Topik 2 Isolasi dan Pengawetan Mikroorga

Pendahuluan

•Meskipun teknologi DNA rekombinan telah meningkatkan produksi berbagai produk

Mengapa harus mengkarakterisasi isolat

mikrobial?

•Memastikan taksonomi yang tepat untuk

menentukan metode pengawetan yang tepat.

•Menguji ketepatan metode pengawetan yang digunakan dan dapat melakukan modifikasi serta memperbaiki prosedur pengawetan.

Tujuan Skrining

mikroorganisme

Skrining mikroorganisme dilakukan untuk:

Mendeteksi produk baru (metabolit, vitamin,

enzim) serta potensi kegunaan ekonomis lainnya seperti:

•Kontrol biologis

•Biodegradasi

•Bioremediasi

•Proses Kimiawi (biotransformasi, bioakumulasi)

•Pangan dan pemrosesan pangan

Metode dalam isolasi mikroorganisme

•Metode kualitatif (Pengamatan, Mikroskopi)

•Metode kuantitatif (Kecepatan pertumbuhan, kapasitas sporulasi)

•Metode Biokimiawi (kromatografi, uji enzimatis, analisis protein)

Metode Kualitatif

1. Morfologi dan anatomi kultur

 _{Studi anatomi (bentuk dan ukuran spora,}

kloroplas, organisasi intraselular)

 _{Morfologi kultur (pigmentasi, radius koloni,}

pembentukan hifa dan agregasi, penampakan total)

 _{Sporulasi (kelimpahan, jenis)}

 _{Pergerakan (nematoda dan organisme yang}

Morfologi kultur tiga spesies

Monilina

Morfologi kultur tiga spesies

Monilina

Metode Kualitatif (Lanj.)

2. Mikroskopi

 _{Analisis morfologi, anatomi, dan organisasi}

intraselular

 _{Deteksi senyawa biokimia dan struktur makro}

dengan teknik staining (pewarnaan)

 _{Identifikasi menggunakan oligonukleotida dari}

organisme dengan pewarna spesifik

Metode-metode mikroskopi

Mikroskop cahaya

SEM TEM

Metode Kuantitatif

1. Laju Pertumbuhan (bakteri, jamur, alga)

2. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

3. Laju fotosintesis (alga dan bakteri fotosintetik)

4. Laju respirasi

Laju Pertumbuhan

Laju pertumbuhan mikroorganisme (bakteri, ragi, jamur, alga) dapat ditentukan dengan cara:

 _{Penghitungan jumlah sel (mis.: hemasitometer)}  _{Kerapatan Optis pada 600 nm}

 _CFU

Penghitungan jumlah sel dengan

hemasitometer

Untuk sel yang dihitung di kotak A, B, C, D: Kerapatan sel / mL = jumlah sel yang

dihitung × 104 _{× fp}

Untuk sel yang dihitung di kotak kecil di kotak E:

Kerapatan sel / mL = jumlah sel yang dihitung × 2,5 × 105_{× fp}

Kurva Pertumbuhan Mikroorganisme

Rao, D.G. (2005). Introduction to

Kromatografi lapis tipis

Untuk menentukan jumlah metabolit (bakteri,

Produksi enzim / Penggunaan Substrat

Produksi enzim / Penggunaan Substrat

Mikroorganisme yang ditumbuhkan pada

media dengan sumber nitrogen berbeda

Dari kiri ke kanan: 1. Urea

2. Hipoksantin 3. Nitrit

Metabolit Primer

•Metabolit primer: senyawa yang sangat penting untuk hidup dan reproduksi sel, dan

Metabolit sekunder

•Setiap metabolit sekunder dibentuk oleh sedikit mikroorganisme

•Metabolit sekunder tidak esensial untuk pertumbuhan dan reproduksi

•Pembentukannya sangat bergantung pada kondisi lingkungan

•Beberapa metabolit sekunder dihasilkan dengan struktur yang sangat berhubungan

•Beberapa mikroorganisme menghasilkan berbagai golongan senyawa sebagai metabolit sekunder

Metabolit Primer Vs Metabolit sekunder

Metabolisme sekunder dapat dimodifikasi tanpa mengganggu

metabolisme primer. Modifikasi genetik yang menyebabkan modifikasi metabolit sekunder diharapkan tidak mengganggu fungsi sel.

Crueger & Crueger. 1989.

Isolasi Mikroorganisme

•

Isolasi mikroorganisme dilakukan untuk

memperoleh kultur murni ataupun

campuran yang kemudian diuji untuk

menentukan isolat mana yang

menunjukkan reaksi atau produk yang

diinginkan.

•

Dalam beberapa kasus, dimungkinkan

Isolasi Mikroorganisme (Cont.)

•

Kriteria penting untuk pemilihan

mikroorganisme:

1. Karakteristik nutrisi dari mikroorganisme

2. Suhu optimum mikroorganisme

3. Reaksi organisme dengan alat yang akan digunakan dan kesesuaian organisme

dengan jenis proses yang akan digunakan

4. Stabilitas mikroorganisme dan kemudahan untuk manipulasi genetik

5. Produktivitas mikroorganisme

Pengayaan pada media cair

• Dilakukan dalam labu kocok

• Pertumbuhan inokulum campuran akan

• Waktu pemindahan menentukan keberhasilan isolasi, namun tidak selalu mikroorganisme

dengan kecepatan tumbuh spesifik tertinggi adalah yang diinginkan. Mikroorganisme yang diinginkan adalah organisme yang memiliki

afinitas tertinggi terhadap substrat pembatas.

•Substrat pembatas: substrat dalam medium yang konsentrasinya mempengaruhi

pertumbuhan sel dan mengubah fase

pertumbuhan dari fase log ke fase stasioner dan akhirnya ke fase kematian.

Pengaruh konsentrasi substrat terhadap

kecepatan pertumbuhan spesifik mikroorganisme

Pengaruh konsentrasi substrat pada kecepatan tumbuh spesifik mikroorganisme A dan B

Pengayaan kultur pada media padat

•Media padat pada umumnya digunakan untuk isolasi mikroorganisme yang menghasilkan

enzim tertentu.

Skrining mikroorganisme yang diinginkan

Metode Pengayaan Jenis isolat

Nilai pH yang ekstrim (pH 4-2) Asidofilik Suhu yang rendah (4-15°C) Psikotrof Suhu tinggi (42-100°C) Termofilik Konsentrasi NaCl yang tinggi Halofilik

Atmosfir N₂ Anaerobik

Kitin sebagai substrat pertumbuhan Lysobacter Kulit batang pohon, akar Myxobacteria

Butiran pollen Actinoplanes

Crueger & Crueger. 1989.

Sistem uji untuk skrining metabolit

Produk yang diinginkan

Sistem uji

antibiotik Plat agar dengan mikroorganisme uji. Terbentuknya zona bening digunakan sebagai indikator.

Resistensi terhadap

antibiotik β-laktamase Plat agar yang telah ditambah β-laktamase. Protease Plat agar dengan kasein, pemilihan koloni yang

menghasilkan zona bening.

Amilase Plat agar dengan pati, pemilihan koloni setelah pewarnaan dengan iodin.

Lipase Plat agar dengan emulsi minyak, pemilihan koloni setelah pengendapan asam lemak bebas dengan ion Ca2+.

Fosfatase Plat agar dengan fenolftalein-difosfat dan indikator pH. Seleksi berdasarkan perubahan warna

Pengawetan Mikroorganisme

•Penyimpanan harus dilakukan sedemikian hingga:

▫Menghilangkan perubahan genetik

▫Melindungi dari kontaminasi

Pengawetan mikroorganisme

•Penyimpanan pada suhu rendah

▫Penyimpanan pada slope agar

kultur ditumbuhkan pada slop agar dan dapat

disimpan pada lemari pendingin (4°C) atau frezer (-20°C), dan disub kultur setiap 6 bulan sekali

▫_{Penyimpanan pada nitrogen cair}

aktivitas mikroorganisme sangat minim pada suhu sangat rendah (-150 sampai -196°C), yang dapat dicapai dengan penyimpanan pada nitrogen cair. Pada penyimpannnya, mikroorganisme

Pengawetan mikroorganisme

•Penyimpanan dalam bentuk dehidrasi

▫Kultur kering

Tanah yang lembab dan steril diinokulasi dengan kultur dan diinkubasi selama beberapa hari agar

mikroorganisme tumbuh, kemudian dikeringkan pada suhu kamar. Tanah kering disimpan pada suhu ruang atau 4°C. MO dapat bertahan sampai 20 th dengan viabilitas 50%.

▫Liofilisasi

liofilisasi atau pengeringan beku dilakukan dengan membekukan kultur dan dikeringkan pada keadaan vakum, sehingga mengakibatkan sublimasi air dari sel. Pada proses pengeringan, harus ditambahkan