AKTIVITAS ANTIMIKROBA SEDIAAN BIOMATERIAL SELULOSA BAKTERI DARI LIMBAH KETELA RAMBAT (Ipomoea batatas Poir) DENGAN PENAMBAHAN KITOSAN TERHADAP Staphylococcus aureus
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)
Program Studi Farmasi
Oleh: Arvi Mahendra NIM: 098114120
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA
vi
Berjalan Bersama Yesus Tuhanku, aku tidak takut
menghadapi tantangan di depanku
( Arvi Mahendra)
Karena itu aku senang dan rela di dalam kelemahan, di dalam
siksaan, di dalam kesukaran, didalam penganiayaan dan kesesakan
oleh karena Kristus. Sebab jika aku lemah, maka aku kuat
( 2 Korintus 12 :10)
Berjuanglah hingga kau mencapai
tujuan mu
( papa dan mama)
vii PRAKATA
Segala puji syukur penulis haturkan kepada Tuhan Yesus atas segala berkat dan penyertaan yang senantiasa menyertai penulis hingga akhirnya dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “Aktivitas Anti Mikroba Sediaan Biomaterial Selulosa Bakteri dari Limbah Ketela Rambat (Ipomoea batatas Poir)
dengan Penambahan Kitosan terhadap Staphylococcus aureus”. Skripsi ini
merupakan langkah awal untuk mendapatkan gelar sarjana farmasi.
Penulis juga mengucapkan banyak terima kasih kepada pihak-pihak yang telah membantu penulis dalam menyelesaikan skripsi ini. Penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada :
1. Ibu Dr. Eli Rohaeti selaku Dosen Pembimbing Utama yang selalu memberikan saran dan semangat untuk menyelesaikan skripsi ini. Kebersediaan dalam meluangkan waktu bagi kami untuk berdiskusi berdampak positif bagi kemajuan penulisan skripsi ini.
2. Bapak Yohanes Dwiatmaka, M.Si selaku Dosen Penguji yang telah bersedia meluangkan waktu untuk menguji serta memberikan saran dan masukan kepada penulis
3. Bapak Prof. Dr. CJ. Soegihardjo, Apt selaku Dosen Penguji yang telah meluangkan waktu untuk menguji dan memberikan masukan bagi penulis 4. Mas Narto, Mas Dwi dan Mas Sarwanto yang telah membantu dalam
viii
5. Bapak Mukminin, Mas Heru, Mas Parjiman, Mas Wagiran, Mas Sigit, Pak Parlan, Pak Mus, beserta segenap laboran dan karyawan lain yang telah membantu Penulis dalam menyelesaikan skripsi ini.
6. Papa dan mama yang senantiasa memberikan dorongan, nasihat dan doa agat skripsi ini berjalan dengan baik.
Penulis menyadari bahwa skripsi yang disusun ini masih ada kekurangan dan ketidak sempurnaan, oleh karena itu penulis mengharapkan kritik dan saran agar karya ini menjadi lebih baik lagi. Semoga penelitian skripsi ini dapat bermanfaat dan menginspirasi penelitian berikutnya.
ix DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL ... i
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ... ii
HALAMAN PENGESAHAN ... iii
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ... iv
LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ... v
HALAMAN PERSEMBAHAN ... vi
BAB II PENELAAHAN PUSTAKA ... 6
x
D. Aplikasi Selulosa Bakteri dalam Bidang Medis ... 12
E. Acetobacter Xylinum ... 13
F. Staphylococcus aureus ... 15
G. Kitosan ... 17
H. Karakteristik Kitosan ... 18
I. Gliserol ... 19
J. Analisis Gugus Fungsi dengan Spektofotometri Infra Merah ... 20
K. Analisis Permukaan dengan Teknik Scanning Electron Microscopy (SEM) .. 23
L. Analisis Kristalinitas dengan Difraksi Sinar X (XRD) ... 24
M. Antibakteri ... 25
N. Pengujian Aktivitas Antimikroba... 27
O. Landasan Teori ... 27
P. Hipotesis ... 28
BAB III METODE PENELITIAN ... 29
A. Jenis Penelitian ... 29
B. Variabel Penelitian ... 29
xi
2. Variabel pengacau ... 29
C. Definisi Operasional ... 30
D. Alat dan Bahan ... 31
E. Tata Cara Penelitian ... 32
1. Determinasi tanaman ... 32
2. Pemilihan bahan ... 32
3. Preparasi limbah ketela rambat ... 32
4. Pembuatan kitosan sebagai pembanding ... 33
5. Pembuatan material selulosa bakteri ... 33
6. Pembuatan material selulosa bakteri+gliserol+kitosan ... 34
7. Analisis karakteristik biomaterial ... 35
8. Sterilisasi produk ... 37
9. Pengujian aktivitas antimikroba ... 37
F. Analisis Data ... 39
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ... 40
A. Hasil Determinasi Tanaman ... 40
B. Hasil Pemilihan Bahan ... 41
C. Preparasi Limbah Ketela Rambat ... 41
D. Pembuatan Membran Kitosan ... 42
E. Pembuatan Membran Selulosa ... 44
F. Pembuatan Membran Selulosa+Gliserol+kitosan (SGK) ... 47
G. Analisis Karakteristik Membran ... 48
xii
2. Analisis gugus fungsi dengan instrumen FT-IR ... 49
3. Analisis struktur morfologi ... 54
4. Analisis kristalinitas dengan XRD ... 57
H. Pengujian Aktivitas Antimikroba... 60
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ... 69
A. Kesimpulan ... 69
B. Saran ... 69
DAFTAR PUSTAKA ... 70
LAMPIRAN ... 76
xiii
DAFTAR TABEL
Tabel I. Kandungan kimia ketela rambat ... 7
Tabel II. Hasil korelasi gugus fungsi ... 23
Tabel III. Sifat fisik membran kitosan secara makroskopik ... 43
Tabel IV. Hasil pengamatan sifat fisik membran ... 48
Tabel V. Hasil interpretasi gugus fungsi membran... 53
Tabel VI. Hasil absorbansi selulosa dan selulosa+kitosan+gliserol ... 54
Tabel VII. Hasil pengamatan aktivitas antimikroba sampel biomaterial ... 62
xiv
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Struktur molekul amilosa ... 8
Gambar 2. Struktur molekul amilopektin ... 9
Gambar 3. Struktur selulosa ... 9
Gambar 4. Skema pembentukan selulosa ... 10
Gambar 5. Struktur selulosa bakteri ... 11
Gambar 6. Struktur dinding sel bakteri gram positif ... 16
Gambar 7. Struktur kitosan ... 17
Gambar 8. Metode mengkonstruksi garis dasar dalam spektrum infra merah... 21
Gambar 9. Spektra inframerah dari selulosa bakteri dan kitosan ... 22
Gambar 10. Foto SEM selulosa bakteri ... 24
Gambar 11. Difraktogram XRD dari selulosa bakteri dan kitosan ... 25
Gambar 12. Membran kitosan ... 43
Gambar 13. Bagan biosintesis selulosa ... 44
Gambar 14. Membran selulosa ... 46
Gambar 15. Spektra IR serbuk kitosan ... 49
Gambar 16. Spektra IR selulosa bakteri ... 51
Gambar 17. Spektra IR selulosa+kitosan+gliserol... 52
Gambar 18. Foto Permukaan SEM Selulosa+kitosan+gliserol... 55
Gambar 19. Foto penampang melintang selulosa+kitosan+gliserol ... 56
Gambar 20. Foto permukaan membran selulosa ... 56
Gambar 21. Foto penampang melintang selulosa bakteri ... 57
xv
xvi
DAFTAR PERSAMAAN
Persamaan 1. Rumus perhitungan DD kitosan... 18
Persamaan 2. Rumus perhitungan absorbansi menurut hukum Lambert-Beer ... 20
Persamaan 3. Rumus perhitungan absorbansi ... 20
Persamaan 4. Rumus perhitungan % kristalinitas ... 24
Persamaan 5. Rumus perhitungan % daya hambat ... 38
xvii
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Hasil determinasi tanaman ketela rambat ... 76
Lampiran 2. Surat pengesahan determinasi ... 77
Lampiran 3. Formula yang digunakan (per 100 mL) ... 78
Lampiran 4. Skema jalannya penelitian ... 78
Lampiran 5. Foto bahan yang digunakan ... 79
Lampiran 6. Foto masing-masing sampel ... 79
Lampiran 7. Hasil penimbangan berat basah sampel ... 80
Lampiran 8. Perhitungan konsentrasi NaOH dan HCl yang digunakan ... 80
Lampiran 9. Hasil spektra IR kitosan beserta perhitungan derajat deasetilasi... 81
Lampiran 10. Hasil spektra IR masing-masing sampel ... 82
Lampiran 11. Hasil perhitungan absorbansi tiap sampel ... 83
Lampiran 12. Hasil foto morfologi permukaan tiap sampel dengan instrument SEM ... 83
Lampiran 13. Hasil XRD tiap sampel ... 84
Lampiran 14. Hasil perhitungan luas total di bawah kurva tiap sampel ... 85
Lampiran 15. Hasil perhitungan luas background tiap sampel ... 86
Lampiran 16. Hasil perhitungan luas kristal+amorf tiap sampel ... 87
Lampiran 17. Hasil perhitungan luas kristal tiap sampel ... 87
Lampiran 18. Hasil perhitungan kristalinitas tiap sampel... 88
Lampiran 19. Hasil pengamatan aktivitas antimikroba ... 89
Lampiran 20. Hasil perhitungan % daya hambat ... 91
xviii
Aktivitas Anti Mikroba Sediaan Biomaterial Selulosa Bakteri dari Limbah Ketela Rambat (Ipomoea batatas Poir) dengan Penambahan Kitosan
terhadap Staphylococcus aureus
Arvi Mahendra 098114120 INTISARI
Penelitian dilakukan untuk melihat aktivitas anti mikroba biomaterial selulosa bakteri yang berasal dari pemanfaatan limbah cair ketela rambat yang ditambah dengan gliserol dan kitosan terhadap Staphylococcus aureus.
Sediaan biomaterial terbuat dari selulosa bakteri sebagai kontrol karakterisasi, dan selulosa bakteri+gliserol+kitosan sebagai perlakuan. Kitosan yang ditambahkan sebesar 2%. Analisis karakteristik biomaterial meliputi analisis gugus fungsional, analisis permukaan biomaterial dengan SEM (Scanning Electron Microscopy), serta analisis kristalinitas dengan XRD (X-ray Diffraction).
Untuk melihat aktivitas anti mikroba dilakukan pengujian dengan metode difusi cakram (disk), namun untuk membran biomaterial (selulosa bakteri dan selulosa bakteri+gliserol+kitosan) dan membran kitosan 2%, menggunakan metode tempel pada media MHA (Mueller-Hinton Agar), untuk kontrol positif (amoxicillin)
menggunakan paper disk, begitu pula kontrol negatif (asam asetat 2%). Aktivitas anti mikroba terlihat dari adanya zona hambat yang dapat dihitung melalui persen daya hambat.
Hasil pengujian karakteristik biomaterial selulosa dengan penambahan kitosan adalah adanya perubahan spektra IR, penurunan absorbansi gugus fungsi, perubahan morfologi permukaan, serta perubahan persen kristalinitas dari 72% menjadi 63%. Untuk pengujian aktivitas anti mikroba, dengan penambahan 2% kitosan dapat memberikan zona hambat, sedangkan untuk selulosa bakteri tanpa penambahan kitosan tidak memberikan zona hambat. Rata-rata diameter zona hambat membran selulosa yang ditambahkan kitosan adalah 7,6 mm dengan rata-rata persen zona hambat adalah 24%.
Kata Kunci: aktivitas anti mikroba, biomaterial selulosa bakteri, Ipomoea batatas
xix
Anti Microbial Activity of Bacterial Cellulose Biomaterial from Sweet Potato Waste (Ipomoea batatas Poir) with Addition of Chitosan Agains
Staphylococcus aureus
ABSTRACT
The study was conducted to see the anti microbial activity of bacterial cellulose biomaterials produced from sweet potato waste with addition of chitosan and glycerol agains Staphylococcus aureus.
Biomaterials was prepared from bacterial cellulose as a control characterization, bacterial cellulose+glycerol+chitosan as a treatment. Addition of chitosan is about 2% ( two grams chitosan in 100 mL acetate acid 2%). Characterization analysis included analysis functional groups, morphology structure using SEM (Scanning Electron Microscopy), crystallinity using XRD
(X-ray Diffraction) instrument. Anti microbial activity assay performed with disc diffusion method for amoxicillin as control positive and acetate acid as control negative. Bacterial cellulose and bacterial cellulose+glycerol+chitosan was assay by put the membrane into media MHA (Mueller-Hinton Agar). Anti microbial
activity was seen through blocked zone or clean zone around membrane.
The result showed that addition of chitosan changing characteristic in functional groups, lowering absorbance of the fuctional groups, structural change in morphology, and changing crystalinity from 72% to 63%. The result also showed that bacterial cellulose with addition of chitosan giving anti microbial activity.
BAB I PENGANTAR
A. Latar Belakang
Ketela rambat atau ubi jalar merupakan sejenis umbi-umbian yang banyak diproduksi di Indonesia. Berdasarkan data Badan Pusat Statistik tahun 2012 menunjukkan bahwa produksi ketela rambat mencapai 2.196.033 ton. Hal ini tentu saja membuat ketela rambat menjadi salah satu komoditas yang dapat dikembangkan di Indonesia.
Berdasarkan penelitian Siti Rahayu (2005), setiap 100 kg ketela rambat segar, dapat diubah menjadi tepung sebanyak 19,63 kg. Saat proses pembuatan tepung akan dihasilkan air cucian yang akan dibuang oleh masyarakat. Pembuangan air limbah dapat menyebabkan polusi bagi lingkungan sekitar bila tidak dilakukan dengan benar. Air limbah tersebut akan mengalami penguraian senyawa di perairan dan menimbulkan bau tidak sedap. Untuk mengurangi polusi akibat limbah dapat dilakukan pengolahan air limbah.
Selulosa bakteri adalah selulosa yang diproduksi oleh bakteri asam asetat dan memiliki beberapa keunggulan dibandingkan selulosa yang berasal dari tumbuhan. Keunggulan tersebut di antaranya memiliki kemurnian yang tinggi, struktur jaringan yang sangat baik, kemampuan degradasi tinggi, dan kekuatan mekanik yang unik (Takayasu and Fumihiro, 1997). Selain itu, selulosa bakteri memiliki kandungan air yang tinggi (98-99%), penyerap cairan yang baik, bersifat non-alergenik, dan dapat dengan aman disterilisasi tanpa menyebabkan perubahan karakteristiknya (Ciechańska, 2004). Selain itu selulosa bakteri dapat diaplikasikan sebagai pengganti kulit dalam proses penyembuhan luka kulit.
Selulosa bakteri ini memiliki kelemahan, yaitu mudah menyerap cairan sehingga mudah terkontaminasi oleh mikroba. Selain itu menurut Seichi Tokura (2008), selulosa bakteri tidak memiliki aktivitas antimikroba untuk mencegah kontaminasi mikroba pada selulosa bakteri maupun mencegah infeksi pada luka.
Untuk mengatasi kelemahan tersebut, maka menurut Ciechanska (2004) dapat dilakukan modifikasi dengan cara penambahan suatu bahan lain pada selulosa bakteri tersebut. Dalam kasus ini, modifikasi ditujukan dapat memberikan sifat bakteriostatik pada selulosa bakteri. Bahan yang ditambahkan diantaranya adalah kitosan.
Kitosan adalah produk terdeasetilasi dari kitin yang merupakan polimer alami kedua terbanyak di alam setelah selulosa, yang banyak terdapat pada serangga, crustaceae, dan fungi. Sebagai negara maritim, Indonesia sangat
lingkungan (Sandford, 2003). Kitosan bersifat tidak toksik, biokompatibilitas, biodegrabilitas, bioadhesif, dan mudah dimodifikasi secara kimia sehingga berpotensi besar untuk diaplikasikan dalam dunia farmasi (Burkatovskaya, 2006; Kumar, Joydeep, dan Tripathi, 2004).
Kitosan memiliki aktivitas antibakteri (ElGhaouth, Arul, Aselin, dan Benhamou, 1993; Chen et al. 2002; Yadav 2004; Alexandra, Anna, Bogumila,
Alojzy, dan Lukasz, 2005 ). Terkait dengan itu, di Institue of Chemical Fibers
(IWCh) Polandia, telah melakukan modifikasi selulosa bakteri dengan chitosan
yang bertujuan untuk meningkatkan sifat bioaktif dari selulosa bakteri, dimana dengan meningkatnya sisi bioaktif dari selulosa bakteri maka akan meningkatkan kemampuan dari selulosa bakteri tersebut untuk digunakan sebagai komponen bioaktif dari suatu material sementara untuk merawat luka (Ciechańska, 2004).
Berdasarkan sifat dari kitosan yang menguntungkan, maka kombinasi dari selulosa-kitosan dapat saling menutupi kelemahan masing-masing dan memberikan efek yang diharapkan.
Seiring adanya penambahan kitosan pada selulosa bakteri seringkali membuat lapisan komposit selulosa kitosan menjadi rapuh (Mourya dan Inamdar, 2008). Untuk mengatasi kekurangan tersebut, ditambahkan bahan pemlastis seperti gliserol. Gliserol dapat digunakan karena sifat pemlastisnya, efisiensi pemlastis yang baik, mudah diperoleh, serta biaya produksi yang rendah (Epure, Griffon, Pollet dan Averous, 2011)
rambat sebagai material penutup luka.Sebagai material penutup luka, biomaterial ini diuji aktivitas anti mikrobanya terhadap Staphylococcus aureus.
1. Rumusan masalah
a. Bagaimana karakteristik (gugus fungsi, struktur morfologi, dan kristanilitas) biomaterial selulosa bakteri dari limbah ketela rambat dengan penambahan kitosan dan gliserol?
b. Bagaimana aktivitas anti mikroba biomaterial selulosa bakteri dari limbah ketela rambat dengan penambahan kitosan dan gliserol terhadap
Staphylococcus aureus dilihat dari % daya hambat?
2. Keaslian penelitian
Penelitian yang terkait dengan “Aktivitas Antimikroba Sediaan Biomaterial Selulosa Bakteri dari Limbah Ketela Rambat (Ipomoea Batatas
Poir) dengan Penambahan Kitosan terhadap Staphylococcus aureus” pernah
dilakukan oleh Seiichi Tokura (2008) dengan judul “Impregnation of silver nanopartikel into bacterial cellulose for antimicrobial wound dressing”
dimana pada penelitian ini, didapatkan hasil bahwa nanopartikel yang dimasukkan dalam selulosa bakteri memberikan aktivitas antimikroba terhadap Staphylococcus aureus. Namun penelitian yang menggunakan
3. Manfaat penelitian
a. Manfaat teoritis. Penelitian ini diharapkan dapat memperkaya ilmu pengetahuan tentang pembuatan biomaterial selulosa bakteri dari limbah rumah tangga untuk keperluan biomedis.
b. Manfaat metodologis. Penelitian ini diharapkan dapat menjadi salah satu metode pengembangan selulosa bakteri sebagai penutup luka dari limbah-limbah yang tidak digunakan.
c. Manfaat praktis. Penelitian ini diharapkan dapat menjadi alternatif penutup luka yang dibuat dari limbah ketela rambat (Ipomoea batatas Poir) yang
bersifat ramah lingkungan.
B. Tujuan
1. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui karakteristik (gugus fungsi, morfologi permukaan, dan kristanilitas) biomaterial selulosa bakteri dari limbah ketela rambat dengan penambahan kitosan dan gliserol.
2. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas anti mikroba biomaterial selulosa bakteri dari limbah ketela rambat dengan penambahan kitosan pada
BAB II
PENELAAHAN PUSTAKA
A. Ketela Rambat 1. Sistematika tanaman
Klasifikasi tanaman ketela rambat menurut web www.plantamor.com sebagai berikut :
Kingdom : Plantae (Tumbuhan)
Subkingdom : Tracheobionta (Tumbuhan berpembuluh) Super Divisi : Spermatophyta (Menghasilkan biji) Divisi : Magnoliophyta (Tumbuhan berbunga) Kelas : Magnoliopsida (berkeping dua / dikotil) Sub Kelas : Asteridae
Ordo : Solanales
Famili : Convolvulaceae (suku kangkung-kangkungan) Genus : Ipomoea
Spesies : Ipomoea batatas Poir
2. Nama tanaman
Nama tanaman ketela rambat dapat dibedakan menurut Anonim (2012) : Nama Inggris : Sweet potato
Nama Indonesia : Ubi jalar, ketela rambat
Common name : Ubi keledek (Melayu), Phak man thet (Thailand), Kamote
(Filipina), Satsumaimo (Jepang).
3. Kandungan kimia
Kandungan kimia pada ketela rambat adalah protein, lemak, karbohidrat, kalori, serat, abu, kalsium, fosfor, zat besi, karoten, vitamin B1, B2, C, dan asam nikotinat, pati, sukrosa, dan selulosa. Efek farmakologisnya berkhasiat sebagai tonik, menghentikan perdarahan. Bagian yang bisa dimanfaatkan adalah ubi dan daun (Rukmana, 1997). Ketela rambat memiliki kadar air yang cukup tinggi berkisar 61,2-89,0% (b/b) sehingga bahan kering yang terkandung didalamnya relatif rendah (Kotecha dan Kadam, 1998). Tabel 1 menunjukkan kandungan kimia ketela rambat.
Tabel 1. Kandungan kimia ketela rambat (Kotecha dan Kadam, 1998).
Komponen Jenis Warna Daging Umbi
Orange Putih Ungu
Ketela rambat merupakan tanaman dikotil yang terdiri tidak kurang dari 400 spesies. Tanaman ini merupakan salah satu penghasil karbohidrat, vitamin dan mineral (Damanhuri et al, 2005). Ketela rambat merupakan tanaman
ujung runcing, tidak berbulu, lubak, hijau sampai ungu, lebar 5-15 cm, panjang tangkai 5-30 cm. Bunga ungu muda, bentuk corong, buah diameternya 8 mm, tidak berbulu, berbiji empat dengan warna hitam, bersudut, dan panjang 3 mm. Umbi berwarna putih, ungu, kuning, orange dengan kulit putih atau ungu ( Rukmana, 1997).
B. Pati
Pati merupakan homopolimer glukosa dengan ikatan α- glikosidik yang
tersusun atas atom-atom karbon, hidrogen dan oksigen dengan perbandingan : 6:10:5 (C6H10O5)n. Pati merupakan polimer kondensasi dari suatu glukosa yang tersusun dari unit-unit anhidroglukosa (Damanhuri et al. 2005).
Pati terdiri dari 2 fraksi yang dapat dipisahkan dengan air panas. Fraksi terlarut disebut amilosa dan fraksi yang tidak larut disebut amilopektin. Amilosa merupakan polimer linier yang mengandung 500-2000 unit glukosa yang terikat oleh ikatan α-(1,4) sedangkan amilopektin selain mengandung ikatan α-(1,4) juga mengandung ikatan α-(1,6) sebagai titik percabangannya (Sukadarti et al. 2001).
Hidrolisis lengkap amilosa meghasilkan hanya D-Glukosa; hidrolisis parsial menghasilkan maltose sebagai satu-satunya disakarida. Molekul amilosa dan
amilopektin dapat dilihat pada Gambar 1 dan Gambar 2.
Gambar 1. Struktur molekul amilosa
Gambar 2. Struktur molekul amilopektin
(Sukadarti et al. 2001)
Tidak seperti amilosa, amilopektin bercabang sehingga terdapat satu glukosa ujung kira-kira tiap 25 satuan glukosa. Ikatan pada titik percabangan ialah ikatan 1,6-α-glikosida (Sukadarti et al. 2001). Hidrolisis lengkap amilopektin
hanya menghasilkan D-glukosa. Namun hidrolisis tak lengkap menghasilkan suatu campuran disakarida maltosa dan isomaltosa, yang kedua ini berasal dari percabangan-1,6 (Sukadarti et al. 2001).
C. Selulosa Bakteri
Selulosa merupakan material yang terdapat secara alamiah pada kayu, kapas, rami serta tumbuhan lainnnya. Selulosa juga merupakan polimer dari β -glukosa dengan ikatan β- 1-4 antara unit-unit glukosa (Hoenich, 2006). Struktur selulosa dapat dilihat dari Gambar 3 :
Gambar 3. Struktur selulosa
Selulosa bakteri adalah selulosa yang diproduksi oleh mikroba terutama bakteri dari galur Acetobacter, Rhizobium, Agrobacterium dan Sarcina (El-Saied et al. 2004). Selulosa bakteri memiliki karakteristik yaitu, mengandung air
sebanyak 98-99%, tidak menimbulkan reaksi alergi, dapat disterilisasikan tanpa menyebabkan perubahan pada selulosanya. Dapat diaplikasikan untuk pengobatan ketika kulit mengalami luka bakar. Selulosa bakteri disintesis oleh bakteri asam, terutama Acetobacter xylinum (Ciechanska, 2004). Pembentukan selulosa bakteri
dapat dilihat pada Gambar 4.
Gambar 4. Skema pembentukan selulosa
(Czaja et al. 2006)
Pembentukan selulosa dapat dijelaskan sebagai berikut : sel-sel
Acetobacter xylinum mengambil glukosa dari larutan gula dan air limbah ubi jalar
Selulosa bakteri berbeda dari selulosa tanaman dalam hal kemurnian, kristalinitas, derajat polimerisasi, dan tensile strength. Selulosa bakteri memiliki
bentuk Kristal Iα dan Iβ, sedangkan selulosa tanaman hanya memiliki struktur
Kristal Iβ (Attala et al. 1984). Menurut Czaja et al. (2006) selulosa bakteri
memiliki keunggulan antara lain : kemurnian tinggi, derajat kristalinitas tinggi, mempunyai kerapatan antara 300-900 kg/m3, kekuatan tarik tinggi, elastic dan dapat terbiodegradasi. Struktur selulosa bakteri ditunjukkan melalui Gambar 5 :
Gambar 5. Struktur selulosa bakteri
saling melilit satu sama lain membentuk struktur jaringan. Diameter dari selulosa bentuk kristalin adalah 10–30 nm (Philips dan Williams, 2000).
D. Aplikasi Selulosa Bakteri dalam Bidang Medis
Selulosa mikrobial yang disintesis oleh Acetobacter xylinum menunjukkan
kinerja yang cukup baik untuk dapat digunakan dalam penyembuhan luka. Selulosa bakteri juga mempunyai kerangka jaringan yang sangat baik dan hidrofilisitas yang tinggi sehingga dapat digunakan sebagai pembuluh darah buatan yang sesuai untuk pembedahan mikro (Hoenich, 2006).
Selulosa bakteri menunjukkan kandungan air yang tinggi (98-99%), daya serap yang baik terhadap cairan, bersifat non-allergenik dan dapat disterilisasi tanpa mempengaruhi karakteristik dari bahan tersebut. Selulosa bakteri dapat digunakan sebagai pengganti kulit untuk merawat luka bakar yang serius karena karakteristiknya yang mirip seperti kulit manusia. (Ciechanska, 2004).
Penutup luka yang ideal menurut Eldin, Soliman, Hashem dan Tamer (2008) serta Czaja et al. (2006) adalah sebagai berikut. Menyediakan lingkungan
medis, tidak menempel di luka dan ketika dilepas tidak menyebabkan rasa nyeri atau trauma pada luka.
E. Acetobacter xylinum
Bakteri Acetobacter xylinum berbentuk elips atau tongkat yang
melengkung, memiliki lebar 0,5-1 µm dan panjang 2-10 µm. Acetobacter
merupakan bakteri aerob, yang memerlukan respirasi dalam metabolisme. Bakteri
Acetobacter xylinum mampu mengoksidasi glukosa menjadi asam glukonat dan
asam organik lain pada waktu yang sama. Sifat yang paling menonjol dari bakteri itu adalah memiliki kemampuan untuk mempolimerisasi glukosa menjadi selulosa. Acetobacter dapat mengoksidasi etanol menjadi asam asetat, juga dapat
mengoksidasi asetat dan laktat menjadi CO2 dan H2O (Warisno, 2004).
Acetobacter xylinum menghasilkan selulosa sebagai produk metabolit
sekunder, sedangkan produk metabolit primernya adalah asam asetat. Semakin banyak kadar nutrisi, semakin besar kemampuan menumbuhkan bakteri tersebut maka semakin banyak selulosa yang terbentuk (Çoban dan Biyik, 2011)
Acetobacter xylinum mampu mensintesis selulosa dari gula yang
dikonsumsi. Nata yang dihasilkan berupa pelikel yang mengambang dipermukaan substrat. Untuk dapat menghasilkan massa yang kokoh, kenyal, tebal, putih dan tembus pandang, perlu diperhatikan suhu inkubasi, komposisi, dan pH medium (Warisno, 2004).
Beberapa faktor menurut Warisno (2004) yang mempengaruhi pertumbuhan
a) Sumber karbon
Sumber karbon yang dapat digunakan dalam fermentasi nata adalah senyawa karbohidrat yang tergolong monosakarida dan disakarida. Pembentukan nata dapat terjadi pada media yang mengandung senyawa – senyawa glukosa, sukrosa, dan laktosa. Sementara yang paling banyak digunakan berdasarkan pertimbangan ekonomis, adalah sukrosa atau gula pasir.
b) Sumber nitrogen
Sumber nitrogen yang dapat digunakan dapat berupa ekstrak yeast dan kasein. Sumber nitrogen lainnya yang dapat digunakan atas dasar alasan ekonomis adalah urea, dan ammonium fosfat.
c) Tingkat keasaman (pH)
Meskipun bisa tumbuh pada kisaran pH 3,5 – 7,5 , bakteri Acetobacter xylinum sangat cocok tumbuh pada suasana asam (pH 4,3). Jika kondisi
lingkungan dalam suasana basa, bakteri ini akan mengalami gangguan metabolisme selnya.
d) Temperatur
Adapun suhu ideal (optimal) bagi pertumbuhan bakteri Acetobacter xylinum adalah 280C – 310C. Kisaran suhu tersebut merupakan suhu
F. Staphylococcus aureus
Bakteri adalah sel prokariotik tanpa klorofil yang khas, dan bersel tunggal (uniseluler). Bahan sel bakteri (sitoplasma dan intinya) dikelilingi oleh membran sitoplasma yang berfungsi mengendalikan keluar masuknya suatu bahan ke dalam sel. Bagian luar yang menutupi membran sitoplasma ialah dinding sel yang kaku yang mengandung peptidoglikan. Staphylococcus aureus merupakah salah satu
bakteri gram positif yang ditemukan saat kulit mengalami luka/infeksi (Lay dan Sugyo 1992).
Ciri bakteri gram positif adalah : memiliki struktur yang tebal (15-80 nm); dinding sel berlapis tunggal; memiliki kandungan lipid yang rendah (1-4%); dinding sel terdiri dari peptidoglikan yang lebih dari 50% bobot kering, ada asam teikoat (Pelczar dan Chan, 1986)
Peptidoglikan adalah suatu polimer yang terdiri dari tiga macam bahan pembangun, yaitu asam N-asetil-glukosamin (NAG), Asam N-Asetil-Muramat (NAM) dan suatu peptida yang terdiri dari empat sampai lima asam amino, yaitu L-Alanin, D-Alanin, asam D-Glutamat dan Lisin atau diamino tinelat. Peptidoglikan ini memberikan bentuk dan kakunya dinding sel (Lay dan Sugyo 1992). Dinding sel bakteri gram positif dapat dilihat pada Gambar 6.
dua kelompok berdasarkan respon yang berbeda terhadap pewarnaan Gram, yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif
Bakteri gram-positif memiliki kandungan peptidoglikan yang tinggi dibandingkan dengan bakteri gram-negatif. Bakteri gram-positif memiliki asam teikoat, polimer yang bersifat asam yang mengandung ribitol fosfat atau gliserol fosfat. Asam teikoat ini bermuatan negatif, sehingga menyebabkan muatan negatif pada permukaan sel bakteri gram-positif (Lay dan Sugyo 1992).
Gambar 6. Struktur dinding sel bakteri gram positif
G. Kitosan
Kitosan merupakan polimer linier yang tersusun oleh 2000-3000 monomer N-asetil-D-glukosamin dalam ikatan β-(1-4), tidak toksik dengan LD50 setara dengan 16 g/kg BB dan mempunyai berat molekul 800 KDa. (Muzzarelli, 1997;
Shahidi, Arachchi, dan Jeon, 1999). Kitosan merupakan senyawa kitin yang sudah mengalami deasetilasi. Kitosan merupakan komponen mayoritas yang menyusun dinding sel dari jamur tertentu, terutama spesies Zygomycetes. Sekarang ini kitosan telah diproduksi secara komersial melalui deasetilasi kitin yang diperoleh dari crustaceae (Muzzarelli, 1997). Gambar 7 menunjukkan struktur dari kitosan.
Gambar 7. Struktur kitosan (Kumar, 2004)
Kitosan memiliki sifat biodegradable dan biokompatibel, tidak
mengandung racun dan banyak digunakan dalam industri. Kitosan dan turunannya merupakan antimikroba alami dan beberapa studi telah membuktikan kemampuan kitosan sebagai antimikroba (Jin Xiaoxiao, Wang, dan Bai, 2009).
metabolisme sel dengan menghambat kerja enzim intraseluler; dan (5) menghambat sintesis protein yang menyebabkan kerusakan total sel.
Kitosan memiliki reaktivitas kimia yang baik karena mempunyai sejumlah gugus hidroksil (OH) dan gugus amin (NH2) pada rantainya. Kitosan adalah contoh polisakarida yang bersifat basa dan merupakan suatu heteropolimer (Kumar, 2004).
H. Karakteristik Kitosan
Kitosan merupakan padatan putih yang tidak larut dalam air, pelarut organik, alkali, dan asam mineral, dalam berbagai kondisi. Kitosan larut dalam asam formiat, asam asetat, dan asam organik lainnya dalam keadaan dipanaskan sambil diaduk. Kitosan larut dalam asam mineral pekat, apabila dalam kondisi yang bagus diperoleh dalam bentuk endapan. Namun dengan asam nitrat, kitosan yang terbentuk adalah kitosan nitrat yang sukar larut. Pelarut yang paling sering digunakan adalah asam asetat. Kelarutan kitosan yang paling baik adalah dalam larutan asam asetat 2% (Nadarajah, 2005)
Parameter lain yang berpengaruh pada sifat kitosan adalah berat molekul (BM) dan derajat deasetilasi (DD). Derajat deasetilasi menunjukkan berkurangnya gugus asetil dari kitin menjadi gugus amino pada kitosan. Penentuan DD dapat dilakukan dengan beberapa metode, seperti titrimetri HBr, spektroskopi IR, X-Ray Diffraction dan spektroskopi 1H NMR. Penentuan DD dengan spektroskopi IR
dilakukan dengan metode base line. Berikut ini rumus untuk perhitungan DD
seperti ditunjukkan oleh Persamaan 1.
DD = 100 – �1655 �3450 �
100
Keterangan:
DD = Derajat Deasetilasi
A1655 = absorbansi pada bilangan gelombang 1655 cm-1 yang menunjukkan serapan karbonil dari amida.
A3450 = absorbansi pada bilangan gelombang 3450 cm-1 yang menunjukkan serapan hidroksil dan digunakan sebagai standar internal.
Faktor 1,33 merupakan nilai perbandingan �1655
�3450 untuk kitosan terdeasetilasi 100% (Khan, Peh dan Chang, 2002).
I. Gliserol
Gliserol adalah senyawa poliol netral, dengan rasa manis, tidak berwarna, cairan kental dengan titik lebur 200 C dan memiliki titik didih yang tinggi yaitu 2900 C. Gliserol dapat larut sempurna dalam air dan alkohol, tetapi tidak dalam minyak. Sebaliknya banyak zat dapat lebih mudah larut dalam gliserol dibanding dalam air maupun alkohol. Oleh karena itu gliserol merupakan pelarut yang baik (Goudung, 2004).
J. Analisis Gugus Fungsi dengan Spektofotometri Infra Merah
Analisis kualitatif, dilakukan untuk mengetahui ada atau tidaknya absorbsi pada frekuensi tertentu dan merupakan penanda ada tidaknya gugus fungsional tertentu. Penggunaan spektrofotometri infra merah pada bidang kimia organik menggunakan daerah dari 650-4000 cm-1 (15,4-2,5 μm) (Sastrohamidjojo, 2007).
Gugus fungsional dalam molekul dianalisis secara kualitatif dengan melihat bentuk spektrumnya yaitu dengan melihat puncak spesifik yang menunjukkan jenis gugus funsgional. Analisis secara kuantitatif dilakukan berdasarkan hukum Lambert-Beer, ditunjukkan pada Persamaan 2.
A = log (Io/I) = a x c x l……….(2)
Keterangan : A = absorbansi
Io = intensitas sinar masuk
I = Intensitas sinar yang ditransmisikan a = koefisien absorpsi (M-1 cm-1) c = konsentrasi zat (M)
l = panjang lintasan (cm)
Untuk mengoreksi kesalahan yang timbul akibat adanya overlap puncak
absorpsi, maka garis dasar (base line) dalam spektrum infra merah harus dibuat
seperti ditunjukkan pada Gambar 9, I dan Io ditentukan sebagai intesitas transmisi pada garis dasar. Absorbansi (A) pada frekuensi yang diberikan (dalam cm-1) terlihat pada Persamaan 3.
Keterangan :
AC= Io = intensitas sinar masuk
AB= I = intensitas sinar yang ditransmisikan
AC dan AB ditentukan dari spektrum infra merah seperti ditunjukkan pada Gambar 8.
Gambar 8. Metode mengkonstruksi garis dasar dalam spektrum infra merah
(Sastrohamidjojo, 2007) Gambar 9 menunjukkan karakteristik serapan dari selulosa bakteri menunjukkan puncak di sekitar daerah 3350 cm-1 yang menunjukkan O-H
stretching dan di sekitar daerah 2916,81 cm-1 yang menunjukkan CH stretching.
Adanya pita di sekitar daerah 1649,8 cm-1 yang menunjukkan deformasi vibrasi dari molekul air yang terabsorbsi (Wonga, Kasapis dan Tan, 2009). Adapun karakteristik serapan dari kitosan ditunjukkan dengan puncak di sekitar 1559,17 cm-1 yang menunjukkan vibrasi stretching dari gugus amino kitosandan di sekitar
daerah 896,73 cm-1 dan 1154,19 cm-1 berkaitan dengan struktur sakarida dari kitosan. Adanya puncak yang melebar di sekitar daerah 1080,91 cm-1 menunjukkan vibrasi stretching C-O (de Souza Costa-Junior, Pereira dan Mansur,
2009; Rao, Naidu, Subha, Sairam dan Aminabhavi, 2006). Gambar 9 menunjukkan contoh spektra inframerah dari selulosa bakteri dan kitosan.
Gambar 9. Spektra inframerah dari selulosa bakteri dan kitosan
(Anicuta, Dobre, Stroescu dan Jipa, 2010) Berdasarkan Gambar 9 dapat dikorelasikan untuk memudahkan dalam pembacaan gugus-gugus fungsi dari spectra inframerah yang didapatkan. Hasil korelasi disajikan pada Tabel II.
Selulosa Bakteri
Tabel II. Hasil korelasi gugus fungsi 7 1158 1154 Anti-symmetric stretching
of the C-O-C bridge
8 1067 1072 Skeletal vibrations involving the C-O stretching
K. Analisis Permukaan dengan Teknik Scanning Electron Microscopy (SEM)
Foto SEM dibuat berdasarkan deteksi elektron sekunder atau elektron pantul yang muncul dari permukaan sampel ketika permukaan sampel tersebut
di-scan dengan sinar elektron. Elektron sekunder atau elektron pantul yang
terdeteksi, kemudian sinyalnya diperkuat, besar amplitudonya ditampilkan dalam gradasi gelap terang pada layar monitor CRT (cathode ray tube). Pada layar CRT
Gambar 10. Foto SEM Selulosa bakteri
(Freire, Silvestre, Gandini dan Neto, 2011) L. Analisis kristalinitas dengan Difraksi Sinar X (XRD)
Difraksi sinar X merupakan metode analisis yang didasarkan pada hamburan cahaya pada kisi kristal yang dikenai sinar X. Teknik ini memungkinkan determinasi derajat kristalinitas sampel beserta data kristalografik lainnya (Braun, et al. 2005).
Derajat kristalinitas dari suatu polimer akan mempengaruhi aktivitas polimer tersebut, selain itu derajat kristalinitas berhubungan dengan struktur rantai polimer. Semakin linier rantai polimer maka derajat kristalinitasnya akan semakin besar, sehingga bersifat semakin kristalin, sebaliknya apabila strukturnya bercabang maka akan cenderung bersifat amorf. XRD sangat penting untuk analisis polimer karena XRD dapat memperlihatkan indeks dari struktur kristal, dan derajat kristalinitas (Rosida, 2007).
Menurut Anggraeni (2003), derajat kristalinitas dapat ditentukan dengan cara menghitung perbandingan luas difraksi kristalin terhadap luas total difraksi (amorf dan kristalin) seperti ditunjukkan oleh Persamaan 4.
Derajat kristanilitas = Luas kristalin
Contoh hasil difraksi sinar-X dari selulosa dan kitosan dapat dilihat dari Gambar 11.
Gambar 11. Difraktogram XRD dari selulosa bakteri dan kitosan
(Stefanescu et al.,2012)
M. Antibakteri
Antibakteri diartikan sebagai zat yang dapat menggangu pertumbuhan dan metabolisme bakteri (Pelzcar dan Chan, 1986). Berdasarkan aktivitasnya, zat antibakteri dibedakan menjadi dua, yaitu yang memiliki aktivitas membunuh yang dikenal dengan bakterisidal seperti penisilin, basitrasin, dan neomisin, dan yang memiliki aktivitas menghambat pertumbuhan atau dikenal dengan bakteriostatik seperti tetrasiklin, kloramfenikol, dan novobiosin (Pelzcar & Chan 1986).
Penggolongan antibiotika/antibakteri berdasarkan cara kerjanya terhadap bakteri menurut Lüllmann, Mohr, Hein & Bieger (2005) adalah sebagai berikut :
b. Antibiotika yang mengganggu keutuhan membran sel mikroba, yang termasuk kelompok ini adalah polimiksin, golongan polien serta berbagai antibakteri kemoterapetik.
c. Antibiotika yang bekerja dengan menghambat sintesa protein, yang termasuk golongan ini adalah kloramfenikol, eritromisin, linkomisin, tetrasiklin dan antibiotika golongan aminoglikosida.
Penggolongan antibiotika berdasarkan gugus kimanya menurut Katzung (2007) adalah sebagai berikut :
a. Senyawa Beta-laktam dan Penghambat Sintesis Dinding Sel Lainnya. Mekanisme aksi penisilin dan antibiotika yang mempunyai struktur mirip
dengan β-laktam adalah menghambat pertumbuhan bakteri melalui
pengaruhnya terhadap sintesis dinding sel. Dinding sel ini tidak ditemukan pada sel-sel tubuh manusia dan hewan, antara lain: golongan penisilin, sefalosporin dan sefamisin serta betalaktam lainnya.
b. Kloramfenikol, Tetrasiklin, Makrolida, Clindamisin dan Streptogramin. Golongan agen ini berperan dalam penghambatan sintesis protein bakteri dengan cara mengikat dan mengganggu ribosom, antara lain: kloramfenikol, tetrasiklin, makrolida, klindamisin, streptogramin,
oksazolidinon. c. Aminoglikosida
Golongan Aminoglikosida, antara lain: streptomisin, neomisin, kanamisin,
N. Pengujian Aktivitas Antimikroba
Menurut Pelzcar dan Chan (1986) terdapat dua cara pengujian antibakteri, yaitu teknik dilusi dan teknik difusi. Teknik dilusi yaitu dengan mencampur zat antibakteri dengan medium yang kemudian diinokulasi dengan bakteri uji. Dasar pengamatannya adalah dengan melihat tumbuh tidaknya bakteri uji tersebut. Ada 2 cara teknik dilusi, yaitu cara penipisan lempeng agar dan cara pengenceran tabung. Pada teknik difusi, zat yang akan ditentukan aktivitas antibakterinya berdifusi pada lempeng agar yang telah ditanami bakteri. Dasar pengamatannya adalah ada atau tidaknya zona hambatan pertumbuhan bakteri. Teknik difusi ini ada 3 macam cara, yaitu cara parit (ditch), cara lubang/cawan (hole/cup) dan cara
cakram (disc).
Todar (1997) mengemukakan bahwa ketentuan kekuatan antibiotik-antibakteri antara lain, daerah hambatan 20 mm atau lebih berarti sangat kuat, daerah hambatan 10 sampai 20 mm berarti kuat, daerah hambatan 5 sampai 10 mm berarti sedang, dan daerah hambatan 5 mm atau kurang berarti lemah.
O. Landasan Teori
Selulosa bakteri dapat dibuat dari bahan dasar limbah ketela rambat melalui proses fermentasi yang dilakukan oleh bakteri Actobacter xylinum.
modifikasi pada selulosa bakteri dengan menambahkan bahan lain tertentu, salah satunya adalah kitosan.
Kitosan sendiri ini bersifat sebagai bakteriostatik serta mempercepat regenerasi sel pada kulit yang rusak. Penambahan kitosan ini diharapkan dapat meningkatan sifat bioaktif dari selulosa bakteri. Untuk mengetahui karakterisasi membran yang terbentuk maka dilakukan analisis karakteristik membran yang meliputi analisis gugus fungsi, serta analisis permukaan membran. Untuk mengetahui nilai aktivitas antimikroba dari membran (selulosa, selulosa+kitosan+gliserol, kitosan) maka dilakukan pengujian dengan metode difusi cakram (disk), sehingga dapat memberikan nilai aktivitas antimikroba selulosa bakteri terhadap Staphylococcus aureus yang dapat teramati dari % daya
hambat.
P. Hipotesis
1. Selulosa bakteri dapat dibuat dengan bahan air cucian ketela rambat, dan dapat dimodifikasi dengan penambahan kitosan, serta memiliki karakteristik (gugus fungsi, morfologi permukaan, dan kristalinitas) yang berbeda dibandingkan selulosa bakteri tanpa modifikasi..
2. Modifikasi selulosa bakteri dengan penambahan kitosan akan memberikan aktivititas antimikroba.
BAB III
METODE PENELITIAN
A. Jenis Penelitian
Penelitian ini merupakan jenis penelitian yang bersifat eksperimental murni dengan rancangan pola searah.
B. Variabel Penelitian Variabel dalam penelitian ini terdapat dua variabel, yaitu : 1. Variabel utama
Variabel utama dalam penelitian ini meliputi :
a. Variabel bebas : Konsentrasi kitosan yang ditambahkan dalam preparasi sediaan biomaterial selulosa bakteri.
b. Variabel tergantung
1) Karakteristik biomaterial yang dihasilkan (gugus fungsi, morfologi permukaan, serta kristalinitas)
2) Diameter zona hambat yang dihasilkan oleh biomaterial selulosa bakteri-kitosan terhadap pertumbuhan Staphylococcus aureus.
2. Variabel pengacau
Variabel pengacau dalam penelitian ini meliputi :
b. Variabel pengacau tak terkendali : kelembaban dan kemurnian kitosan, kondisi bakteri.
C. Definisi Operasional
1. Selulosa bakteri adalah polimerisasi glukosa yang merupakan hasil fermentasi bakteri Acetobacter xylinum selama 7 hari.
2. Ketela rambat adalah ketela yang tumbuh merambat di atas tanah yang memiliki varietas bermacam-macam. Pada penelitian ini ketela rambat yang digunakan adalah ketela rambat dengan varietas berwarna putih.
3. Limbah ketela rambat adalah limbah cair yang dihasilkan dari proses pencucian ketela rambat pada saat pembuatan tepung ketela rambat.
4. Kitosan adalah senyawa hasil deasetilasi chitin, terdiri dari unit N-asetil
glukosamin dan N-glukosamin.
5. Staphlococcus aureus ATCC 25923 merupakan bakteri gram positif yang
diperoleh dari Laboratorium Balai Kesehatan Yogyakarta.
6. Film adalah lembaran tipis dari biomaterial yang telah dikeringkan.
7. Metode difusi cakram adalah metode pengukuran daya hambat suatu bahan obat terhadap mikroorganisme tertentu dengan mengukur zona radikal yang terbentuk di sekeliling cakram.
9. Analisis struktur morfologi merupakan analisis untuk melihat bentuk morfologi/kenampakan dari biomaterial baik kenampakan bentuk permukaan maupun kenampakan bentuk melintang
D. Alat dan Bahan 1. Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi : Spektrofotometer IR (IR Shimadzu Prestige-21), seperangkat instrumen SEM (Jeol JSM T300), fine coat ion sputter (Jeol JFC 1100), alat XRD (Rigaku Multiflex 2 kW),
pH stik Merck, karet, kertas pembungkus, sendok, penggaris skala milimeter. 2. Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah air limbah ketela rambat yang daging umbinya berwarna putih, kitosan kualitas teknis dari Chemix, urea kualitas teknis dari p.a E.Merck, asam asetat 25% dari p.a.E.Merck, alkohol 70 % kualitas teknis, asam asetat glasial kualitas teknis, gliserol kualitas teknis, NaOH kualitas p.a. buatan E.Merck, HCl kualitas p.a.
Mikrobiologi Balai Kesehatan Yogyakarta, kloramfenikol. media Mueller-Hinton Agar (MHA), media Brain Heart Infusion broth (BHI broth), starter
Bakteri Acetobacter xylinum dari Chemix.
E. Tata Cara Penelitian 1. Determinasi tanaman
Determinasi tanaman ketela rambat ini dilakukan dengan bantuan seorang determinator. Cara determinasi dengan membandingkan ciri-ciri tanaman ketela rambat yang ditumbuhkan sendiri dengan ciri-ciri tanaman ketela rambat yang ada dalam web botani resmi (www.plantamor.com), serta mencocokkan dengan buku deskripsi tanaman ketela rambat menurut Huaman (1991).
2. Pemilihan bahan
Umbi ketela rambat yang dipilih adalah umbi berwarna putih, kulitnya berwarna kekuningan, serta dengan kondisi yang baik, tidak belubang-lubang. Masa panen 110 hari setelah penanaman. Umbi didapatkan di pasar Klaten. 3. Preparasi Limbah Ketela Rambat
hasil penyaringan pertamanya langsung dipindahkan ke dalam botol plastik sambil dibiarkan selama 3 jam agar pati yang belum mengendap ini mengendap di dalam botol plastik. Cairan di atas endapan ini diambil untuk proses pembuatan biomaterial.
4. Pembuatan Kitosan Sebagai Pembanding
Sejumlah 2 gram kitosan dilarutkan dalam 100 mL asam asetat 2% di atas
hot plate. Pada nampan yang sudah dicuci dengan alkohol 70% dan di oven,
kemudian larutan dituang dan diletakkan selama beberapa hari dalam ruangan inkubasi untuk menjamin penguapan solven secara sempurna. Setelah beberapa hari maka akan terbentuk produk membran yang transparan dan fleksibel. Produk ini lalu disimpan dalam toples yang sudah diberi silika gel sebelumnya (Eldin, Soliman, Hashem, Tamer, 2008)
5. Pembuatan Material Selulosa Bakteri
Sebanyak 200 mL air limbah ketela rambat hasil penyaringan dituangkan ke dalam elenmeyer yang telah dilengkapi dengan magnetic stirer, kemudian
ditambahkan 20 gram gula pasir dan 1 gram urea, dan diaduk hingga larut. Campuran diasamkan dengan penambahan asam asetat 25% hingga pH = 3-4, diaduk hingga larut. Selanjutnya dituangkan dalam keadaan panas ke dalam nampan yang telah disterilkan dengan alkohol 70% dan ditutup dengan kertas koran dan diplester pada beberapa bagian nampan. Larutan dalam wadah dibiarkan hingga suhu kamar, lalu ditambahkan 50 mL Acetobacter xylinum.
Setelah ditambahkan Acetobacter xylinum, nampan diplester pada semua sisi
Setelah 7-14 hari, lapisan pelikel yang terbentuk dicuci dengan aquabidest untuk menghilangkan residu media kultur, lalu dengan air panas, lalu lapisan pelikel ini ditimbang dengan timbangan digital. Setelah itu lapisan pelikel direndam dengan natrium hidroksida 3% selama 48 jam. Setelah 48 jam, lapisan pelikel dicuci kembali dengan aquadest, lalu direndam dengan asam klorida 3% selama 15 menit. Setelah 15 menit, lapisan pelikel dicuci kembali dengan aquadest hingga pH netral. Kemudian lapisan pelikel ditimbang, lalu lapisan pelikel dikeringkan dalam oven pada suhu 40-500C. Setelah kering, lapisan pelikel ini ditimbang, lalu dimasukkan dalam toples yang sudah diisi silika gel sebelumnya. (Chawla, Bajaj, Survase, Singhal, 2008).
6. Pembuatan Material Selulosa Bakteri + Gliserol + Kitosan (SGK)
Sebanyak 200 mL air limbah ketela rambat hasil penyaringan dituangkan ke dalam Elenmeyer yang telah dilengkapi dengan magnetic stirer, kemudian
ditambahkan 20 gram gula pasir dan 1 gram urea, dan 1.2 mL gliserol, kemudian diaduk hingga larut. Campuran diasamkan dengan penambahan asam asetat 25% hingga pH = 3-4, diaduk hingga larut. Selanjutnya dituangkan dalam keadaan panas ke dalam nampan yang telah disterilkan dengan alkohol 70% dan ditutup dengan kertas koran dan diplester pada beberapa bagian nampan. Larutan dalam wadah dibiarkan hingga suhu kamar, lalu ditambahkan 50 mL Acetobacter xylinum. Setelah ditambahkan Acetobacter xylinum, nampan diplester pada semua sisi hingga tertutup rapat.
media kultur, lalu dengan air panas, lalu lapisan pelikel ini ditimbang dengan timbangan digital. Setelah itu lapisan pelikel direndam dengan natrium hidroksida 3% selama 48 jam. Setelah 48 jam, lapisan pelikel dicuci kembali dengan aquadest, lalu direndam dengan asam klorida 3% selama 15 menit. Setelah 15 menit, lapisan pelikel dicuci kembali dengan aquadest hingga pH netral. Kemudian ditambahkan 2 gram kitosan yang telah dilarutkan dalam 100 mL asam asetat 2% dalam keadaan panas ke dalam wadah yang terdapat pelikel/membran selulosa bakteri. Pelikel kemudian dikeringkan dalam oven pada suhu 40-500C . Setelah kering, membran selulosa+kitosan+gliserol ini dimasukkan dalam toples yang berisi silika gel (Chawla et al. 2009).
7. Analisis Karakteristik Biomaterial : a. Analisis sifat fisik secara makroskopis.
Analisis ini meliputi pengamatan dari warna, tekstur, bentuk dan transparansi dari masing-masing sampel.
b. Analisis FT – IR
b. Analisis SEM
Material selulosa kitosan bakteri dipotong sedemikian rupa, kemudian ditempatkan di atas tempat sampel yang terbuat dari kuningan. Sampel disepuh dengan dengan emas (coating) dengan alat ion coater
selama kurang lebih 5 menit. Selanjutnya sampel dimasukkan ke unit elektron gun melalui bilik pergantian sampel. Kemudian sampel diset dengan bantuan mikrostage sampai mendapatkan fokus yang tepat. Tombol utama pada posisi ON dan diset detektor Accelerate voltage set,
20 kilo volt.
c. Analisis kristalinitas dengan alat X-ray Diffraction (XRD)
Uji XRD ini dilakukan dengan memakai instrumen X-Ray Diffraction yang dilakukan di Laboratorium XRD, Jurusan Teknik
Geologi UGM. Langkah-langkahnya adalah lembaran film dipotong dengan ukuran 2x2 cm. Sampel tersebut kemudian dipasang di sample holder dan sampel diusahakan rata di atas sample holder. Selanjutnya
pendingin alat XRD dihidupkan dan instrumen XRD dihidupkan lalu diatur kondisi alat dengan sudut putar 2θ = 2° sampai 80°, scan step = 0,04
dan scan speed = 4°/menit serta tegangan dan arus pada instrumen
disesuaikan dengan standard measurenment dari instrumen dan
8. Sterilisasi produk
Produk biomaterial yang sudah dikeringkan ini lalu dibungkus dengan kertas coklat lalu diautoklaf dengan suhu 1210 C selama 15 menit.
9. Pengujian aktivitas anti mikroba 1. Pembuatan suspensi bakteri uji
Isolat murni Staphylococcus aureus ditambahkan ke dalam media BHI
broth yang diinkubasi pada 37oC selama kurang lebih 4 jam sampai kekeruhan
Brain Heart Infusion broth (BHI broth) menyamai kekeruhannya McFarland
no. 0,5 (Christoforus, 2010). 2. Pembuatan media
Media yang digunakan untuk uji aktivitas antimikroba adalah MHA. Larutan MHA dituangkan ke dalam cawan petri sebanyak 25 mL dan dibiarkan beberapa saat hingga memadat (Christoforus, 2010).
3. Penanaman bakteri uji
Hasil suspensi bakteri uji sebanyak 0,2 mL dimasukkan ke dalam media
Mueller-Hinton Agar (MHA) dengan cara dioleskan secara merata dengan
menggunakan kapas kirbi bauer, lalu didiamkan kurang lebih selama 5 menit (Christoforus, 2010).
4. Pemberian kontrol positif pada bakteri uji
Sebagai kontrol positif, digunakan antibiotik Amoxicilin. Bakteri uji yang sudah ditanamkan pada Mueller-Hinton Agar kemudian diberi paper disk
5. Pemberian kontrol negatif pada bakteri uji
Sebagai kontrol negatif, digunakan asam asetat. Sebanyak 20 µ L asam asetat diteteskan pada paper disk. Bakteri uji yang sudah ditanamkan pada
Mueller-Hinton Agar kemudian diberi paper disk berisi asam asetat tadi
sebanyak 1 disk per plate. Kemudian inkubasikan pada 37oC selama 24 jam. 6. Pemberian biomaterial selulosa, selulosa+kitosan+gliseral, dan kitosan pada
bakteri uji
Bakteri uji yang sudah ditanamkan pada Mueller-Hinton Agar kemudian
diberi potongan biomaterial selulosa yang sudah disterilisasi sebelumnya. Biomaterial selulosa ini dipotong serupa dengan bentuk dan ukuran paper disk yang bertindak sebagai kontrol positif dan kontrol negatif tadi. Diletakkan sebanyak 1 potongan biomaterial per plate. Kemudian inkubasikan pada 37oC selama 24 jam. Hal yang sama juga dilakukan untuk membran kitosan dan selulosa bakteri+kitosan+gliserol.
7. Pengukuran zona hambat
Pengukuran zona hambat dilakukan dengan mengukur diameter zona hambat dalam millimeter, kemudian dihitung persentase kekuatan aktivitas daya hambat dihitung menggunakan rumus berikut :
% daya hambat = ..
(Ardhuha, dan Harapan, 2010). (diameter zona hambat zat uji – kontrol negatif)
(diameter zona hambat kontrol positif) positif)
F. Analisis Data
1.
Analisis karakteristik dari biomaterial yang terbentuk ini meliputi analisis sifat fisik secara makroskopik dan organoleptis, gugus fungsi, uji morfologi permukaan, dan uji kristalinitas untuk membran kitosan, membran selulosa, serta membran selulosa+kitosan+gliserol.2. Analisis hasil untuk uji aktivitas anti mikroba dilakukan dengan mengukur zona jernih yang muncul (zona hambat) menggunakan penggaris skala milimeter, kemudian dihitung persentase daya hambat untuk setiap perlakuan (biomaterial selulosa+kitosan+gliserol, membran kitosan, selulosa bakteri,
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui karakteristik biomaterial selulosa bakteri dari limbah cair ketela rambat (Ipomoea batatas Poir) dengan
penambahan kitosan sebagai material penutup luka dan mengetahui aktivitas antimikroba membran selulosa bakteri yang sudah ditambahkan kitosan. Aktivitas antimikroba ini terlihat dari zona hambat yang terbentuk.
Penelitian ini merupakan suatu rangkaian penelitian untuk melihat aktivitas biomaterial selulosa dari limbah cair ketela rambat yang sudah dimodifikasi dengan penambahan kitosan terhadap Staphylococcus aureus.
Rangkaian penelitian lain adalah mengetahui pengaruh pemberian kitosan pada membran selulosa bakteri sebagai material penutup luka pada tikus jantan galur Wistar dilihat secara makroskopis.
A. Hasil Determinasi Tanaman
Determinasi merupakan langkah penting dalam penelitian bila menggunakan tanaman sebagai sampel penelitian, agar diketahui kebenaran identitas tanaman yang digunakan. Determinasi tanaman juga menghindarkan peneliti agar tidak salah dalam pengambilan sampel. Determinasi dilakukan dengan bantuan seorang determinator.
membandingkan ciri-ciri tanaman ketela rambat termasuk umbi yang digunakan dengan ciri-ciri yang ada pada literatur. Untuk literaturnya sendiri memakai sumber dari www.plantamor.com serta buku pustaka yang dikarang oleh Huaman (1991). Bagian tanaman yang dibandingkan adalah bagian daun, petiole dan
umbinya.
B. Hasil Pemilihan Bahan
Berdasarkan determinasi yang dilakukan maka bahan yang dipilih sudah benar merupakan ketela rambat yang memiliki umbi berwarna putih. Umbi berwarna putih ini digunakan karena memiliki kandungan pati yang terbesar daripada umbi warna lainnya atau varietas lainnya. Menurut Kotecha dan Kadam (1998), kandungan pati dari umbi berwarna putih sebesar 28,79%. Pati ini diperlukan sebagai nutrisi untuk membuat membran selulosa bakteri.
C. Preparasi Limbah Ketela Rambat
D. Pembuatan Membran Kitosan
Membran kitosan dibuat dengan cara melarutkan 2 gram kitosan dalam 100 mL asam asetat 2%. Sebelumnya dilakukan orientasi dahulu untuk mendapatkan metode yang pas dalam melarutkannya. Hal yang perlu dicatat adalah dalam melarutkan kitosan tidak boleh menggunakan panas yang berlebihan, sebaiknya tidak dipanaskan. Hal ini akan berakibat larutan kitosan yang terbentuk akan mengalami Maillard reaction.
Maillard reaction merupakan reaksi kimia yang terjadi antara asam amino
dengan gula pereduksi akibat adanya pengaruh suhu. Umemura, Mihara dan Kawai (2010) melaporkan efek dari Maillard reaction antara glukosa dengan
dalam membran kitosan ditemukan pada membran yang dilarutkan dalam asam asetat 1% dan dikeringkan dengan cawan petri pada suhu 500 C. Proses Mailard reaction ini dapat terjadi jika asam amino dengan gula pereduksi yang terdapat
dalam senyawa berinteraksi secara kimia dengan bantuan suhu dan dalam kondisi yang kering. Warna yang terbentuk bila terjadi mailard reaction adalah coklat
kehitaman, hal ini akan memperngaruhi penampilan serta penerimaan pasien bila diaplikasikan. Warna kitosan yang baik adalah berwarna kuning jernih.
Untuk mempercepat pengeringan, maka larutan kitosan yang sudah diletakkan pada wadah, dibiarkan terbuka dan diangin-anginkan. Bila sudah kering, maka membran kitosan akan terlepas dari wadahnya dan bisa diambil untuk perlakuan selanjutnya.
Hasil membran kitosan yang terbentuk secara makroskopik dapat digambarkan seperti Tabel III.
Tabel III. Sifat fisik membran kitosan secara makroskopik
No Sifat Fisik Hasil Pengamatan
1 Warna Kekuningan
2 Tekstur Halus
3 Bentuk Lembaran
4 Transparansi Transparan
Berdasarkan pengamatan secara makroskopik, terlihat bahwa membran kitosan yang terbentuk sangat tipis dan transparan. Gambar 12 memperlihatkan bahwa membran yang terbentuk sesuai dengan ciri-ciri seperti Tabel III.
E. Pembuatan Membran Selulosa
Pada pembuatan membran selulosa, perlu adanya penambahan gula pasir dan urea sebagai nutrisi tambahan untuk kelangsungan hidup bakteri Acetobacter xylinum. Gula pasir sebagai sumber karbon, sedangkan urea sebagai sumber
nitrogen. Sumber karbon digunakan bakteri untuk proses metabolism bakteri, dan sumber nitrogen digunakan untuk proses metabolisme sel, karena merupakan penyusun protein (Chawla et al, 2009). Bakteri memerlukan sumber-sumber unsur
hara seperti N, H, O dan C untuk menyusun lapisan selulosa.
Berdasarkan Gambar 13 tersebut tampak bahwa glukosa dan fruktosa diperlukan sebagai prekursor pembentukan selulosa sekaligus sebagai sumber karbon bagi metabolism bakteri. Glukosa dan fruktosa merupakan hasil hidrolisis dari sukrosa seperti yang ditunjukkan Persamaan 6
C12H22O11 + 2H2O C6H12O6 + C6H12O6 ………..(6)
Peran dari penggunaan limbah ketela rambat adalah menyediakan sumber karbon yang didapat dari pati ketela rambat. Sumber karbon ini diperlukan bakteri
Acetobacter xylinum untuk proses metabolisme. Sumber karbon akan masuk ke
dalam sel dan digunakan bagi penyediaan energi yang dibutuhkan bakteri untuk berkembang biak ( Hidayat, 2006).
Hal yang perlu diperhatikan dalam pembuatan membran selulosa adalah kondisi lingkungan tumbuh dari bakteri Acetobacter xylinum. Dikarenakan bakteri
ini hanya bisa tumbuh pada pH asam, dengan range pH 4-5. Untuk mendapatkan pH 4-5 maka setelah ditambahkan bakteri perlu adanya pengecekan pH, bila belum mencapai pH 4-5, maka perlu ditambahkan asam asetat hingga mencapai pH yang diinginkan. Bila kondisi lingkungan baik untuk pertumbuhan bakteri, maka bakteri akan dapat memetabolisme glukosa menjadi selulosa, sehingga didapatkan membran selulosa, bila bakteri tidak tumbuh, maka tidak akan terbentuk membran, melainkan masih dalam bentuk cair.
Hal lainnya yang perlu diperhatikan adalah adanya oksigen. Bakteri
Acetobacter xylinum ini merupakan bakteri aerob, sehingga memerlukan oksigen
untuk melakukan proses metabolismenya. Oleh karena itu dalam membungkus Glukosa Fruktosa
nampan tidak boleh terlalu rapat, karena dikhawatirkan oksigen sukar masuk kedalam nampan.
Waktu fermentasi yang dilakukan adalah 7 hari, dikarenakan berdasarkan pengalaman, pada hari ketujuh, sudah terbentuk lapisan pelikel yang padat dan tebal. Bila kurang dari tujuh hari, dimungkinkan belum terbentuk sempurna lapisan pelikelnya.
Gambar 14. Membran Selulosa
Berdasarkan Gambar 14, terlihat bahwa membran selulosa bakteri yang dihasilkan (sebelum dikeringkan) memiliki ciri-ciri secara makroskopis yaitu kenyal, kokoh, dan tebal, serta berwarna kuning kecoklatan.
Kadang kala dijumpai tidak didapatkannya lapisan pelikel setelah fermentasi selama 7 hari. Fenomena ini terjadi bisa dikarenakan adanya cemaran mikroorganisme lain yang mengakibatkan adanya perebutan nutrisi antara bakteri
Acetobacter xylinum dengan mikroorganisme lainnya. Bakteri Acetobacter xylinum akan kekurangan nutrisi sehingga sebelum 7 hari akan mengalami fase
kematian. Bila bakteri Acetobacter xylinum tidak ada lagi, maka lapisan pelikel
F. Pembuatan Membran Selulosa+Gliserol+kitosan (SGK)
Pembuatan membran SGK ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh penambahan kitosan terhadap sifat dari membran yang terbentuk, meliputi karakteristik dan aktivitas antimikroba. Penambahan kitosan disini dengan menggunakan metode pelapisan, didasarkan pada penelitian Ariany dan Maharani (2011) yang menyebutkan bahwa kitosan yang dilapiskan pada kain katun dapat memberikan aktivitas antimikroba terhadap Staphylococcus aureus.
Setelah membran selulosa bakteri terbentuk dengan sempurna, maka selulosa bakteri tersebut dicuci dengan aquadest, air hangat, dan kemudian direndam natrium hidroksida 3% selama 48 jam serta asam klorida selama 15 menit, lalu dicuci kembali dengan aquadest hingga mencapai pH netral. Perlakuan ini sesuai dengan perlakuan yang dilakukan oleh Chawla et al. (2009), dimana disebutkan
bahwa setelah membran selulosa terbentuk, maka perlu dilakukan purifikasi dengan mencuci membran tersebut dengan aquadest, air panas, larutan natrium hidroksida 3% selama 48 jam, dan larutan asam klorida 3% selama 15 menit.
G. Analisis Karakteristik Membran 1. Analisis Sifat Fisik Secara Makroskopis
Analisis ini bertujuan untuk mengetahui sifat fisik dari masing-masing membran yang dihasilkan, baik itu membran kitosan, membran selulosa bakteri dan membran selulosa+gliserol+kitosan. Hasil dari analisis ini tersajikan dalam Tabel IV.
Tabel IV. Hasil pengamatan sifat fisik membran
No Sifat Fisik Selulosa Bakteri Kitosan Selulosa+kitosan+gliserol
1 Warna kecoklatan Kuning Kuning Kuning kecoklatan
2 Tekstur Kasar Halus Halus
3 Bentuk seperti kertas Lembaran Lembaran seperti kertas Lembaran seperti kertas 4 Transparansi Tidak Transparan Tidak
Pengamatan terhadap sifat fisik selulosa bakteri yang dilakukan ternyata memiliki kemiripan dengan pengamatan sifat fisik selulosa bakteri yang dilakukan oleh Pratomo dan Rohaeti (2011). Berdasarkan hasil pengamatan ini ternyata penambahan kitosan dan gliserol membuat tekstur dari membran yang terbentuk menjadi lebih halus dibandingkan dengan membran selulosa. Hal ini dikarenakan adanya penambahan kitosan akan mengisi rongga-rongga dari selulosa bakteri, sehingga permukaannya menjadi lebih halus. Adanya perubahan tekstur juga dimungkinkan adanya interaksi antara selulosa bakteri dengan kitosan (Chawla et al. 2009)
pada saat fermentasi oleh bakteri Acetobacter xylinum. Rongga-rongga ini akan
terlihat jika dilakukan analisis morfologi permukaan dengan SEM. 2. Analisis Gugus Fungsi dengan Instrumen FT-IR
Analisis ini bertujuan untuk mengetahui gugus fungsi dari membran yang terbentuk (selulosa bakteri, kitosan, dan selulosa+kitosan+gliserol), serta untuk mengetahui interaksi antara kitosan dengan selulosa bakteri. Berikut ini akan disajikan hasil spektra IR dari serbuk kitosan, selulosa bakteri, dan selulosa+gliserol+kitosan.
Gambar 15. Spektra IR serbuk kitosan
Berdasarkan perhitungan dengan metode baseline, kitosan yang digunakan
memiliki derajat deasetilasi (DD) sebesar 74,94 %. Hal ini sesuai dengan penelitian yang dilakukan Pillai, Paul dan Sharma (2009) yang menyatakan bahwa kitosan merupakan hasil deasetilasi kitin dengan derajat deasetilasi 60-90%. Selain itu berdasarkan Knurr (1982) menyebutkan bahwa syarat kitosan komersil adalah nilai derajat deasetilasi >70%. Hal ini membuktikan bahwa kitosan yang dijual dan digunakan memenuhi syarat secara komersil.
Berdasarkan spektra IR (Gambar 15) ditemukan adanya serapan pita pada daerah 3444,41 cm-1 yang menunjukkan stretching NH dan stretching OH, dan
pada daerah bilangan gelombang 1645,76 cm-1 yang menunjukkan serapan karbonil (C=O) khas amida dari N-Asetil glukosamin. Hal ini sesuai dengan penelitian Khan et al. (2002) yang menyatakan bahwa kitosan memiliki ciri pita
serapan pada bilangan gelombang 1655 cm-1 dan bilangan gelombang 3450 cm-1. Hal ini memiliki kemiripan dengan Anicuta et al, (2010) yang melaporkan
adanya karakteristik kitosan pada daerah 1559,17 cm-1 (stretching gugus amino)
dan daerah 3367,1 cm-1 yang menunjukkan vibrasi NH simetrik. Berdasarkan spektrum tersebut maka dapat disimpulkan bahwa serbuk yang digunakan merupakan kitosan.
Berdasarkan Gambar 16, terlihat pita serapan selulosa bakteri. Pita serapan pada bilangan gelombang 3419,44 cm-1 yang merupakan OH stretching, pada
gelombang 2940,40 cm-1 yang menunjukkan serapan CH alifatik/ -CH stretching,
pada bilangan gelombang 1654,91 cm-1 yang menunjukkan serapan C=O
