ISOLASI DAN IDENTIFIKASI PATOGEN
Nama : Rr. Nibras Khairunnisa Sari
NIM : B1J013137
Rombongan : IV Kelompok : 2
Asisten : Devi Fatkuljanah
LAPORAN PRAKTIKUM FITOPATOLOGI
KEMENTERIAN RISET TEKNOLOGI DAN PENDIDIKAN TINGGI UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
FAKULTAS BIOLOGI PURWOKERTO
I. PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Isolasi adalah proses pemisahan mikroorganisme yang diinginkan dari populasi campuran ke media biakan (buatan) untuk mendapatkan kultur murni (Perhutani, 1999). Isolasi mikroorganisme mengandung arti proses pengambilan mikroorganisme dari lingkungannya untuk kemudian ditumbuhkan dalam suatu medium di laboratorium. Proses isolasi ini menjadi penting dalam mempelajari identifikasi mikrobia, uji morfologi, fisiologi, dan serologi (Achmad & Maisaroh, 2012).
Pengisolasian merupakan suatu cara untuk memisahkan atau memindahkan mikroba tertentu dari lingkungannya, sehingga diperoleh kultur murni. Manfaat dilakukannya kultur murni adalah untuk menelaah atau mengidentifikasi mikroba, termasuk penelaahan ciri-ciri kultural, morfologis, fisiologis, maupun serologis, yang memerlukan suatu populasi yang terdiri dari satu macam mikroorganisme saja (Sadiqul, 2010).
Perkembangan suatu penyakit pada tumbuhan inang didukung oleh tiga faktor, yaitu inang yang rentan, patogen yang virulen dan lingkungan yang mendukung. Patogen terbukti memiliki daya virulensi yaitu keberhasilan untuk menyebabkan suatu penyakit sebagai ekspresi dari patogenisitas. Gejala layu dan rontok pada daun seiring dengan perkembangan bercak dapat diduga sebagai akibat dari substansi-substansi yang disekresikan oleh patogen dalam mekanisme penyerangannya untuk melumpuhkan inang. Kelompok-kelompok utama substansi yang disekresikan patogen ke dalam tubuh tumbuhan yang menyebabkan timbulnya penyakit, baik langsung atau tidak langsung adalah enzim, toksin, zat pengatur tumbuh, dan polisakarida (Semangun, 1996).
B. Tujuan
II. TELAAH PUSTAKA
Perkembangan penyakit juga bergantung pada faktor lingkungan, setelah faktor inang dan patogen. Fungi patogen dalam perkembangannya dipengaruhi oleh beberapa faktor abiotik yaitu suhu, kelembaban, oksigen, derajat kemasaman (pH) dan cahaya. Kisaran suhu terendah yang diduga turut mendukung fungi patogen untuk berkembang biak, seperti yang dinyatakan oleh Ullstup (1939) dalam Ogoshi et al., (1985).
Sebelum melakukan pengamatan terhadap patogen baik berupa bakteri maupun jamur di laboratorium, telebih dahulu kita harus menumbuhkan atau membiakan bakteri atau jamur tersebut. Mikroorganisme dapat berkembang biak dengan alami atau dengan bantuan manusia. Dengan berbagai teknik isolasi kita akan coba mengetahui teknik mana yang paling tepat dan paling baik untuk pertumbuhan bakteri atau mikroorganisme. Mikroorganisme yang dikembangkan oleh manusia diantaranya melalui substrat yang disebut media. Mikroorganisme dapat ditumbuhkan dan dikembangkan pada suatu substrat yang disebut medium. Medium yang digunakan untuk menumbuhkan dan mengembangbiakan mikroorganisme tersebut harus sesuai susunannya dengan kebutuhan jenis-jenis mikroorganisme yang bersangkutan. Setalah bakteri dan jamur yang akan diamati tumbuh barulah kita dapat mengamatinya, untuk mengamatinya dapat menggunakan mikroskop untuk mengetahui struktur patogen tersebut. Dua mikroorganisme terdiri dari lima kelompok organisme; bakteri, protozoa, virus, sera algae dan cendawan mikroskopis. Kita mempelajari banyak segi mengenai jasad-jasad renik ini (juga dinanamakan mikrobe atau protista): di mana adanya, ciri-cirinya, kekerabatan antara sesamanya seperti juga dengan kelompok organisme lainnya, pengandaliannya, dan peranannya dalam kesehatan serta kesejahtaraan kita. Mikroorganisme sangat erat kaitannya dengan kehidupan kita (Ferdias, 1992).
III. MATERI DAN METODE
A. Materi
Alat yang digunakan pada praktikum kali ini adalah Laminar Air Flow (LAF), cawan petri, pipet tetes, kertas saring, cover glass, sprayer, label, wrapper, pinset, label, jarum ose, bunsen, skalpel, tisu, object glass, mikroskop, kamera dan alat tulis.
Bahan yang digunakan pada praktikum kali ini adalah sampel tanaman berpenyakit, media PDA, alkohol 70 %, dan akuades.
B. Metode
1. Isolasi
2. Peremajaan
Dikeringkan dengan tisu Disemprot dengan
Alkohol 70 % dan akuades Sampel dipotong 1
x1 cm (bagian yang sakit dan sehat)
Inkubasi selama 7 x 24 jam
Dipindahkan ke dalam media PDA
Hasil isolat isolasi Dipindahkan ke
dalam media PDA baru
Hasil isolat isolasi diambil 1 plug
3. Identifikasi
Diamati di mikroskop
Ditutup cover glass Diletakkan di
object glass
Ditetesi akuades Hasil isolat
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Hasil
Gambar (a) Preparat potongan Bayam (Amaranthus spinosus) berpenyakit sebelum inkubasi
Gambar (b) Preparat mikroskopis potongan Bayam (Amaranthus spinosus) berpenyakit dan patogen setelah inkubasi
Gambar (c) Preparat potongan Bayam (Amaranthus spinosus) berpenyakit dan patogen setelah inkubasi
Tabel Hasil Pengamatan Isolasi dan Identifikasi Patogen Rombongan IV
a b
Kelompok 1 2 3 4 5 6 Makroskopis
Tepi Koloni Rata Rata Bergerigi Bergerigi Bergerigi Rata
Tekstur koloni
Halus Halus Kasar Kasar Halus Halus
Pola penyebara n
Tersebar Tersebar Tersebar Berkoloni Konsentris Tersebar
Warna koloni
Hitam Putih Kehijauan
Hijau kehitaman
Putih Hijau lumut Putih Mikroskopis
Hifa
-Ada/tidak Tidak Ada Tidak Ada Ada Ada
-Warna - Hyalin
(bening) - Putih Coklatkehijauan Coklat Konidia
-Ada/Tidak Ada Ada Ada Ada Ada Ada
-Warna Bening Hijau Hitam Hitam Hyalin Hitam
-Bentuk Bulat Bulat Bulat Bulat Oval Bulat
Nama
B. Pembahasan
Isolasi mikroorganisme mengandung arti proses pengambilan mikroorganisme dari lingkungannya untuk kemudian ditumbuhkan dalam suatu medium di laboratorium. Proses isolasi ini menjadi penting dalam mempelajari identifikasi mikrobia, uji morfologi, fisiologi, dan serologi. Sedangkan pengujian sifat-sifat tersebut di alam terbuka sangat mustahill untuk dilakukan (Pelczar, 1986). Prinsip kerja isolasi bakteri cukup sederhana yakni dengan menginokulasikan sejumlah kecil bakteri pada suatu medium tertentu yang dapat menyusung kehidupan bakteria. Sejumlah kecil bakteri ini didapat dari bermacam-macam tempat tergantung dari tujuan inokulasi. Dalam kajian mikrobiologi yang berhubungan dengan sumber bakteri adalah mikrobia tanah, air, makanan dan udara (Talaro,1999).
Apabila ingin mendapatkan kultur murni suatu mikrobia yang digunakan adalah metode streak plate, karena hasil akhir metode ini adalah berupa kumpulan sel-sel yang semakin jarang pada ujung streak sehingga dapat diambil bakteri pada jumlah seluler (satu sel). Selain itu bakteri yang didapat seharusnya merupakan bakteri yang memang ingin dibiakkan di kultur tersebut dengan kata lain bukan bakteri kontaminan, sebab yang diambil/dicuplik adalah koloni bakteri yang berada di atas streak yang dibuat dan bukan di luar streak. Kelebihan metode ini adalah dapat segera diketahui adanya kontaminasi, sedangkan kekurangannya metode ini sulit dilakukan dan hanya dapat digunakan untuk menumbuhkan bakteri aerob saja. (Burrrow, 1959).
Ada bermacam-macam metode isolasi yang dapat digunakan. Macam-macam metode isolasi tersebut antara lain:
1. Isolasi tunggal merupakan metode isolasi dengan cara meneteskan bahan yang mengandung mikroorganisme pada suatu kaca penutup dengan menggunakan mikropipet, yang kemudian diteliti dibawah obyektif mikroskop.
2. Isolasi gores merupakan metode isolasi dengan cara menggeser atau menggoreskan ujung jarum ose yang telah mengandung mikroorganisme dengan hati-hati di atas permukaan agar secara zig zag yang dimulai dari dasar tabung menuju ke bagian atas tabung.
4. Isolasi tuang merupakan metode isolasi dengan cara mengambil sedikit lingkungannya untuk kemudian ditumbuhkan dalam suatu medium di laboratorium. Proses isolasi ini menjadi penting dalam mempelajari identifikasi mikrobia, uji morfologi, fisiologi, dan serologi. Sedangkan pengujian sifat-sifat tersebut di alam terbuka sangat mustahil untuk dilakukan. Pengisolasian merupakan suatu cara untuk memisahkan atau memindahkan mikroba tertentu dari lingkungannya, sehingga diperoleh kultur murni. Kultur murni ialah kultur yang sel-sel mikrobanya berasal dari pembelahan dari satu sel tunggal. Manfaat dilakukannya kultur murni adalah untuk menelaah atau mengidentifikasi mikroba, termasuk penelaahan ciri-ciri kultural, morfologis, fisiologis, maupun serologis, yang memerlukan suatu populasi yang terdiri dari satu macam mikroorganisme saja (Soni, 2010).
Isolasi jamur patogen dilakukan di dalam laminar air flow cabinet dengan cara mengambil hifa jamur yang telah tumbuh dari hasil teknik ruang lembab dengan menggunakan jarum ose yang telah steril. Setelah itu hifa diletakkan pada bagian tengah medium PDA steril di dalam cawan petri dan diinkubasi pada suhu kamar selama 7 hari. Setelah diperoleh biakan murni, isolat direisolasi pada medium PDA, kemudian jamur tersebut diidentifikasii. Tujuan dari Pemotongan pada bagian yang sakit dan sehat agar saat ditumbuhkan pada media PDA hifa pada bagian tumbuhan yang sakit akan tumbuh ke bagian tumbuhan yang sehat (Elfina, 2013).
Kerusakan yang dapat terjadi meliputi penurunan viabilitas dan stabilitas sel bahkan suatu mikroba akan kehilangan potensinya sebagai suatu mikroba (Black, 1999).
Pemurnian biakan murni bertujuan untuk mendapatkan satu spesies dalam satu tabung pemeliharaan kultur. Langkah-langkah pemurnian biakan murni adalah sebagai berikut, koloni dengan karakter morfologi tertentu (koloni tunggal) dapat dipisahkan satu dengan lainnya dengan cara mengambilnya dengan ose (diusahakan koloni yang berjauhan), kemudian digoreskan pada medium agar pemurnian. Pengambilan dengan ose dapat memisahkan koloni tunggal dengan yang lainnya. Untuk memurnikan kapang, ambil koloni dengan karakter morfologi tertentu dengan cara mengambilnya dengan jarum enten kemudian menaruhnya pada satu titik media PDA pada cawan petri. Jarum ose dan jarum enten yang digunakan untuk memindahkan sedikit biakan bakteri dan kapang ke gelas obyek harus disterilisasi dengan cara dipanaskan diatas lampu bunsen agar terbebas dari mikroba (steril), begitu pula dengan bibir cawan petri tempat koloni fungi (Soni, 2010).
Salah satu tahapan yang penting dalam mendiagnosa gejala serangan penyakit tanaman adalah identifikasi terhadap patogen tanaman. Patogen yang diidentifikasi berasal dari pengambilan sampel tanaman yang terserang penyakit. Sampel tanaman yang terserang penyakit kemudian diisolasi dan ditumbuhkan pada media aseptik buatan. Identifikasi menjadi sangat penting karena pada tahapan tersebut ditekankan beberapa hal pokok seperti untuk pengendalian khususnya untuk uji antagonis ataupun hanya sekedar untuk mengetahui jenis patogen yang menyerang tanaman. Dari hasil identifikasi, dapat diperoleh suatu kesimpulan mengenai jenis patogen yang menyerang tanaman kemudian lebih lanjut upaya tersebut juga dapat diarahkan untuk mempelajari upaya – upaya pengendalian yang tepat untuk mencegah serangan patogen tersebut. Salah satunya melalui uji antagonismu dari jamur antagonis. Hal ini menyebabkan proses identifikasi patogen tanaman menjadi sangat penting untuk memastikan jenis patogen yang menyerang tanaman secara akurat. Untuk itu, perlu dilakukan praktik secara langsung untuk mengidentifikasi patogen tanaman. (Chang, 1996).
dan spesies tumbuhan yang berbeda dengan warna koloni yan berbeda pula (hitam, hijau kehitaman, putih). Trichoderma spp. diklasifikasikan dalam Kingdom Plantae, Divisio Amastigomycota, Class Deutromycetes, Ordo Moniliales, Famili Moniliaceae, Genus Trichoderma, Spesies Trichoderma spp. Cendawan marga Trichoderma terdapat lima jenis yang mempuyai kemampuan untuk mengendalikan beberapa patogen yaitu Trichorderma harzianum, Trichorderma koningii, Trichorderma viride, Trichoderma hamatum dan Trichoderma polysporum (Ingold, 1975).
Jenis yang banyak dikembangkan di Indonesia antara lain Trichorderma harzianum, Trichorderma koningii, Trichoderma viride.Trichoderma spp. memiliki konidiofor bercabang-cabang teratur, tidak membentuk berkas, konidium jorong, bersel satu, dalam kelompok-kelompok kecil terminal, kelompok konidium berwarna hijau biru (Semangun, 1996). Trichoderma spp. juga berbentuk oval, dan memiliki sterigma atau phialid tunggal dan berkelompok (Ingold, 1975).
Koloni Trichoderma spp. pada media agar pada awalnya terlihat berwarna putih selanjutnya miselium akan berubah menjadi kehijau-hijauan lalu terlihat sebagian besar berwarna hijau ada ditengah koloni dikelilingi miselium yang masih berwarna putih dan pada akhirnya seluruh medium akan berwarna hijau. Koloni pada medium OA (20oC) mencapai diameter lebih dari 5 cm dalam waktu 9 hari, semula
berwarna hialin, kemudian menjadi putih kehijauan dan selanjutnya hijau redup terutama pada bagian yang menunjukkan banyak terdapat konidia. Konidifor dapat bercabang menyerupai piramida, yaitu pada bagian bawah cabang lateral yang berulang-ulang, sedangkan kearah ujung percabangan menjadi bertambah pendek. Fialid tampak langsing dan panjang terutama apeks dari cabang, dan berukuran (2,8-3,2) μm x (2,5-2,8) μm, dan berdinding halus. Klamidospora umumnya ditemukan dalam miselia dari koloni yang sudah tua, terletak interkalar kadang terminal, umumnya bulat, berwarna hialin, dan berdinding halus (Ingold, 1975).
lain. Trichoderma spp. merupakan salah satu jamur antagonis yang telah banyak diuji coba untul mengendalikan penyakit tanaman (Tjahjadi, 1989).
Aspergillus dikenal karena stadium konidiumnya. Miselium berinti empat bercabang-cabang kerap kali diduduki oleh sejumlah besar penampang konidium yang terbentuk sendiri-sendiri diatas hifa dimana didalamnya terbentuk satu sel hifa, sel kaki bercabang dan membentuk hifa tegak lurus. Hifa Aspergillus ini berujung dengan sebuah gelembung, keluar dari gelembung ini tumbuhlah sterigma. Pada sterigma muncul konidium-konidium yang tersusun berurutan mirip bentuk untaian mutiara (Lopez, 2002). Kapang Aspergillus, Rhizopus, dan Penicillium merupakan kapang kosmopolit yang dapat menghasilkan enzim amilase. Aspergillus dan Rhizopus merombak amilum menjadi glukosa menggunakan enzim α-amilase. Kerja enzim α-amilase yakni memotong ikatan 1,4 α-glikosida. Enzim α-amilase terjadi dalam dua tahap. Tahap pertama adalah degradasi amilum secara cepat yang menghasilkan matotriosa dan maltosa. Tahap kedua bekerja lambat yakni mengubah oligosakarida menjadi glukosa dan maltosa melalui jalur glikolisis (Arizal et al., 2014)
Berikut ini merupakan klasifikasi dari Aspergillus sp., yaitu: Kingdom : Fungi
bahan organik, seperti roti, olahan daging, butiran padi, kacang-kacangan, makanan dari beras atau ketan, dan kayu (Lopez, 2002).
Dua fungi entomopatogen dengan nama Varicosporium alodae dan Articulospora inflata dinilai dalam in vitro pada tahap perkembangan larva yang berbeda pada nyamuk Anopheles: pada tahap instar yang kedua dan keempat untuk adanya aktivitas toksik mereka. Perlakuan yang dikonduksikan dalam lingkungan yang terkontrol sekitar lima hari. Mortalitas yang tinggi tercatat dalam kelompok yang diperlakukan dengan V. Elodeae dalam waktu 72 jam dan tahapan instar kedua pada Articulospora inflata (Omoya et al., 2011).
Berikut ini merupakan klasifikasi dari Acremonium sp., yaitu: Kingdom: Fungi
Division: Ascomycota Order : Hypocreales Family : Hypocreaceae Genus : Acremonium
Spesies : Acremonium sp. (Saimee, 2003).
Genus Acremonium mengandung sekitar 100 spesies, yang sebagian besar adalah saprophytic, yang diisolasi dari bahan tanaman mati dan tanah. Banyak spesies diakui sebagai patogen oportunistik manusia dan hewan, menyebabkan eumycetoma, onikomikosis, dan hyalohyphomycosis. Infeksi manusia oleh jamur dari genus ini jarang terjadi, tetapi manifestasi klinis hyalohyphomycosis disebabkan oleh Acremonium mungkin termasuk radang sendi, osteomyelitis, peritonitis, endokarditis, pneumonia, serebritis, dan infeksi subkutan (Saimee, 2003).
Ciri morfologi fungi Acremonium sp adalah hifanya berbentuk filamen, segmen pada hifanya berbentuk cembung (swollen), memiliki arthrospora, Konidia dan germlings. Kondisi lingkungan kaya C, N, Mg, dan PO43- , sangat sesuai dalam
KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
Berdasarkan hasil dan pembahasan yang telah diperoleh maka dapat disimpulkan bahwa berbagai penyebab penyakit yaitu Aspergillus sp., Trichoderma sp., Articulospora inflata, dan Acremonium sp. dengan cara mengisolasi dan mengidentifikasi patogen yang menyebabkan penyakit pada tumbuhan dapat diketahui setelah dilakukannya 3 tahap, yaitu isolasi, peremajaan, dan identifikasi.
B. Saran
Saran untuk praktikum kali ini adalah sebaiknya dalam melakukan pemindahan sampel bagian yang sakit ke dalam media PDA agar lebih berhati-hati kembali agar terhindar dari terjadinya kontaminasi patogen lainnya.
Achmad dan M. Maisaroh. 2012. Identifikasi dan Uji Patogenisitas PenyebabPenyakit Hawar Daun pada Suren (Toona sureni MERR.). Jurnal Manajemen Hutan Tropika, 10 (1) : 67-75.
Agrios, G.N. 1996. Ilmu Penyakit Tumbuhan (Terjemahan Munzir Busnia). Yogyakarta: Gadjah Mada University Press.
Arizal, Elvin Haris, Agus Supriyanto, dan Salamun. 2014. Isolasi dan Identifikasi Kapang Pada Biji Jagung Dari Ruang Penyimpanan Pasar Tradisional. Jurnal Ilmiah Biologi. 2(2) : 16-25
Black J G. 1999. Microbiology : Principles and Explorations. New Jersey : Prentince Hall.
Burrow,W. 1959. Textbook of Microbiology.W.B. Philadelpia: Saunders Company Chang, S.T., Buswell, J.A. 1996. Mushroom Nutriceuticals.World Journal of
Microbiology and Biotechnology 12:473 Company
Dwidjoseputro.2003.Dasar-Dasar Microbiologi. Malang: Djambatan
Elfina, Yetti, Muhammad Ali, dan Siti Maysaroh. 2013. Idenifikasi Gejala dan Penyebab Penyakit Buah Jeruk Impor Di Penyimpanan di Kota Pekanbaru. Riau: Fakultas Pertanian Universitas Riau.
Ferdias, S., 1992, Mikrobiologi Pangan. Jakarta : Gramedia Pustaka Utama. Ingold, C.T.1975. The Biology Of Fungy. London: Hutchinson Co Publisher.
Lopez, J.L. Casas.S. 2002. Production of lovastatin by Aspergillus terreus. AS: Elsevier Inc.
Ogoshi, A., B. Sneh & L. Burpee. 1985. Identification of Rhizoctonia sp. Minnesota: APSPress.
Omoya, F. O., Boboye, B. E. and Akinyosoye, F. A. 2011. Toxicity Assessment of Varicosporium Alodeae and Articulospora Inflata on Anopheles Mosquito larvae in South West Nigeria. Int.J.PharmTech Res 3(4): 2190-2194.
Perhutani. 1999. Selayang Pandang Persemaian Permanen Pongpoklandak KPH Cianjur. Cianjur: Perum Perhutani Unit III Jawa Barat KPH Cianjur.
Sadiqul, M. 2010. Laporan Praktikum Laboratorium Lingkungan Isolasi Dan Pemurnian Mikrobia. Banjarbaru: Program Studi Teknik Lingkungan Fakultas Teknik Universitas Lambung Mangkurat.
Saimee, S.M. 2003. Screening of Lovastatin Production by Filamentous Fungi. Biomed Journal 7(1):29-33.
Semangun, H. 1996. Pengantar Ilmu Penyakit Tumbuhan. Yogyakarta: Gajah Mada Univ Press.
Soni, 2010. The Biochemistry and Physiology of Infectious Plant Diseases. New Jersey: D. Van Nostrand.
