Analisis Hayati UJI TOKSISITAS. Oleh : Dr. Harmita

(1)

Analisis Hayati Analisis Hayati

Oleh : Dr. Harmita Oleh : Dr. Harmita

UJI TOKSISITAS

(2)

Pendahuluan Pendahuluan

Sebelum percobaan toksisitas dilakukan Sebelum percobaan toksisitas dilakukan

sebaiknya telah ada data mengenai sebaiknya telah ada data mengenai

identifikasi, sifat obat dan rencana identifikasi, sifat obat dan rencana

penggunaannya

(3)

Pengujian toksisitas biasanya dibagi Pengujian toksisitas biasanya dibagi

menjadi tiga kelompok yaitu : menjadi tiga kelompok yaitu :

•

Uji toksisitas akutUji toksisitas akut

Uji ini dilakukan dengan memberikan zat kimia yang sedang diuji Uji ini dilakukan dengan memberikan zat kimia yang sedang diuji

sebanyak satu kali, atau beberapa kali dalam jangka waktu 24 jam.

•

Uji toksisitas jangka pendek (sub kronik)Uji toksisitas jangka pendek (sub kronik)

Uji ini dilakukan dengan memberikan bahan tersebut berulang- Uji ini dilakukan dengan memberikan bahan tersebut berulang- ulang, biasanya setiap hari, atau lima kali seminggu, selama jangka ulang, biasanya setiap hari, atau lima kali seminggu, selama jangka waktu kurang lebih 10% dari masa hidup hewan; yaitu 3 bulan waktu kurang lebih 10% dari masa hidup hewan; yaitu 3 bulan untuk tikus dan 1 atau 2 tahun untuk anjing. Tetapi beberapa untuk tikus dan 1 atau 2 tahun untuk anjing. Tetapi beberapa peneliti menggunakan jangka waktu yang lebih pendek, misalnya peneliti menggunakan jangka waktu yang lebih pendek, misalnya

pemberian zat kimia selama 14 dan 28 hari.

•

Uji toksisitas jangka panjang (kronik)Uji toksisitas jangka panjang (kronik)

Percobaan jenis ini mencakup pemberian obat secara berulang Percobaan jenis ini mencakup pemberian obat secara berulang selama 3 – 6 bulan atau seumur hewan, misalnya 18 bulan untuk selama 3 – 6 bulan atau seumur hewan, misalnya 18 bulan untuk mencit, 24 bulan untuk tikus, dan 7 – 10 tahun untuk anjing dan mencit, 24 bulan untuk tikus, dan 7 – 10 tahun untuk anjing dan monyet. Memperpanjang percobaan kronik untuk lebih dari 6 bulan monyet. Memperpanjang percobaan kronik untuk lebih dari 6 bulan

tidak akan bermanfaat, kecuali untuk percobaan karsinogenik.

(4)

Uji Toksisitas Akut Uji Toksisitas Akut

• Sebagian besar penelitian semacam ini dirancang untuk Sebagian besar penelitian semacam ini dirancang untuk menentukan LD50 obat. LD50 obat didefinisikan sebagai menentukan LD50 obat. LD50 obat didefinisikan sebagai dosis tunggal suatu zat yang secara statistik diharapkan dosis tunggal suatu zat yang secara statistik diharapkan akan membunuh 50% hewan coba. Percobaan ini juga akan membunuh 50% hewan coba. Percobaan ini juga dapat menunjukkan organ sasaran yang mungkin dapat menunjukkan organ sasaran yang mungkin dirusak dan efek toksis spesifiknya, serta memberikan dirusak dan efek toksis spesifiknya, serta memberikan petunjuk tentang dosis yang sebaiknya digunakan dalam petunjuk tentang dosis yang sebaiknya digunakan dalam

pengujian yang lebih lama.

• Bila pemberian suatu zat terjadi melalui inhalasi maka Bila pemberian suatu zat terjadi melalui inhalasi maka yang harus ditentukan adalah kadar letal median (LC50) yang harus ditentukan adalah kadar letal median (LC50) untuk masa pemberian tertentu atau waktu letal median untuk masa pemberian tertentu atau waktu letal median

(LT50) untuk kadar tertentu di udara

(5)

Uji Toksisitas Jangka Pendek.

• Tubuh manusia sering terkena bahan Tubuh manusia sering terkena bahan kimia pada level yang jauh lebih kecil dari kimia pada level yang jauh lebih kecil dari

dosis yang mematikan dengan segera, dosis yang mematikan dengan segera,

hanya mereka terkena lebih lama. Untuk hanya mereka terkena lebih lama. Untuk

menyelidiki kenyataan akibat keracunan menyelidiki kenyataan akibat keracunan

dalam situasi yang lebih realistis , dalam situasi yang lebih realistis ,

dikerjakan studi toksisitas jangka pendek dikerjakan studi toksisitas jangka pendek

dan jangka panjang.

(6)

Uji Toksisitas Subkronis.

•

HHewan Ujiewan Uji

Sekurang-kurangnya digunakan dua jenis hewan, hewan pengerat Sekurang-kurangnya digunakan dua jenis hewan, hewan pengerat

dan bukan hewan pengerat. Biasanya dapat digunakan tikus dan dan bukan hewan pengerat. Biasanya dapat digunakan tikus dan

anjing, dari dua jenis kelamin, sehat, dewasa, umur 5 sampai 6 anjing, dari dua jenis kelamin, sehat, dewasa, umur 5 sampai 6

minggu untuk tikus, dan 4-6 bulan untuk anjing.

•

Jumlah Hewan UjiJumlah Hewan Uji

Masing-masing kelompok terdiri dari 10 ekor hewan pengerat atau Masing-masing kelompok terdiri dari 10 ekor hewan pengerat atau empat ekor anjing untuk setiap jenis kelamin. Bila pada percobaan empat ekor anjing untuk setiap jenis kelamin. Bila pada percobaan akan dilakukan pengorbanan/pembedahan, maka jumlah hewan uji akan dilakukan pengorbanan/pembedahan, maka jumlah hewan uji

harus sudah dipertimbangkan sebelumnya.

(7)

Con’d Con’d

• ^{Dosis Uji}^{Dosis Uji}

Sekurang-kurangnya digunakan tiga kelompok dosis dan satu kelompok kontrol untuk Sekurang-kurangnya digunakan tiga kelompok dosis dan satu kelompok kontrol untuk setiap jenis kelamin. Dosis dan jumlah kelompok dosis harus cukup, hingga dapat setiap jenis kelamin. Dosis dan jumlah kelompok dosis harus cukup, hingga dapat diperoleh dosis toksik dan dosis tidak berefek. Dosis toksik harus menyebabkan gejala diperoleh dosis toksik dan dosis tidak berefek. Dosis toksik harus menyebabkan gejala toksik yang nyata pada beberapa hewan uji dan terjadinya kematian tidak boleh lebih toksik yang nyata pada beberapa hewan uji dan terjadinya kematian tidak boleh lebih dari 10%, sedang dosis tidak berefek tidak boleh menyebabkan gejala toksik. Sebagai dari 10%, sedang dosis tidak berefek tidak boleh menyebabkan gejala toksik. Sebagai dosis toksik biasanya digunakan 10-20% dari harga LD50, dengan dosis toksik biasanya digunakan 10-20% dari harga LD50, dengan mempertimbangkan hasil yang diperoleh pada uji pendahuluan, tingkat dosis lain mempertimbangkan hasil yang diperoleh pada uji pendahuluan, tingkat dosis lain ditetapkan dengan faktor perkalian tetap 2 sampai 10.

ditetapkan dengan faktor perkalian tetap 2 sampai 10.

• Batas UjiBatas Uji

Bila pada dosis 1000 mg/kg bobot tubuh tidak dihasilkan efek toksik, dosis tidak perlu Bila pada dosis 1000 mg/kg bobot tubuh tidak dihasilkan efek toksik, dosis tidak perlu dinaikkan lagi, meskipun dosis yang diharapkan untuk manusia belum dicapai.

dinaikkan lagi, meskipun dosis yang diharapkan untuk manusia belum dicapai.

• Cara Pemberian Zat UjiCara Pemberian Zat Uji

Pada dasarnya zat uji harus diberikan sesuai dengan cara pemberian atau pemaparan Pada dasarnya zat uji harus diberikan sesuai dengan cara pemberian atau pemaparan yang diharapkan pada manusia. Bila diberikan secara oral, dapat diberikan dengan yang diharapkan pada manusia. Bila diberikan secara oral, dapat diberikan dengan cara pencekokan menggunakan sonde atau secara ad libitum di dalam makanan atau cara pencekokan menggunakan sonde atau secara ad libitum di dalam makanan atau minuman hewan. Bila zat uji akan dicampur dengan makanan atau minuman hewan, minuman hewan. Bila zat uji akan dicampur dengan makanan atau minuman hewan, jumlah zat uji yang ditambahkan harus diperhitungkan berdasarkan jumlah makanan jumlah zat uji yang ditambahkan harus diperhitungkan berdasarkan jumlah makanan atau minuman yang dikonsumsi setiap hari.

atau minuman yang dikonsumsi setiap hari.

• Lama Pemberian Zat UjiLama Pemberian Zat Uji

Lama pemberian zat uji selama 28 sampai 90 hari atau 10% dari seluruh umur Lama pemberian zat uji selama 28 sampai 90 hari atau 10% dari seluruh umur hewan, diberikan tujuh hari dalam satu minggu.

hewan, diberikan tujuh hari dalam satu minggu.

(8)

Uji Toksisitas Jangka Panjang Uji Toksisitas Jangka Panjang

• Umumnya satu atau lebih jenis binatang yang Umumnya satu atau lebih jenis binatang yang

digunakan. Kecuali tidak ditunjukkan, tikuslah yang digunakan. Kecuali tidak ditunjukkan, tikuslah yang

digunakan, anjing dan primata merupakan pilihan digunakan, anjing dan primata merupakan pilihan

berikutnya.

• Karena ukurannya yang kecil, tikus tidak cocok Karena ukurannya yang kecil, tikus tidak cocok digunakan dalam studi toksisitas jangka panjang, digunakan dalam studi toksisitas jangka panjang,

meskipun mereka sering digunakan dalam studi meskipun mereka sering digunakan dalam studi

karsinogenesitas. Jantan dan betina dalam jumlah yang karsinogenesitas. Jantan dan betina dalam jumlah yang

sama digunakan. Umumnya 40-100 tikus ditempatkan sama digunakan. Umumnya 40-100 tikus ditempatkan dalam kelompok masing-masing dosis dan juga dalam dalam kelompok masing-masing dosis dan juga dalam

kelompok kontrol. Penggunaan anjing dan primata non kelompok kontrol. Penggunaan anjing dan primata non

manusia jauh lebih sedikit.

(9)

Contoh Perhitungan LD50 Cara Weil.

Nilai LD50 ekstrak etanol 40% kulit buah mahoni Nilai LD50 ekstrak etanol 40% kulit buah mahoni Di ketahui :

Di ketahui : r r = 0, 3, 4, 5 = 0, 3, 4, 5 ff = 0,10000= 0,10000 DD = 2, 364= 2, 364

d d = 0,0752575= 0,0752575 Maka :

Maka :

Log m = log 94, 55 + 0,0752572 (0,10000 – 1) Log m = log 94, 55 + 0,0752572 (0,10000 – 1)

= 2,055661533= 2,055661533

m = antilog 2,055661533m = antilog 2,055661533

= 113,6741022 mg = 0,11g= 113,6741022 mg = 0,11g

LD50 ekstrak etanol 40% kulit buah mahoni adalah 0,11g/20 g bb.

(10)

Brine Shrimp Lethality Test (BST) Brine Shrimp Lethality Test (BST)

• Selain menggunakan hewan pengerat untuk uji Selain menggunakan hewan pengerat untuk uji toksisitas, dapat juga digunakan larva udang (A

toksisitas, dapat juga digunakan larva udang (A rtemia rtemia salina

salina leach) untuk mengetahui sifat toksik bahan alam. leach) untuk mengetahui sifat toksik bahan alam.

Metode yang menggunakan larva udang untuk uji Metode yang menggunakan larva udang untuk uji

toksisitas disebut

toksisitas disebut Brine Shrimp Lethality Test (BST). Brine Shrimp Lethality Test (BST).

• Brine Shrimp Lethality Test (BST) Brine Shrimp Lethality Test (BST) merupakan salah satu merupakan salah satu metode uji toksisitas yang banyak digunakan dalam metode uji toksisitas yang banyak digunakan dalam penelusuran senyawa bioaktif yang bersifat toksik dari penelusuran senyawa bioaktif yang bersifat toksik dari bahan alam. Metode ini dapat digunakan sebagai bahan alam. Metode ini dapat digunakan sebagai

bioassay-guided fractionation

bioassay-guided fractionation dari bahan alam, karena dari bahan alam, karena mudah, cepat, murah dan cukup

mudah, cepat, murah dan cukup reproducible reproducible . Beberapa . Beberapa senyawa bioaktif yang telah berhasil diisolasi dan senyawa bioaktif yang telah berhasil diisolasi dan dimonitor aktivitasnya dengan BST menunjukkan adanya dimonitor aktivitasnya dengan BST menunjukkan adanya

korelasi terhadap suatu uji spesifik antikanker

(11)

Eksperimen Eksperimen

Penetasan Telur Udang Artemia salina Leach.

• Penetasan telur dilakukan pada wadah bening seperti gelas kimia atau Penetasan telur dilakukan pada wadah bening seperti gelas kimia atau stoples yang diberi bahan plastik, negatif film, atau kaca dengan

stoples yang diberi bahan plastik, negatif film, atau kaca dengan menggunakan media air laut

menggunakan media air laut (brine=saline(brine=saline). Wadah penetasan dibagi ). Wadah penetasan dibagi menjadi dua bagian terang dan gelap oleh suatu sekat berlubang. Bagian menjadi dua bagian terang dan gelap oleh suatu sekat berlubang. Bagian

gelap digunakan untuk meletakkan telur yang akan ditetaskan. Sekat gelap digunakan untuk meletakkan telur yang akan ditetaskan. Sekat

berlubang menjadi jalan bagi larva yang telah lahir untuk bergerak secara berlubang menjadi jalan bagi larva yang telah lahir untuk bergerak secara

alamiah ke arah terang.

alamiah ke arah terang. Selama penetasan diberi penerangan dengan Selama penetasan diberi penerangan dengan cahaya lampu pijar/neon 40-60 watt agar suhu penetasan 25-300C tetap cahaya lampu pijar/neon 40-60 watt agar suhu penetasan 25-300C tetap

terjaga.

• Sebagai media penetasan telur digunakan air laut buatan dengan kadar Sebagai media penetasan telur digunakan air laut buatan dengan kadar garam (NaCl) 15 g/L. Kadar oksigen yang dibutuhkan selama penetasan garam (NaCl) 15 g/L. Kadar oksigen yang dibutuhkan selama penetasan harus lebih dari 3 mg/l, sehingga media air laut harus diberi udara, baik harus lebih dari 3 mg/l, sehingga media air laut harus diberi udara, baik

dengan acrator, kompressor, maupun blower. Dalam waktu 24-36 jam dengan acrator, kompressor, maupun blower. Dalam waktu 24-36 jam

biasanya telur-telur sudah menetas menjadi larva yang disebut

biasanya telur-telur sudah menetas menjadi larva yang disebut naupliinauplii. . Nauplii

Nauplii aktif yang telah berumur 48 jam digunakan sebagai hewan uji aktif yang telah berumur 48 jam digunakan sebagai hewan uji dalam penelitian.

dalam penelitian.

(12)

Pengujian Toksisitas Ekstrak Pengujian Toksisitas Ekstrak

dengan BST dengan BST

•

Larutan stok (induk) sampel dibuat dengan konsentrasi 50 mg Larutan stok (induk) sampel dibuat dengan konsentrasi 50 mg dalam 5 ml metanol atau dengan pelarut lain yang sesuai, lalu dalam 5 ml metanol atau dengan pelarut lain yang sesuai, lalu dibuat serangkaian konsentrasi sebesar 1, 10, 100, 500, 1000 dan dibuat serangkaian konsentrasi sebesar 1, 10, 100, 500, 1000 dan

1500

1500 µg/ml ke dalam vial-vial. Larutan uji dalam vial tersebut µg/ml ke dalam vial-vial. Larutan uji dalam vial tersebut diuapkan sampai kering dan tidak mengandung pelarut organik.

diuapkan sampai kering dan tidak mengandung pelarut organik.

Untuk kontrol negatif (blanko) diberi perlakuan sama seperti larutan Untuk kontrol negatif (blanko) diberi perlakuan sama seperti larutan uji tetapi tanpa ekstrak (hanya diberi metanol dalam jumlah yang uji tetapi tanpa ekstrak (hanya diberi metanol dalam jumlah yang

sama dengan sampel). Setiap dosis dibuat lima replikasi.

•

Ekstrak kering dalam vial dilarutkan dalam air laut secukupnya. Ekstrak kering dalam vial dilarutkan dalam air laut secukupnya.

Sepuluh ekor larva Artemia dipindahkan ke dalam masing-masing Sepuluh ekor larva Artemia dipindahkan ke dalam masing-masing vial yang telah berisi senyawa uji dan ditambahkan air laut sampai vial yang telah berisi senyawa uji dan ditambahkan air laut sampai volume 5 ml. Ke dalam setiap vial dimasukkan satu tetes suspensi volume 5 ml. Ke dalam setiap vial dimasukkan satu tetes suspensi ragi (0,6 mg/ml) sebagai makanannya. Pengamatan dilakukan ragi (0,6 mg/ml) sebagai makanannya. Pengamatan dilakukan selama 24 jam dan tingkat toksisitas ditentukan dalam menghitung selama 24 jam dan tingkat toksisitas ditentukan dalam menghitung

jumlah larva yang mati. Hasil dibandingkan dengan kontrol negatif.

% kematian = jumlah kematian – jumlah kematian kontrol x 100 % jumlah larva awal (10)

(13)

Con’d Con’d

Kons.(µg/ml) Jml larva yang mati % kematian Konversi probit

Tingkat toksisitas dihitung sebagai :

Y = a + bx

Dengan y = nilai probit

X = konsentrasi ekstrak

Cari nilai x = ….  dimana y = 5,00 (kematian 50%)

LC50 ditentukan dengan analisis probit pada taraf kepercayaan 95%.

(14)