puspaningrum, 2008). Pohon filogenetik dapat di buat dengan membandingkan basa sekuen sehingga akan menunjukkan kemungkinan rute spesies yang beragam dan berasal dari nenek moyang yang sama (Daleet al., 2004dalamNormawati, 2012).
9
fenotip dan untuk menentukan gabungan file genetik. Sekuen dari berbagai isolat akan ditunjukan derajat kesamaan yang tinggi dengan Gen Bank (98,79%-99,8%). Pohon filogenetik pada skuens gen 16S rRNA menunjukan konsistensi yang tinggi dengan titik-titik yang di dukung oleh nilai bootstrap. Analisis urutan basa filogenetik 16S rRNA merupakan metode molokuler yang akurat untuk identifikasi mikroba (Ennaharet al., 2003).
2.5.2Polymerase Chain Reaction(PCR)
Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah teknik yang dilakukan untuk memperoleh aplikon dari sekuen DNA tertentu dalam jumlah yang banyak dengan
waktu yang cepat secara in-vitro (Elizabeth, 2004 dalam Hestiningtyas, 2008). Teknik PCR banyak digunakan untuk berbagai macam manipulasi dan analisis genetik. Komponen utama PCR adalah DNA cetakan, oligonuleotida primer, deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP) yang terdiri dari dATP, dCTP, dGTP, dan dTTP, enzim Taq DNA polymerase berfungsi melakukan katalisis reaksi sintesis rantai DNA. Reaksi PCR dibagi menjadi tiga macam tahapan. Reaksi melipat gandakan suatu fragmen DNA melalui tahap denaturasi cetakan DNA sehingga rantai DNA beruntai ganda terpisah menjadi beruntai tunggal. Tahap annealing
terjadi saat suhu diturunkan sehingga primer akan menempel pada DNA cetakan yang terpisah. Primer akan membentuk jembatan hidrogen pada cetakan sekuen yang komplementer dengan sekuen primer (Yuwono, 2006)
2.5.3 Elektroforesis
10
10
dapat terlihat di bawah sinar ultraviolet (Dale et al., 2004 dalam Normawati, 2012).
2.5.4 Sekuensing
Penentuan urutan (sekuensing) DNA merupakan proses penentuan urutan basa suatu segmen DNA. Metode sekuensing yang paling banyak digunakan adalah metode dideoksi Sanger. Metode ini mirip dengan amplifikasi DNA melalui PCR, yaitu menggunakan enzim DNA polimerase dan monomer-monomer dNTP untuk memperpanjang primer sepanjang untai, yang dilakukan melalui siklus suhu yang berulang. Bedanya, proses sekuensing dapat
menggunakan DNA untai tunggal maupun untai ganda dan hanya memerlukan satu primer (Milanda, 2001).
Pada reaksi sekuensing, perpanjangan untai DNA diterminasi secara acak dengan adanya analog dNTP, yaitu dideoksinukleotida trifosfat (ddNTP). Proses ini menghasilkan fragmen-fragmen DNA dengan selisih satu nukleotida saja. Fragmen-fragmen tersebut dipisahkan melalui elektroforesis gel poliakrilamida beresolusi tinggi. Deteksi produk sekuensing dilakukan dengan cara pelabelan radioaktif atau non radiaktif (menggunakan pelabel fluoresen). Pelabelan dapat dilakukan terhadap primer maupun komponen ddNTP. Pelabelan fluoresen pada ddNTP (dye terminator labeling) memberikan kemudahan, karena memungkinkan pemisahan fragmen hasil sekuensing berlangsung pada satu sumur gel saja. Hal itu disebabkan setiap nukleotida terakhir akan memberikan warna yang berbeda (Milanda, 2001).
2.5.5 Program BLAST
BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) merupakan suatu program untuk pencarian kemiripan sekuen (sequence similarity) dan merupakan alat dalam identifikasi gen dan karakter genetik. BLAST dapat melakukan pencarian sekuen melalui perbandingan dengan database DNA dalam waktu singkat. BLAST dapat diakses secara terbuka melalui website
11
Ada 5 program utama dalam BLAST, yaitu :
a. Nucleotideblast (blastn) : membandingkan suatu sekuen nukleotida meragukan (query sequence) yang kita miliki dengan database sekuen nukleotida.
b. Protein blast (blastp) : membandingkan suatu sekuen asam amino yang kita miliki dengan database sekuen protein.
c. Blastx : membandingkan produk translasi konsep 6‐frame sebuah sekuen
nukleotida (translated nucleotide) yang kita miliki dengan database sekuen protein.
d. Tblastn : membandingkan suatu sekuen protein yang kita miliki dengan database sekuen nukleotida yang secara dinamis ditranslasi pada semua pembacaan 6 frame.
e. Tblastx : membandingkan suatu translasi 6 frame dari nukleotida. (NCBI, 2003).
2.6 Kerangka Konsep
Kerangka konsep penelitian ini dimuat pada gambar 1.
Gambar 1. Kerangka konsep penelitian BAL
Isolat 9A asal kolon sapi bali
Spesifik Strain BAL Penumbuhan pada
MRS
Uji Katalase
Pewarnaan Gram Amplifikasi gen 16S
rRNA dengan primer B27F dan U1492R
Berpotensi sebagai kandidat Probiotik
