BAHAN dan
METODE
Pemeliharaan dan perawatan monyet dilakukan dengan mengindahkan kaidah yang mengatur hal-ha1 yang berkaitan dengan kesejahteran hewan maupun etika penggunaan hewan percobaan. Semua prosedur pemeliharaan, perawatan, maupun pemanfaatan fasilitas mengikuti protokol baku yang berlaku di PT BioFarma seperti yang tertulis dalam Dokurnen Nomor 115 K-Kera-01. Beberapa metode pelaksanaan penelitian ini dicantumkan di bawah.
Seksio Sesaria
Monyet bunting 130 hari disuntik dengan Atropin sulfas dosis 0,05 mgkg berat badan (bb) secara intra muscular (IM) dan kemudian dilakukan dengan pembiusan awal menggunakan Ketamine-HC1 10 mgkg bb IM. Selanjutnya persiapan dan pelaksanaan prosedur Seksio Sesaria mengikuti protokol baku yang berlaku di PT BioFarma dan didokumentasikan sebagai Dokumen No. 1 1 5K-Kera- 10 (20).
Persiapan Anak Monyet Tanpa Identitas
Anak monyet tanpa induk diseleksi berdasarkan atas berat badan, yaitu hanya dipilih individu dengan berat badan kurang dari 1 kg, kelincahan dalam ha1 gerak maupun kondisi serta kesehatan umum yang baik (Gambar 27). Setelah anak monyet dibius, dilakukan penimbangan berat badan, anak monyet selanjutnya diberi identifikasi dengan cara ditato (Gambar 28), selanjutnya dilakukan uji tuberkulin secara penyuntikan melalui rute intra cutan pada kelopak mata atas (Gambar 29 dan 30), dilakukan deworming melalui pemberian ivermektin, diberi suntikan vitamin B kompleks, diberi antibiotika standar serta diambil darahnya untuk pemeriksaan status mikrobiologisnya (Gambar 3 1). Dua sampai 3 anak monyet dengan berat badan yang hampir sama dikandangkan dalam kandang
stainless steel yang telah dialasi kain tebal supaya anak monyet tidak terperosok
(Gambar 32). Selanjutnya persiapan selengkapnya mengikuti protokol baku yang berlaku di PT BioFarma dan didokumentasikan sebagai Dokurnen Nomor 11 5K- Kera-06 (21).
Persiapan Terhadap Monyet Sapihan dari Induk Yang Beridentitas
Seperti yang dilakukan terhadap anak monyet tanpa identitas induk, maka anak monyet sapihan dengan induk yang diketahui identitasnya juga dipersiapkan selengkapnya dengan mengacu kepada protokol baku yang berlaku di PT BioFarma dan didokumentasikan sebagai Dokumen Nomor 1 1 5K-Kera-06 (2 1).
Nefrektomi
Pelaksanaan pengambilan ginjal (nefrektorni) dari monyet sepenuhnya mengikuti protokol baku yang berlaku di PT BioFarma dan didokumentasikan sebagai Dokurnen Nomor 1 15M-OPV-04 (22).
Pembuatan Biakan Jaringan Ginjal Monyet
Ginjal monyet dalam botol berisi media perendam ginjal (Trypsin Citrat Diluent, NaHCOs 7%, Erythromycin lo4 pglml, Kanamycin 5x10' pglml) diambil dari dalampass box dengan menggunakan towel yang telah dibasahi dengan larutan hibitane 0,5% dalam alkohol70% kemudian dibawa ke ruang tripsinisasi. Kondisi media perendam ginjal diperiksa secara makroskopis terhadap warna dan kekeruhan. Kualitas dan kuantitas ginjal diperiksa di bawah clean bench. Ginjal dicuci dengan medium pencuci dalam corong tanpa saringan dengan bantuan pinset. Ginjal dimasukkan ke dalam medium perendam.
Ginjal diletakkan di dalam cawan petri kosong. Bagian kapsula ginjal dikelupas dan dipisahkan dari lemak serta jaringan selain bagian kortex menggunakan pinset dan gunting kecil tanpa merusak ginjal. Selanjutnya dilakukan penimbangan
ginjal, kemudian dimasukkan ke dalam medium perendam ginjal. Ginjal diletakkan dalam cawan petri beralas selembar kertas saring yang telah dibasahi medium larutan dispase (Hank's Buffer Saline Solution ,NaHC03 7%, Erythromycin lo4 pglml, Kanamycin 5x10~ pglml, Dispase lo%, Calf serum) (Gambar 33). Medium perfusi (Trypsin Citrat Diluent, NaHC03 7%, Erythromycin lo4 pglrnl, Kanamycin 5x10~ pglrnl, Tripsin 5% dalam Trypsin Diluent) disiapkan dalam syringe lOml dengan jarum nomor 26. Ginjal disuntik melalui arteri renalis sampai darah d k i dalam ginjal keluar semua (Gambar 34).
P e h s i dilakukan secara perlahan sampai kondisi ginjal menjadi agak lunak. Ginjal diletakkan dalam cawan petri diatas 2 lembar kertas saring yang telah dibasahi larutan dispase, kemudian dipotong menjadi ukuran kecil (3mm3 sld 5 mrn3) menggunakan pisau bedah nomor 22. Potongan ginjal dimasukkan ke dalam digestion jlask berisi larutan dispase menggunakan spatula. Sifon dipasang dan disambungkan ke botol Roux (LR) penampung. Magnetic stirrer dalam waterbath dipasang perlahan-lahan pada suhu 36,5OC. Suspensi sel ditampung dalam botol LR yang diletakkan dalam kotak berisi es, dan selanjutnya dihomogenkan. Sebanyak 50 ml larutan dispase dimasukkan ke dalam suspensi sel setiap kali pemutaran, selanjutnya suspensi diputar dan ditampung kembali ke dalam botol LR. Hal
ini
dilakukan sampai semua sel ginjal tersuspensikan (tergantung kondisi ginjal, rata-rata mencapai 5-7 kali pengulangan).Selanjutnya suspensi sel disentrifuse (120 x g, 4OC, 10 menit) dan supernatan yang diperoleh diisap dengan pipet 1 ml yang dihubungkan kepada pengisap udara (suction). Medium pencuci sel yang baru ditambahkan ke dalam suspensin sel dan dihomogenkan. Pemutaran kedua dilakukan dengan kecepatan 240 x g, pada suhu 4°C selama 7 menit. Supernatan diisap kembali dan endapan sel disuspensikan ke
dalam 1100 ml medium pertumbuhan (Dulbecco's Modified Eagle Medium, NaHC03 7%, Erythromycin lo4 pglrnl, Kanamycin 5x10~ pglrnl, Dispase lo%, Calf serum ) dengan menggunakan pipet. Suspensi sel disaring menggunakan mesh
dan corong, dan ditampung ke dalam botol LR yang telah disediakan. Konsentrasi sel dihitung dengan menggunakan karnar hitung improved Neubauer. Sel ditanam
dengan konsentrasi awal0,6 x lo5 sel/ml.
Volume suspensi sel akhir dihitung dengan rumus: Jumlah sel yang hidup per- ml dibagi jundah sel yang ditanam. Suspensi sel tersebut diencerkan dalam medium pertumbuhan sesuai volume perhitungan. Suspensi sel dibagikan ke dalam setiap tray masing-masing 200 rnllcell factory dengan sistem tertutup. Botol berisi
biakan sel diletakkan dalam ruang inkubator bersuhu 36'5°C (Gambar 35). Semua barang kotor habis pakai dikumpulkan dan dikeluarkan melalui pass box ke
ruangan desinfeksi untuk didesinfeksi dengan autoklaf. Semua barang bersih yang tidak terpakai dikembalikan kedalam ruang persiapan melalui pass room. Meja
kerja dibersihkan dengan hibitane 0,2% dalam alkohol 70%. Lantai dibersihkan dengan vacuum cleaner dan dibersihkan menggunakan spons yang dibasahi larutan
NaOCl0,05%.
Prosedur pembuatan biakan jaringan ginjal monyet didokumentasikan sebagai Dokurnen Nomor 1 15M-OPV-04 (22).
Pemeliharaan Biakan Jaringan Ginjal Monyet
Pemeliharaan sel dilakukan secara aseptis di bawah laminarflow vertikal. Sel
yang akan dipasase diobservasi dibawah rnikroskop untuk melihat kondisi sel. Medium pemeliharaan dihangatkan pada suhu kira-kira 37°C. Cairan sel dibuang ke dalam wadah desinfeksi. Larutan tripsin 0'1% sebanyak 10 ml ditambahkan ke dalam botol sel. Botol sel dimiringkan agar seluruh perrnukaan sel terendam oleh 24
larutan tripsin.Larutan dibuang ke dalrn wadah desinfeksi (Gambar 36). 10 ml tripsin ditambahkan kembali. Langkah sebelumnya dilakukan kembali
.
Botol sel ditutup dan diinkubasikan pada suhu kamar hingga sel hampir hampir terlepas dari dinding botol.Medium sebanyak 10 ml ditambahkan dengan cara menyemprotkan ke dinding botol yang ditempeli sel. Dengan cara isap-semprot, sel disuspensikan ke dalam medium sampai diperoleh suspensi homogen. Suspensi sel dimasukkan ke dalam botol sentrifuse; botol bekas sel dibilas dengan & 30 ml medium, dan disatukan dalam botol sentrifuse. Suspensi sel disentrifbgasi dengan kecepatan 240 x g ,selama 10 menit pada suhu kamar. Supernatan hasil sentrifuse dibuang.
Botol SR diisi dengan 210 ml medium pemeliharaan. Endapan hasil sentrifugasi disuspensikan dengan
+
10 ml medium dari botol SR hingga homogen. Suspensi sel dimasukkan ke dalam botol SR tersebut. Botol sentrifuse diisi dengan medium dari botol SR, kemudian bilasan tersebut disatukan ke dalam botol SR. Suspensi sel didistribusikan ke dalam 3 botol SR masing-masing 70 ml dengan pipet 40 ml. Botol SR ditutup dengan prop no.9. Botol SR diberi tanda berupa nama sel, nomor pasase dan tanggal kerja. Botol SR tersebut diinkubasi pada suhu 36°C dalam posisi horizontal.Prosedur pemeliharaan biakan jaringan ginjal didokumentasikan dalam Dokumen Nomor 202K-Psel(23).
Uji Fluorescence Antibody Technic (FAT) indirect terhadap SIV dan SFV
Uji FAT dilakukan terhadap serum yang diperoleh dari darah perifer monyet, menggunakan slide FAT dengan 12 sumur. Serum diencerkan menjadi 1:20 (5 ul serum dengan 95 ul PBS). Sebanyak 8ul serum yang telah diencerkan diteteskan pada tiap sumur slide FAT yang telah diberi sel yang diinfeksi SIV atau SFV. Slide
diinkubasikan pada suhu 37°C selama 45 menit. Pencucian terhadap slide dilakukan dengan PBS sebanyak 3 kali selama 30 menit. FITC-conjugate yang mengandung anti-IgG manusia (anti human IgG) diencerkan menjadi 1 :20 (10 ul FITC-conjugate dengan 190 ul PBS). Conjugate yang telah diencerkan tersebut direaksikan dengan pereaksi sebelumnya dengan cara diteteskan pada slide sebanyak 8ul setiap sumurnya. Slide diinkubasikan kembali pada suhu 37°C selama 45 menit. Selanjutnya slide dicuci dengan PBS sebanyak 3 kali selama 10 menit. Mounting medium (-1:9 gliserin dalam larutan dapar karbonat) diaplikasikan ke permukaan slide sebelum slide ditutup dengan slide cover glass. Pembacaan hasil uji FAT dilakukan dengan observasi menggunakan mikroskop fluoresens. Protokol lengkap mengenai uji FAT didokumentasikan sebagai Dokumen Nomor 202T-FAT (24).
Uji Netralisasi terhadap Antibodi SV40
Kultur sel ginjal monyet vervet (Cercopithecus aethiops) dipersiapkan sebagai indikator pertumbuhan virus. Setelah thawing dari tangki Nitrogen cair, sel dihitung jumlahnya dan dipastikan dalam kondisi baik. Serum monyet yang akan diuji kandungan antibodinya terhadap SV40 diencerkan 1:4 dengan cara melarutkan 0,3 ml serum ke 0,9 ml pelarut (M-199 H, Bovine albumin, NaHC03 dan Erythromycin lo4 pglml, Kanarnycin 5x10~ pglml ). Antiserum SV40 sebagai kontrol positifdiencerkan 1 : 10 dengan cara melarutkan 0,lml antiserum dengan 0,9 ml pelarut.
Setelah diketahui titer awalnya, virus diencerkan untuk mendapatkan titer 100 TCIDSO. Uji netralisasi dilakukan dengan mencampurkan 0,7 ml serum dengan 0,7 ml virus. Hal yang sama juga dilakukan pada kontrol antiserum SV40. Tabung berisi virus yang direaksikan dengan sampel serum maupun serum kontrol positif
diinkubasikan dalam waterbath dengan suhu 36 "C selama 2 jam. Sel dicuci menggunakan larutan 1 ml HBSS, NAHC03 7% dan antibiotika per-tabung sebanyak 2 kali. Sebanyak 1 ml medium pemelihara ditambahkan pada setiap tabung. Inokulum (0,2 ml) ditambahkan ke dalam setiap tabung dan setiap pengenceran diaplikasikan sebanyak 5 tabung. Tabung berisi inokulum diinkubasikan selarna 14 hari dalam inkubator 36°C dengan observasi yang dilakukan setiap hari.
Prosedur lengkap uji netralisasi didokumentasikan dalam Dokumen Nomor 202T-SVT (25).
KO-kultifasi Limfosit pada Biakan Jaringan Ginjal Monyet
Darah perifer monyet diambil sebanyak 3 ml dan dimasukkan ke dalam tabung yang berisi EDTA dan dicampur dengan baik. Tabung berisi darah disentrifus dengan kecepatan 261 x g sampai sel darah mengendap. Bagian cairan plasma dan sedikit permukaan endapan sel diambil dan dimasukkan ke dalam tabung steril yang lain (Gambar 37).
Lymphocyte Separation Medium (LSM) dihomogenkan dengan baik sebelum digunakan. Sebanyak 3 ml LSM dimasukkan ke dalam tabung sentrifus 15 ml. Plasma bersama sel darah di-layer diatas LSM dengan hati-hati tanpa membuat keduanya tercampur (Gambar 38). Tabung tersebut disentrifus pada suhu ruang dengan kecepatan 261
x
g selama 20 menit (Gambar 39). Setelah sentrifugasi, bagian atas yang merupakan plasma, setinggi 2-3 mm di atas lapisan limfosit dibuang (Gambar 40). Lapisan limfosit yang berada diantara bagian plasma dan larutan LSM diisap menggunakan pipet kemudian dipindah ke dalam tabung sentrifus yang lain. Sebanyak 5 ml PBS ditambahkan ke dalam tabung tersebutkemudian disentrihs dengan kecepatan 261 x g selama 10 menit. Limfosit dipisahkan kembali terhadap sisa LSM (Gambar 41).
Limfosit diko-kultifasi pada biakan jaringan sehingga menutupi seluruh permukaan. Lakukan rocking setiap 15 menit selama 1 jam (Gambar 42). Medium
pemelihara ditambahkan ke dalam flask yang telah diko-kultifasi dengan limfosit
(Gambar 43). Flask-flask tersebut diletakkan dalam inkubator. Biakan jaringan
ginjal monyet diobservasi terhadap efek sitopatik menggunakan mikroskop setiap 24 jam (Gambar 44). -
Prosedur lengkap ko-kultivasi mengikuti prosedur isolasi limfosit secara in vitro dari CAPPEL ICN Biomedical, Inc.
Pembuatan Preparat Histopatologi
Ginjal direndam dalam larutan forrnalin 10% selama 5-7 hari. Ginjal dipotong sehingga daerah korteks terlihat dengan ketebalan 2-3 mm Potongan ginjal difiksasi dalam larutan formalin 10% selama 5 hari. Potongan ginjal dideformaldehida dan dehidrasi menggunakan mesin otomatis. Jaringan difiksasi dalam parafin cair yang kemudian dibekukan.
Jaringan diwarnai dengan Hematoxylin-Eosin (HE) dan mounting solution
(rninyak "Eukitt") diaplikasikan sebelum ditutup dengan cover glass. Sampel
histologi diperiksa di bawah mikroskop untuk observasi terhadap kemungkinan perubahan sel ginjal.
