32
Penelitian yang dilakukan merupakan jenis penelitian eksperimental pre-post test dengan desain yaitu paralel.
3.2 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian akan dilakukan selama 98 hari dan bertempat di Laboratorium Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Islam Indonesia, Laboratorium Patologi Anatomi Universitas Gadjah Mada, serta Laboratorium Riset Universitas Islam Indonesia.
3.3 Populasi dan Sampel 3.3.1 Populasi penelitian
Populasi penelitian ini adalah tikus putih jantan (Rattus norvegicus) galur Sprague Dawley yang didapatkan dari Fakultas MIPA Universitas Islam Indonesia. Tikus putih jenis ini dipilih karena memiliki tingkat reproduksi yang tinggi dan insidensi tumor yang rendah. Selain itu Sprague Dawley mudah dalam penanganannya karena lebih tenang. (Johnson, 2012) Sedangkan tikus jantan dipilih karena tidak dipengaruhi oleh hormon, misalnya hormon estrogen (Dorsett dan Martin, 2004).
3.3.2 Sampel penelitian
Sampel penelitian ini adalah tikus putih jantan (Rattus norvegicus) galur Sprague Dawley yang dikembangkan di Fakultas MIPA Fakultas Kedokteran Universitas Islam Indonesia yang memenuhi kriteria inklusi dan eksklusi.
Kriteria inklusi dalam penelitian ini adalah tikus jantan (Rattus norvegicus) galur Sprague Dawley berumur 2 – 3 bulan, berat 150 – 250 gram, dan sehat. Pemilihan usia 2 – 3 bulan karena rentang umur tersebut mewakili usia dewasa pada tikus di mana diharapkan proses absorpsi, distribusi, metabolisme, dan ekskresi berjalan dengan optimal. Sedangkan kriteria sehat ditandai dengan gerakan-gerakan tikus seperti makan,
minum, mata bersinar, bulu tidak berdiri, dan tidak terdapat luka atau cacat tubuh (Julian, 2008).
Kriteria eksklusi dan kriteria drop out dalam penelitian ini adalah tikus mati atau mengalami infeksi selama perjalanan penelitian yang bukan disebabkan oleh perlakuan penelitian.
Penelitian ini merupakan penelitian payungan tentang perbandingan efektivitas pemberian gel ekstrak Centella asiatica (1 %, 3%, dan 5%), gel ekstrak Aloe vera asiatica (1 %, 3%, dan 5%), mikroemulsi Centella asiatica, gel tanpa bahan aktif, dan larutan povidon iodin 5%, sehingga total kelompok penelitian adalah 9 kelompok. Dengan menggunakan rumus Federer (1963), besar sampel tiap kelompok adalah :
(n – 1)(t – 1) > 15 (n – 1)(9 – 1) > 15 (n – 1)(8) > 15 (n – 1)(8) > 15 8n > 23 n > 3 (Pembulatan)
Keterangan : n = Jumlah tikus perkelompok penelitian t = Jumlah kelompok perlakuan
Pada penelitian ini menggunakan 3 kelompok perlakuan, antara lain : 1. Kelompok perlakuan yang diberi gel ekstrak Centella asiatica 2. Kelompok perlakuan yang diberi gel tanpa bahan aktif
3. Kelompok perlakuan yang diberi larutan povidon iodin 5%
Sehingga, besar sampel penelitian ini 15 ekor. Dengan rincian, tiap kelompok perlakuan berjumlah 3 ekor tikus. Tikus pada penelitian ini diberi 1 kali perlakuan dalam sehari (Primasari, 2013).
3.4 Variabel Penelitian 3.4.1 Variabel bebas
Variabel bebas pada penelitian ini adalah gel ekstrak Centella asiatica, gel tanpa bahan aktif, dan larutan povidon iodin 5 %.
3.4.2 Variabel terikat
Variabel terikat pada penelitian ini adalah kecepatan proses penyembuhan luka bakar derajat II tikus putih jantan (Rattus norvegicus).
3.4.3 Variabel terkendali
Variabel terkendali pada penelitian ini adalah :
1. Hewan uji yang digunakan adalah tikus putih (Rattus norvegicus) galur Sprague Dawley.
2. Jenis kelamin tikus adalah jantan. 3. Umur tikus adalah 2 – 3 bulan.
4. Berat badan tikus adalah 150-250 gram.
5. Tikus diberi luka bakar derajat II dengan posisi supinasi disuntikan anastesi sodium pentobarbital secara intraperitoneal, kemudian meletakkan bagian punggung tikus di atas hotplate dengan temperatur 95oC selama 93 detik.
3.5 Definisi Operasional
1. Ekstrak Centella asiatica adalah serbuk kering Centella asiatica yang diperoleh dari Merapi Farma yang diekstraksi dengan metode maserasi menggunakan etanol 70 % sebagai pelarut. Pelarut etanol dinilai lebih efektif dalam penyembuhan luka (Somboonwong et al., 2012).
2. Gel ekstrak Centella asiatica adalah ekstrak Centella asiatica dengan dosis yang dibuat dalam bentuk gel dengan basis CMC Na konsentrasi 5 % (Khan et al, 2013).
3. Gel tanpa bahan aktif adalah gel dengan basis CMC Na konsentrasi 5 % tanpa ekstrak Centella asiatica.
4. Larutan povidon iodin 5% adalah larutan yang mengandung povidon iodin dalam akuades dengan konsentrasi 5% yang diperoleh melalui pengenceran povidon iodin 10% (produk pasaran).
5. Luka bakar derajat II adalah luka yang sengaja dibuat pada punggung tikus putih jantan (Rattus norvegicus) galur Sprague Dawley dengan menggunakan hotplate bertemperatur 95oC selama 93 detik.
6. Parameter penyembuhan luka adalah persentase luas luka bakar derajat II pada hari ke-4, ke-8, ke-11, dan ke-15 dan evaluasi reepitelisasi (Primasari, 2013).
7. Luas luka adalah perkalian antara panjang dan lebar dari luka bakar derajat II tikus yang dinyatakan dalam satuan cm2 dan panjang tegak lurus terhadap lebar dihitung dengan menggunakan millimeter block. 8. Persentase luas luka bakar derajat II adalah hasil perkalian antara luas
luka bakar pada saat awal diberi luka dikurangi luas luka bakar pada hari ke-4, ke-8, ke-11, dan ke-15 kemudian dibagi dengan luas luka bakar pada saat awal diberi luka dengan 100% sesuai dengan rumus. Semakin besar persentase luas luka bakar derajat II semakin baik penyembuhan luka tersebut (Primasari, 2013).
9. Evaluasi reepitelisasi adalah evaluasi pembentukan jaringan granulasi dan epitel pada jaringan luka dengan melakukan pemeriksaan dibawah mikroskop cahaya.
3.6 Instrumen Penelitian
Instrumen pada penelitian ini adalah sebagai berikut : a. Bahan
1. Gel ekstrak Centella asiatica : a. Serbuk kering Centella asiatica b. Larutan etanol 70 %
c. Na CMC d. Propilen glikol e. Aquades
2. Gel tanpa bahan aktif 3. Larutan Povidon Iodin 5% :
a. Larutan Povidon Iodin 10% b. Aquades
f. Larutan Ketamin g. Normal salin h. Eter i. Larutan formalin 10% j. Alkohol 70 % b. Alat
1. Seperangkat alat maserasi 2. Rotary evaporator 3. Gelas beaker
4. Kandang tikus dengan makanan dan minuman 5. Timbangan Ohause 6. Gunting 7. Silet 8. Spuit injeksi 3 cc 9. Stopwatch 10. Termometer
11. Kertas milimeter block 12. Spidol dan alat tulis lainnya 13. Label 14. Mika 15. Kamera digital 16. Pipet 17. Tissue 18. Spatula 19. Kassa steril 20. Plester 21. Masker 22. Sarung tangan 23. Kaca objek 24. Mikroskop cahaya 25. Magnetic stirrer
26. Besi 2 x 2 cm 3.7 Alur Penelitian
3.7.1 Persiapan hewan coba
Pemilihan subyek penelitian yaitu tikus putih jantan (Rattus norvegicus) galur Sprague Dawley berusia 2 – 3 bulan dengan berat badan 150 – 250 gram, sehat ditandai dengan gerakan-gerakan tikus seperti makan, minum, mata bersinar, bulu tidak berdiri, dan tidak terdapat luka atau cacat tubuh (Julian, 2008).
Jumlah tikus adalah 15 ekor yang dibagi menjadi lima kelompok (Centella asiatica (dosis 1, 2, dan 3), povidon iodine, dan gel kosongan). Masing-masing kelompok terdiri atas 3 ekor tikus putih jantan yang dibagi secara acak. Hewan coba dipelihara dalam kandang berukuran 40 cm x 20 cm x 20 cm (Primasari, 2013). Masing-masing kandang maksimal diisi oleh 1 ekor tikus. Tikus diaklimatisasi pada lingkungan dengan suhu 20-250 C, kelembapan 60-75% (Akhoondinasab, Akhoondinasab, & Saberi, 2014).
Makanan tikus yang diberikan berupa pelet. Pemberian makanan dan minuman kepada binatang percobaan dilakukan secara ad libitum. Masing-masing kandang maksimal diisi oleh 1 ekor tikus dan dijaga sedemikian rupa sehingga tidak terjadi interaksi yang berlebihan (Ridwan, E., 2013). Kandang dibersihkan secara rutin. Persiapan dan aklimatisasi hewan coba dilakukan di Laboratorium Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Islam Indonesia dengan pengaturan 12 jam terang dan 12 jam gelap (Khan et al, 2013). Sedangkan untuk aklimatisasi ini sendiri akan dilakukan selama 14 hari.
3.7.2 Pembuatan gel ekstrak Centella asiatica a. Pembuatan ekstrak Centella asiatica
Pembuatan ekstrak dilakukan dengan cara maserasi. Serbuk kering Centella asiatica sebanyak 500 gram yang didapatkan dari Merapi Farma diambil dan dimasukkan ke dalam toples dan ditambahkan 6 L larutan etanol 70 % (Somboonwong et al., 2012). Lalu didiamkan selama 24 jam
di tempat yang terlindung dari cahaya. Sesekali dilakukan pengadukan agar tidak jenuh. Kemudian, disaring dua kali dengan menggunakan saringan biasa dan yang kedua dengan menggunakan kertas saring, hingga tidak didapatkan ampas pada ekstrak. Ekstrak kemudian dipekatkan melalui evaporasi pada suhu 60o C, hingga diperoleh ekstrak kental. Esktrak kental kemudian ditimbang. Kelebihan metode maserasi, yaitu mudah dilakukan dan mudah diusahakan (Mukhriani, 2014).
Pembuatan ekstrak Centella asiatica menggunakan etanol 70 % di pilih karena rendemen ekstrak daun pegagan menggunakan pelarut etanol 70 % lebih besar daripada pelarut air. Hal tersebut menurut Sugianto (2013) menandakan bahwa metabolit sekunder di dalam daun pegagan lebih banyak terekstrak pada pelarut etanol akibat perbedaan kepolaran antar gugus hidroksil dan metil. Rendemen merupakan perbandingan jumlah ekstrak yang diperoleh dengan simplisia awal yang digunakan dan standar yang disarankan sebesar 7,2 % (Depkes, 2008). Menurut Nurlalily (2012) penggunaan etanol atau metanol lebih disarankan sebagai pelarut dalam ekstrak Centela asiatica, selain itu kandungan asiaticoside dan madecassoside lebih tinggi pada ektrak etanol dan disusul ekstrak methanol.
b. Pembuatan gel ekstrak Centella asiatica dan gel tanpa bahan aktif Formulasi untuk gel ekstrak Centella asiatica dengan variasi dosis yaitu 0,2 gram, 0,6 gram, dan 1 gram. Formulasi sediaan gel ekstrak Centella asiatica dan gel tanpa bahan aktif (F4) yang digunakan dapat dilihat pada tabel berikut :
Tabel 3.1 Formula pembuatan gel ekstrak Centella asiatica dan gel tanpa bahan aktif
Nama Bahan F1 (ekstrak dosis 1) F2 (ekstrak dosis 2) F3 (ekstrak dosis 3) F4 (gel tanpa bahan aktif) Ekstrak kental Centella asiatica 1 % (0,2 gram) 3 % (0,6 gram) 5 % (1 gram) -Na CMC 5 % (1 gram) 5 % (1 gram) 5 % (1 gram) 5 % ( 1 gram) Propilen glikol 5 % (1 gram) 5 % (1 gram) 5 % (1 gram) 5 % (1 gram) Aquades 100% (20 gram) 100% (20 gram) 100% (20 gram) 100% (20 gram)
Ekstrak Centella asiatica yang telah dibuat kemudian dilanjutkan dengan pembuatan gel. Basis gel yang digunakan adalah CMC Na. Langkah pertama yaitu Na CMC dikembangkan dengan sebagian aquades (bagian 1). Kemudian campur ekstrak kental Centella asiatica dengan aquades sisa (bagian 2). Lalu propilen glikol dicampur dalam satu wadah dengan bagian 1 dan 2 serta kemudian dihomogenkan dengan magnetic stirer sampai terbentuk gel.
3.7.3 Pembuatan larutan Povidon Iodin 5 %
Penelitian ini menggunakan larutan povidon iodin konsentrasi 5% yang diperoleh dari pengenceran produk povidon iodin yang sudah tersedia di pasaran yaitu Betadine® (konsentrasi 10%). Sehingga pada penelitian ini dilakukan pengenceran menggunakan akuades. Pemilihan konsentrasi ini didapatkan melalui penelitian sebelumnya yaitu Primasari (2012) menjelaskan bahwa tidak terdapat perbedaan rata-rata luas luka biopsi yang bermakna diantara kelompok larutan povidon iodin 5%,
kelompok Silver Sulfadiazin (SSD), dan kelompok NaCl. Sehingga dalam hal ini, baik larutan povidon iodin dan krim SSD merupakan terapi yang efektif untuk luka. Selain itu menurut Prasetyo (2011) larutan povidon iodin 5 % memiliki kecepatan penyembuhan luka yang lebih cepat dibandingkan konsentrasi 10 %. Hal ini dapat dikarenakan oleh daya toksisitas povidon iodin konsentrasi 5 % lebih kecil dan efek terapeutik yang baik dalam menginduksi angiogenesis.
Pengenceran povidon iodin 10% dilakukan dengan menggunakan persamaan :
V1.C1=V2.C2
Keterangan: V1: Volume awal yang dibutuhkan untuk larutan baru
V2: Volume akhir yang diinginkan dari larutan baru
C1: Konsentrasi pada larutan awal
C2: Konsentrasi yang diinginkan pada larutan baru
V1.C1 = V2.C2
50 mL.10 = V2.5
V2 = 100 mL
Diperoleh povidon iodin 5% dalam 100 mL akuades. 3.7.4 Perlakuan luka bakar pada hewan coba
Hewan penelitian yang dipilih secara acak dibagi dalam tiga kelompok perlakuan dan ditempatkan dalam kandang yang berisi 1 tikus tiap kandangnya. Sebelum tikus diberikan luka bakar, tikus dianastesi terlebih dahulu dengan ketamin intramuskular di paha posterior, lalu bulu tikus dicukur pada area punggung. Proses pembiusan harus dilakukan dengan hati-hati agar tikus tidak mati. Perlakuan luka bakar ini dilakukan dengan menggunakan hotplate, di mana pada penelitian ini menggunakan besi berukuran 2 x 2 cm. Pemanasan ini dilakukan hingga 95 oC selama 20 menit untuk mendapatkan panas yang sesuai. Lalu besi disentuhkan ke area punggung hewan coba yang telah disiapkan selama 93 detik.
Menurut Somboonwong (2012) luka bakar derajat II dapat dilakukan dengan menempatkan hotplate berukuran 3, 5 x 4, 6 cm ke tubuh hewan coba yang telah dipersiapkan pada temperature 75 oC selama 10 detik. Sedangkan menurut Pessolato et al (2013) luka bakar derajat II dapat dilakukan dengan kontak menggunakan hotmetal bersuhu 130 oC selama 5 detik. Kulac (2013) juga menjelaskan prosedur pembuatan luka bakar derajat II pada tikus dengan menggunakan besi aluminium berdiameter 2,5 cm yang dipanaskan hingga suhu 100 oC selama 30 menit dan disentuhkan ke punggung tikus selama 30 detik. Sehingga berdasarkan berbagai referensi tersebut luka bakar derajat II sebenarnya dapat ditinjau dari pembentukan luka yang terjadi sesuai dengan ciri- ciri luka bakat derajat it sendiri. Pada hari perlakuan yang dilakukan oleh peneliti secara klinis menunjukkan ciri- ciri dari luka bakar derajat II superficial atau dangkal dengan dasar kemerahan. Setelah diberi luka bakar, tikus kemudian diresusitasi dengan memberikan injeksi larutan normal salin secara intraperitoneal (Soombonwong et al, 2012)
3.7.5 Pemberian gel pegagan (Centella asiatica) secara topikal, gel tanpa bahan aktif, dan larutan povidon iodin 5%
Kemudian tikus mendapat perlakuan sesuai dengan kelompok masing-masing segera setelah pengukuran luas luka bakar derajat II pada hari perlakuan. Kelompok hewan uji antara lain kelompok yang diberi gel Centella asiatica secara topikal, kelompok yang diberi gel tanpa bahan aktif, dan kelompok yang diberi larutan povidon iodin 5%. Terapi pemberian gel Centella asiatica dan gel tanpa bahan aktif dilakukan dengan menggunakan spatula yang dioleskan merata pada luka tikus, sedangkan pemberian larutan povidon iodin 5% dengan menggunakan pipet, kemudian diratakan dengan menggunakan spatula. Perlakuan dilakukan tiap sekali kali sehari. Berat badan tikus ditimbang tiap pekan. Perawatan luka tikus dilakukan 1 kali sehari hingga akhir waktu penelitian yaitu 15 hari (Satar et al, 2013).
3.7.6 Perhitungan proses penyembuhan luka
Perhitungan proses penyembuhan luka bakar, dihitung segera dengan menggunakan millimeter block setelah diberikan luka bakar derajat II (hari ke-1) dan pada hari ke-4, 8, 11, 15 sesuai dengan waktu penyembuhan luka. Luas area luka bakar pada hari pertama dianggap sebagai 100% dan hasil perhitungan untuk hari ke- 4, 8, 11, dan 15 akan dibandingkan dengan area luka bakar pada hari pertama (Primasari, 2013).
3.7.7 Pemeriksaan histopatologi
Pemeriksaan histopatologi dilakukan untuk mengevaluasi proses penyembuhan luka mikrokopis yang terjadi setelah hari ke-15 (hari terakhir diberikan terapi). Jaringan kulit yang akan digunakan untuk pemeriksaan histopatologi diambil dengan melakukan eksisi pada sebagian area luka bakar. Sebelum melakukan eksisi, tikus diterminasi terlebih dahulu dengan menggunakan eter (Primasari, 2013). Jaringan yang telah diambil kemudian difiksasi dengan menggunakan formalin 10%. Setelah itu dilakukan pembuatan preparat dengan pemotongan menjadi bagian-bagian kecil kulit bekas luka yang sudah ditentukan. Kemudian jaringan dilakukan dehidrasi alkohol dengan dimasukkan ke dalam automatic tissue processor secara bertahap yaitu 70% - 100%, untuk mengambil semua air di dalam jaringan dan membersihkan sisa fiksatif. Lalu dilakukan clearing xylol untuk membersihkan sisa alkohol dan infiltrasi paraffin cair pada suhu 57 – 59 o C selama 1,5 jam ke dalam box parafin untuk mengisi rongga dalam jaringan yang ditempati oleh air sehingga terbentuk blok paraffin. Setelah itu didinginkan ke dalam freezer agar tidak terlalu lunak sehingga mudah dipotong. Jaringan kemudian dipotong dengan ketebalan 5μm dengan mikrotom dan dilakukan pengecatan dengan menggunakan pewarnaan Mallory (Nugraha, 2013). Selanjutnya sampel jaringan diperiksa menggunakan mikroskop cahaya dengan OptiLab viewer perbesaran 40x, 100x, dan 400x lensa obyektif untuk mengevaluasi perubahan patologi yang terjadi yaitu proses re-epitelisasi dan kolagenisasi pada jaringan luka (Soombonwong et al, 2012).
Perhitungan re-epitelisasi dilihat dengan menghitung panjang epitel menggunakan image raster, sedangkan pada perhitungan kepadatan kolagen dilakukan dengan menggunakan aplikasi image-j. Sebelumnya preparat kolagen pada tiap kelompok yang teramati difoto pada tiga area berbeda dengan perbesaran 400x pada daerah kolagen baru atau dalam preparat dapat teramati sebagai garis- garis berwarna biru muda (Lemo et al, 2010). Setelah itu foto preparat dilakukan proses editing dengan menggunakan aplikasi Adobe photoshop CS5 untuk menghilangkan bagian- bagian yang tidak diperlukan atau akan mengganggu proses perhitungan, seperti pembuluh darah, sel radang, dan jaringan granulasi. Foto yang telah dilakukan editing dibuka menggunakan image- j dan diubah menjadi ukuran 16 bit. Lalu dilakukan pembedaan warna dengan menggunakan threshold dan dilakukan pengukuran persen gambaran garis-garis kolagen yang tervisualkan.
3.7.8 Kerangka penelitian
Tabel 3.2 Kerangka penelitian
Dianastesi diberi luka bakar derajat II pada punggung tikus
Dioleskan larutan povidon iodin 5 % Tikus putih jantan (Rattus
norvegicus)galur Sprague Dawley
N = 15 ekor
Dioleskan gel ekstrak Centella asiatica 1%, 3%,5%
Kelompok perlakuan gel Centella asiatica 1
%, 3%, dan 5% N = 9 ekor
Kelompok perlakuan povidon iodin 5%
N = 3 ekor
Variabel terkendali : jenis kelamin, umur, berat badan, makanan, minuman, luas luka awal, penyakit penyerta, waktu.
Pada hari ke-4, 8, 11, 15 dihitung area luas bakar luka dijiplak dengan mika ke dalam kertas millimeter block dan setelah hari ke-15
dilakukan pemeriksaan histopatologi (Mallory)
Dianalisis dengan menggunakan uji One way
ANOVA
Kelompok perlakuan gel tanpa bahan aktif
N = 3 ekor
Dioleskan gel tanpa bahan aktif
Area luas luka bakar derajat II dijiplak dengan mika dan dihitung dengan menggunakan kertas millimeter block
Dianalisis dengan menggunakan post hoc test
3.8 Rencana Analisis Data
Proses penyembuhan luka bakar derajat II pada tikus jantan (Rattus norvegicus) galur Sprague Dawley dihitung berdasarkan luas luka bakar yang diukur dengan menggunakan kertas millimeter block pada hari pertama sebelum diterapi, dan pada hari ke-4, ke-8, ke-11, dan ke-15. Hasil tersebut kemudian dikonversikan dalam bentuk persen untuk menghitung derajat kesembuhan luka bakar (%) masing-masing tikus berdasarkan kelompok perlakuan dan hari pengukuran dengan perhitungan sebagai berikut:
P = Keterangan :
P = Persentase derajat kesembuhan luka bakar pada hari yang ditentukan
A = Luas area luka bakar pada saat awal dilukai
B = Luas area luka bakar sesuai waktu yang ditentukan
Penelitian ini merupakan penelitian analitik komparatif numerik dengan lima kelompok, apabila distribusi data normal maka digunakan uji analisis varian satu arah (one way ANOVA) dan selanjutnya dilakukan uji post-hoc. Jika distribusi data tidak normal maka data dianalisis dengan uji Kruskal-Wallis untuk membandingkan perbedaan rata-rata mean dan data numerik pada masing-masing kelompok. Sedangkan untuk membandingkan sebelum dan sesudah perlakuan dianalisis dengan menggunakan post hoc test. Data akan dimasukkan dan dianalisis menggunakan Statistical Package for Soscial Science (SPSS) versi 20,0.
3.9 Etika Penelitian
1. Peneliti mengajukan surat permohonan ijin pengajuan surat etika penelitian ke Fakultas Kedokteran Universitas Muhammadiyah Yogyakarta untuk menghindari konflik kepentingan.
2. Peneliti mengajukan permohonan izin terlebih dahulu kepada pihak pengelola Laboratorium Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Islam Indonesia.
3. Peneliti ikut berperan dalam menjaga kebersihan dan keamanan di Laboratorium Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Islam Indonesia.
4. Sampel penelitian ini adalah tikus putih jantan (Rattus norvegicus) galur Sprague Dawley yang dikembangkan di Laboratorium Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Islam Indonesia dan diaklimatisasi terlebih dahulu selama 14 hari. Tikus diberi makan dan minum secara teratur dan ditempatkan di dalam kandang yang layak pada suhu kamar dan dengan pengaturan 12 jam terang-12 jam gelap.
5. Sebelum dilukai, tikus dianastesi terlebih dahulu dengan menggunakan injeksi ketamin secara intramuskular, sehingga tidak menyakiti tikus. 6. Setelah penelitian berakhir (hari ke-15) dilakukan eutanasia dengan
menggunakan eter dengan dosis berlebih dalam tabung.
7. Setelah tikus mati, seharusnya tikus dibakar dengan menggunakan insenerator, namun karena tidak ada fasilitas tersebut, maka tikus kemudian dikubur.
3.10 Jadwal penelitian
Tabel 3.3 Tabel jadwal penelitian
Jadwal Tanggal
Seminar proposal 21 Januari 2016 Pengajuan ethical clearance 14 Juli 2015 Pembuatan gel ekstrak Centella
asiatica, gel tanpa bahan aktif, dan larutan povidon iodin 5%
05 Oktober 2015
Aklimatisasi hewan coba 11 Oktober 2015 Perlakuan hewan coba 29 Oktober 2015 Pengumpulan dan analisis data hasil
percobaan
22 Januari 2016
