Teknik teknik Dalam Bioteknologi Modern

(1)

(2)

Bioteknologi

Judul :

(3)

PCR

merupakan suatu teknik atau

metode perbanyakan

(replikasi) DNA

secara enzimatik

tanpa

menggunakan

organisme.

Saat ini PCR sudah digunakan secara luas untuk berbagai macam kebutuhan, diantaranya:

a. Isolasi Gen

b. DNA Sequencing

c. Forensik

(4)

Manfaat teknik

PCR

ini berdampak sangat luas terhadap kemajuan

sains dan teknologi secara umum yaitu antara lain sebagai berikut:

1. Memperkuat gen spesifik sebelum diklon. 2. Membuat fragmen gen DNA secara berlimpah

3. Dapat mendeteksi DNA gen virus yang sulit untuk dideteksi

4. Dapat mendeteksi/ mendiagnosis DNA sel embrionik yang mengalami kelainan sebelum dilahirkan.

5. Bidang kedokteran forensik. Contohnya mendeteksi penyakit yang dapat menginfeksi, variasi dan mutasi dari gen.

6. Mengetahui hubungan kekerabatan antar spesies atau untuk mengetahui dari mana spesies tersebut berasal.

(5)

1. Tahap peleburan (melting)/denaturasi. Pada tahap ini (suhu tinggi, 94–96 °C) ikatan H DNA terputus (denaturasi) dan DNA menjadi berberkas tunggal. Biasanya pada tahap awal PCR tahap ini dilakukan agak lama (sampai 5 menit) untuk memastikan

semua berkas DNA terpisah. Durasi 1–2 menit.

2. Tahap penempelan atau annealing. Primer menempel pada bagian DNA templat yg komplementer urutan basanya. Ini dilakukan pada suhu antara 45–60°C. Penempelan ini bersifat spesifik. Suhu yang tidak tepat menyebabkan tidak terjadinya penempelan atau primer menempel di sembarang tempat. Durasi tahap ini 1–2 menit.

3. Tahap pemanjangan atau elongasi. Suhu untuk proses ini tergantung dari jenis DNA polimerase (ditunjukkan oleh P pada gambar) yang dipakai. Dengan Taq-polimerase, proses ini biasanya dilakukan pada suhu 76 °C. Durasi waktu 1 menit. 3. Tahap pemanjangan atau elongasi. Suhu untuk

(6)

(7)

(8)

(9)

Elektroforesis

utk pemisahan campuran senyawa yg berbeda

dengan teknik analisis serta pemisahan yang pernah didiskusikan.

Pemisahan tergantung pada ;

• _{Struktur kimia}

• pH,

• Gugus fungsional

• _{Dan bobot molekulnya.}

Analisis ini sangat informatif tentang data:

• Senyawa

metaboli

t maupun senyawa

biokimia

dengan BM

besar

• _{Tidak diperlukan jumlah besar}

_{, dan pemurnian yang tinggi.}

(10)



_{Menyediakan informasi}

_mengenai

_{ukuran, konfirmasi}

_dan

muatan

dari

protein

dan asam nukleat



_Sebagai

_{metode pemisahan}

_{yang dapat digunakan untuk}

menentukan komponen dari protein

atau asam nukleat setiap

individu



_{Pada bidang kepolisian teknik ini digunakan nuntuk}

pemeriksaan DNA

, karakteristik khusus, misalnya sidik jari.

Sehingga membantu polisi dalam mengungkap sebuah kasus.



_{Dalam biologi molekuler, elektroforesis merupakan salah satu}

(11)

(12)

(13)

(14)

(15)

(16)

Kertas sebagai fase diam dan partikel bermuatan yang terlarut sebagai fase gerak, terutama ion-ion komleks

Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi sepanjang sistem pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan adsorpsivitas zat terlarut.

(17)

Keunggulan Elektroforesis Kertas

• _{Proses migrasi lebih cepat}

• _{Pemisahan spot menjadi lebih kecil}

• _Mudah

_memisahkan

_sampel

_dengan

spektrofotometri

• _{Mudah dilarutkan dalam pelarut dalam jumlah}

sedikit.

Keunggulan Elektroforesis Kertas

• _{Proses migrasi lebih cepat}

• _{Pemisahan spot menjadi lebih kecil}

• _Mudah

_memisahkan

_sampel

_dengan

spektrofotometri

• _{Mudah dilarutkan dalam pelarut dalam jumlah}

sedikit.

Kekurangan Elektroforesis Kertas

Adanya gangguan yg disebabkan oleh adanya gugus OH- yg

terdapat pada selulosa yg dapat berinteraksi dengan molekul

polar sehingga daya migrasi molekul tersebut terganggu dan

menjadi lebih rendah

Kekurangan Elektroforesis Kertas

(18)

(19)

(20)

(21)

(22)

 _{Jika atom akan membentuk ikatan dengan atom lain maka}

(23)

Molekul CH

₄

•

₆

C 1 s

2

2s

2

2p

2





Atom C harus menyediakan 4 orbital dengan

e tunggal, karena akan mengikat 4 atom H





6

(24)

Bentuk orbital 2s dan 2p

Bentuk terpisah

S

P

_y

P

z

(25)

Bentuk orbital 2s dan 2p

Bentuk terpisah

S

P

z

(26)

S

Px Py Pz

Proses Hibridisasi

Setelah mengalami

hibridisasi

(27)

Hibrida

siap menerima atom lain.

H

Karena yang mengalami hibridisasi terdiri 1

orbital S dan 3 orbital P, maka jenis

(28)

Bentuk hibridanya

Tetrahedral

H

C

Antar Orbital dalam molekul saling

tolak menolak sehingga bentuk ruang

geometrinya sangat ditentukan oleh

(29)

(30)

Sekuensing DN

adalah proses penentuan urutan nukleotida pada suatu fragmen DNA. Dewasa ini, hampir semua usaha sekuensing DNA dilakukan dengan menggunakan metode terminasi rantai yang dikembangkan oleh Frederick Sanger. Teknik tersebut melibatkan terminasi atau penghentian reaksi sintesis DNA in vitroyang spesifik untuk sekuens tertentu menggunakan substrat nukleotida yang telah dimodifikasi.

Pada metode sekuensing terminasi rantai (metode Sanger), perpanjangan atau ekstensi rantai DNA dimulai pada situs spesifik pada DNA cetakan dengan menggunakan oligonukleotida pendek yang disebut primer yang komplementer terhadap DNA pada daerah situs tersebut. Primer tersebut diperpanjang menggunakan DNA polimerase , enzim yang mereplikasi DNA. Bersama dengan primer dan DNA polimerase, diikutsertakan pula empat jenis basa deoksinukleotida, juga nukleotida pemutus atau penghenti rantai (terminator rantai) dalam konsentrasi rendah. Penggabungan nukleotida pemutus rantai tersebut secara terbatas kepada rantai DNA oleh polimerase DNA menghasilkan fragmen-fragmen DNA yang berhenti bertumbuh hanya pada posisi pada DNA tempat nukleotida tertentu tersebut tergabungkan. Fragmen-fragmen DNA tersebut lalu dipisahkan menurut ukurannya dengan elektroforesis.

Metode sekuensing DNA yang lain adalah metode Maxam dan Gilbert yang didasari oleh modifikasi kimiawi DNA yang dilanjutkan dengan pemotongan DNA.

Sekuensing DN

adalah proses penentuan urutan nukleotida pada suatu fragmen DNA. Dewasa ini, hampir semua usaha sekuensing DNA dilakukan dengan menggunakan metode terminasi rantai yang dikembangkan oleh Frederick Sanger. Teknik tersebut melibatkan terminasi atau penghentian reaksi sintesis DNA in vitroyang spesifik untuk sekuens tertentu menggunakan substrat nukleotida yang telah dimodifikasi.

Pada metode sekuensing terminasi rantai (metode Sanger), perpanjangan atau ekstensi rantai DNA dimulai pada situs spesifik pada DNA cetakan dengan menggunakan oligonukleotida pendek yang disebut primer yang komplementer terhadap DNA pada daerah situs tersebut. Primer tersebut diperpanjang menggunakan DNA polimerase

, enzim yang mereplikasi DNA. Bersama dengan primer dan DNA polimerase, diikutsertakan pula empat jenis basa deoksinukleotida, juga nukleotida pemutus atau penghenti rantai (terminator rantai) dalam konsentrasi rendah. Penggabungan nukleotida pemutus rantai tersebut secara terbatas kepada rantai DNA oleh polimerase DNA menghasilkan fragmen-fragmen DNA yang berhenti bertumbuh hanya pada posisi pada DNA tempat nukleotida tertentu tersebut tergabungkan. Fragmen-fragmen DNA tersebut lalu dipisahkan menurut ukurannya dengan

elektroforesis.

(31)

Sekuensing

(32)

Sekuensing protein atau sekuensing peptida adalah penentuan urutan asam anino pada suatu protein atau peptida (oligopeptida maupun polipeptida). Metode untuk sekuensing protein umumnya melibatkan pemutusan ikatan yang diikuti dengan identifikasi asam amino.

Pada metode degradasi Edman, residu

pada ujung-N (ujung

(33)

Walaupun polisakarida juga merupakan

biopolimer

(yang termasuk

dalam karbohidrat dengan monomer monosakarida, tidaklah lazim untuk

melakukan 'sekuensing' polisakarida, karena beberapa alasan. Walaupun

banyak polisakarida yang berstruktur rantai lurus, banyak pula yang

berstruktur bercabang. Terdapat banyak sekali jenis monosakarida yang

dapat menyusun polisakarida dengan banyak macam cara ikatan

kimia

pula. Selain itu, alasan teoretis utama ketidaklaziman sekuensing

polisakarida adalah bahwa masing-masing polimer lain yang disebutkan di

atas secara umum dibentuk oleh satu jenis

enzim

berdasarkan 'cetakan'

tertentu, sedangkan satu penggabungan monomer pada polisakarida dapat

dibentuk

oleh

berbagai

jenis

enzim.

Sering

kali

pembentukan

ikatan

polimer polisakarida tidaklah spesifik; bergantung

pada enzim yang beraksi, satu dari beberapa jenis monomer dapat

digabungkan. Hal ini dapat mengakibatkan terbentuknya sekelompok

molekul yang mirip satu sama lain.

(34)

(35)

Pembuatan sel hibridoma

terdiri dari tiga tahap utama yaitu

imunisasi

,

fusi

, dan

kloning

.

Imunisasi

dapat dilakukan dengan imunisasi konvensional, imunisasi

sekali

suntik intralimpa

, maupun imunisasi in vitro.

(36)

(37)

(38)

Any

(39)

Sumber Lain yang Relevan

Rizki.2012.Bahan Ajar Bioteknologi.Rios Multicipta.Padang

https://www.youtube.com/results?search_query=elektroforesis Diakses : 25/2/15 17:25