ISBN

(1)

ISBN 978-602-95471-0-8

(2)

Seminar Nasional Biologi XX dan Kongres PBI XIV UIN Maliki Malang 24-25 Juli 2009 269 ISOLASI DAN DETERMINASI BAKTERI AZOTOBACTER DARI RHIZOSFER TIGA TUMBUHAN BAWAH DI LAHAN PERTANAMAN JATI (Tectona grandis

L.f)

Handojo Hadi Nurjanto1, Arom Figyantika1, Tifa Kharisma2

1)

Jurusan Budidaya Hutan, Fakultas Kehutanan, UGM, Telp: 0274-512102 Fax 0274 550541 e-mail: figyan_chayank@yahoo.com

2)

Alumnus Fakultas Kehutanan UGM

ABSTRACT

Azotobacter is a non symbiotic Nitrogen fixing bacteria that usually found in plant rhizosphere, including shrubs at teak plantation area. Azotobacter has potency as biofertilizer to increase teak growth. The aims of this research were to estimate abundance of Azotobacter, to obtain isolate, and determinate it.

The Abundance of Azotobacter in rhizosphere of Crotalaria mucronata, Imperata cylindrica, and Chromolaena odorata were assessed using Plate Count method. Azotobacter isolation was done using streak plate method in Jensen medium. Isolate determination were done to cell and colony morphology, biochemistry characteristic, growth rate in medium Jensen liquid, and concentration N medium (Kjehdahl method).

The highest abundance of Azotobacter was in rhizosphere of C. odorata (4,7 x 105) and the lowest in rhizosphere of I. cylindrica. (3,3 x 104 cell). Isolation of Azotobacter from rhizosphere of C. odorata obtained 3 isolates, C. mucronata 4 isolates, and I. cylindrica 3 isolates. Azotobacter formed coccus shaped cell, that turn short bacil in two week, gram variable, the colony was convex, slippery, moist, viscid, aerobic, can reduce nitrate, catalase positive, and produced ammonium. Isolate A2.5 (from rhizosphere I. cylindrica) had the highest growth rate (117,32x107 cell/ml in 14 days) and made the highest concentration N medium (3,5%).

Keywords : N-fixer non symbiotic, Azotobacter, shrub, teak

PENDAHULUAN

Unsur hara N merupakan unsur hara utama yang membatasi pertumbuhan tanaman karena unsur hara tersebut merupakan unsur hara makro yang dibutuhkan tanaman dalam jumlah terbesar. Walaupun N di alam tersedia berlimpah dalam bentuk gas N2, tetapi ketersediaan unsur hara N di tanah relatif rendah. Hal ini karena tanaman hanya dapat menyerap unsur hara N dalam bentuk NH4

+

(amonium) dan NO3

(nitrat). Penelitian mengenai pemupukan nitrogen menggunakan bahan kimia seperti ZA dan Urea atau pupuk kandang telah banyak dilakukan antara lain oleh Kusumawati (2003), Nugrahanto (1999) dan Widiyanti (2004). Penggunaan pupuk kandang memiliki kelemahan diantaranya memerlukan jumlah yang besar sering terkendala oleh ketersediaan dan pengangkutan yang besar pula, sehingga berimplikasi pada biaya produksi. (Isroi, 2008). Penggunaan pupuk kimia disamping mahal dapat menyebabkan penurunan tingkat kesuburan tanah. (Sutejo dan Mulyani, 1990).

Peran Mikroorganisme penambat N yang memiliki potensi untuk dikembangkan di Jati adalah mikroorganisme non-simbiotik misalnya Azotobacter, karena jati tidak dapat membentuk simbiosis dengan mikroorganisme penambat N simbiotik contohnya

Rhizobium. Azotobacter adalah bakteri gram negatif, bersifat aerob, bentuk selnya

berkisar antara oval sampai batang pendek, biasanya tumbuh sebagai diplococus dan termasuk organisme heterotrof, dimana organisme tersebut memperoleh bahan makanan dari bahan organik tanah (Gordon and Wheeler, 1983) sehingga banyak dijumpai pada

(3)

270 Prosiding Keaneka ragaman Hayati

rhizosfer tumbuhan. Di Indonesia Azotobacter sudah diisolasi di rhizosfer ketimun, jagung, kacang panjang, takokak dan ketela pohon (Wedhastri, 2002).

Kemampuan bakteri Azotobacter dalam menambat N bervariasi + 2-15 mg nitrogen/gram sumber karbon yang digunakan (Rao, 1982). Sediaan bakteri Azotobacter yang diberi nama Azotobacterin yang diproduksi dan digunakan di Rusia dan negara-negara Eropa Timur dapat meningkatkan hasil panen tanaman budidaya seperti gandum,

barley, jagung, bit, wortel, kubis dan kentang sebesar 12% dibandingkan dengan tanaman

kontrol (Rao, 1979). Di India, penggunaan Azotobacter dapat memberikan hasil yang bervariasi mulai dari tidak ada pengaruh secara signifikan sampai meningkatkan pertumbuhan secara signifikan (Rao, 1979).

Di sekitar tegakan jati banyak terdapat tumbuhan bawah antara lain, orok-orok, kerinyu dan alang-alang. Rhizosfer tumbuhan bawah merupakan niche yang unik untuk perkembangan Azotobacter. Sehingga perlu diketahui jenis dan kelimpahan Azotobacter dari rhizosfer tumbuhan tersebut, serta potensinya dalam mendukung pertumbuhan tanaman jati. Penelitian ini bertujuan mengetahui kelimpahan, memperoleh isolat, dan mendeterminasi bakteri Azotobacter dari rhizosfer tiga tumbuhan bawah di lahan pertanaman jati.

BAHAN DAN METODE PENELITIAN Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilakukan di Petak 13, Wanagama I, Gunung Kidul, Yogyakarta dan Laboratorium Manipulasi Lingkungan, Fakultas Kehutanan UGM pada bulan Juni 2006 – Juli 2008.

Prosedur Penelitian

Pegambilan Sampel Vegetasi, Pembuatan Herbarium, dan Pengambilan Sampel Rhizosfer

Tumbuhan bawah yang berada pada lahan pertanaman jati yang dapat beradaptasi dengan baik diseleksi dan dipilih tumbuhan yang sehat. Dibuat herbarium pada tiga tumbuhan bawah yang telah diseleksi. Tumbuhan bawah yang telah dipilih antara lain Alang-alang, Orok-orok dan Kerinyu digali perakarannya dan diambil tanah di daerah rhizosfer.

Pengujian kelimpahan, Isolasi, dan Seleksi bakteri Azotobacter

Pengujian kelimpahan bakteri Azotobacter menggunakan metode Plate Count. Isolasi dilakukan dengan streak plate method pada medium Jensen. Seleksi menggunakan 2 pendekatan, yaitu kecepatan tumbuh dalam medium Jensen cair dan konsentrasi N pada medium (metode Kjehldahl)

Identifikasi dan Determinasi

Identifikasi bakteri dilakukan untuk memastikan bahwa koloni-koloni

tersebut adalah Azotobacter, maka dilakukan pengujian sifat-sifat biokimia (reduksi hidrogen peroksida, reduksi nitrat dan amonifikasi), morfologi individual secara mikroskopik (pengecatan sederhana, negatif dan gram) dan pertumbuhannya pada berbagai macam medium (medium agar tegak, agar miring, cair dan medium agar secara taburan).

HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN

Nitrogen merupakan unsur yang sangat dibutuhkan tanaman. Fungsi nitrogen bagi tanaman antara lain adalah untuk pertumbuhan bagian vegetatif tanaman, seperti

(4)

Seminar Nasional Biologi XX dan Kongres PBI XIV UIN Maliki Malang 24-25 Juli 2009 271

daun, batang dan akar, berperan penting dalam pembentukan hijau daun yang berguna dalam proses fotosintesis, membentuk protein, lemak dan berbagai persenyawaan organik, meningkatkan mutu tanaman penghasil daun-daunan serta meningkatkan perkembangbiakan mikro-organisme di dalam tanah (Anonim, 2007)

Untuk meningkatkan ketersediaan unsur hara N bagi pertumbuhan tanaman jati, dapat dimanfaatkan bakteri Azotobacter yang dapat hidup bebas di dalam tanah maupun hidup di rhizosfer tanaman. Pada penelitian ini dikaji bakteri Azotobacter yang hidup di rhizosfer tumbuhan bawah di lahan pertanaman jati di Wanagama.

Identifikasi Vegetasi Tumbuhan Bawah

Pada lahan pertanaman Jati (Tectona grandis L.f) di Wanagama petak 13, ditemukan tiga tumbuhan bawah yang dapat beradaptasi dengan baik yaitu: Orok-orok (Crotalaria mucronata Desv.), alang-alang (Imperata cylindrica (L.) Beauv. Var.) dan kerinyu (Chromolaena odorata (L.) King & H.E. Robins.)

Kelimpahan Bakteri Penambat N non Simbiotik

Hasil perhitungan menggunakan metode plate count menunjukkan bahwa tanah pada lahan pertanaman jati telah mengandung bakteri Azotobacter dengan jumlah yang bervariasi dari 3,3x104 – 47x104 (Tabel 1). Populasi Azotobacter ini mempunyai kisaran yang dinyatakan oleh Rao (1982) untuk tanah-tanah di India, yaitu jumlahnya tidak lebih dari 104 sampai 105 per gram tanah. Rhizosfer tanaman yang memiliki kelimpahan bakteri

Azotobacter terbanyak adalah kerinyu. Dalam Wedhastri (2002) keberadaan Azotobacter

tergantung dari vegetasi serta kondisi tanahnya. Dalam Richards (1974), kelimpahan mikroorganisme di rhizosfer dapat diasumsikan karena substansi yang berasal dari akar, misalnya eksudat akar. Tingginya eksudat akar ditentukan faktor tanaman (jenis dan umur) dan kondisi tumbuhnya (jenis tanah, sinar matahari dan suhu) (Campbell, 1985 dan Richards, 1974). Jenis tanaman dapat mempengaruhi populasi mikroorganisme karena menghasilkan jenis dan kuantitas eksudat yang berbeda (Richards, 1974) hal ini dimungkinkan karena rhizosfer tumbuhan kerinyu memiliki eksudat akar dengan bahan organik yang tinggi.

Isolasi Bakteri Penambat N non Simbiotik

Pada isolasi tahap pertama Azotobacter, diperoleh 33 isolat bakteri yang memiliki koloni morfologi berbeda secara nyata. Tetapi setelah isolasi tahap kedua hanya diperoleh 10 isolat (Tabel 2). Sisanya tidak tumbuh atau tumbuh sangat lambat (diameter kurang dari 0,5 mm setelah diinkubasi selama 14 hari) sehingga tidak digunakan lebih lanjut.

Seleksi Bakteri Penambat N non Simbiotik

Hasil seleksi isolat bakteri Azotobacter menunjukkan bahwa isolat A 2.5 mempunyai potensi yang tertinggi. Isolat tersebut mampu menghasilkan jumlah sel bakteri tertinggi yaitu 117,32 x 107 sel/ ml dan konsentrasi N tertinggi yaitu 3,5 % (Tabel A3).

Identifikasi dan Determinasi Bakteri Penambat N non Simbiotik

Hanya 7 isolat yang dapat diidentifikasi dan determinasi lebih lanjut, yaitu isolat K1.1, A2.4, A2.5, O1.1, O1.2, O2.1 dan O2.6.

a) Morfologi Sel Individual

Bentuk sel isolat bakteri Azotobacter dapat berubah dari cocus menjadi batang pendek dengan berjalannya waktu. Pada hasil pengamatan dengan pengecatan sederhana

(5)

didapatkan bentuk sel bakteri adalah cocus berwarna merah, setelah berumur dua minggu A 2.4, A 2.5, O 1.2, dan O 2.6 berbentuk batang pendek. Pada pengamatan menggunakan pengecatan negatif dihasilkan bentuk bulat atau cocus sampai pengamatan umur 12 hari, sedangkan pada umur 15 hari bentuk bakteri mulai ada yang berubah menjadi batang pendek pada isolat A 2.4, A 2.5, O 1.2, dan O 2.6. Isolat Azotobacter bersifat gram negatif, tetapi setelah berumur dua minggu atau lebih akan berubah menjadi gram positif. Pada umur 3 sampai 12 hari dengan pegecatan gram sel bakteri berwarna merah (gram negatif), setelah berumur lebih dari 2 minggu sel bakteri akan berwarna violet (gram positif). Hal ini sesuai dengan teori yang ada bahwa Azotobacter dapat bersifat gram negatif atau gram variabel (Gray & Willmiams, 1971; Buchanan & Gibbons, 1974 dan Thompson & Sherman 1979 dalam Wedhastri, 2002).

b) Morfologi Koloni Bakteri

Pada medium Jensen agar tegak yang diinokulasi secara tusukan, semua isolat bakteri pada umur tiga hari membentuk pertumbuhan berbentuk beaded. Setelah berumur 9 hingga 12 hari pertumbuhannya berkembang menjadi beaded, echinulate, villous sampai bentuk rhizoid tergantung isolatnya.

Pertumbuhan koloni pada medium Jensen agar miring menunjukkan pertumbuhan yang bervariasi. Isolat A 2.4 dan A 2.5 membentuk pertumbuhan tipis sekali dengan elevasi flat. Pada umur 12 hari berkembang dari tipis sampai sedang. Semua isolat K dan O pertumbuhannya sedang sampai banyak. Bentuk goresan pada permukaan agar miring sebagian besar hampir sama yaitu beaded sampai echinulate. Elevasi koloni didominasi bentuk convex, topografinya licin, mengkilat dengan warna bening dan konsistensinya

slimy.

Pada medium Jensen cair, pertumbuhan bakteri ditandai dengan tingkat kekeruhan pada media cair. Pertumbuhan hanya terlihat setelah pengamatan ke-2 yaitu pada umur 6 hari. Sampai akhir pengamatan kekeruhan medium hanya terjadi pada isolat K 1.1, A 2.4, O 1.2, dan O 2.6.

Pada medium Jensen padat secara taburan, koloni bakteri sebagian besar berada pada permukaan dengan diameter 1-7 mm dan sebagian berada dalam medium. Bentuk koloni circular dengan permukaan licin. Elevasi koloni didominasi bentuk convex, low

convex hanya pada isolat A2.4 dan A2.5. Bentuk tepi koloni entire dan struktur dalamnya transparent sampai finely granular. Hasil pengamatan sesuai dengan karakteristik dari

genus Azotobacter yaitu slimy, mengkilat, smooth, whitish, convex, diameter koloni berkisar antara 2-10 mm (Aquilanti dkk, 2003).

c) Pengujian Sifat Biokimia Bakteri

Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa isolat bakteri yang diteliti mempunyai sifat aerob, dapat mereduksi nitrat, katalase positif, dan dapat menghasilkan amonium. Hal yang sama juga terdapat dalam penelitian Wedhastri (2002) yaitu dapat bersifat katalase positif, dapat mereduksi nitrat dan menggunakan pepton sebagai sumber nitrogen.

Aquilanti dkk (2003), menyatakan bahwa Azotobacter hidup pada pH 6,5-9,0 dan jarang ditemui pada pH dibawah 6 (Jensen, 1965 dalam Aquilanti dkk, 2003). Hal yang sama dikemukakan oleh Sumadi (2008) bahwa Azotobacter hidup pada kisaran pH netral (6 sampai 7), dibawah pH 6 kemampuannya sangat rendah. Dalam Supriyo 2004, pH di Wanagama berkisar 6-8. Hal ini berarti lahan di Wanagama secara umum merupakan tempat yang baik untuk perkembangan Azotobacter.

(6)

Seminar Nasional Biologi XX dan Kongres PBI XIV UIN Maliki Malang 24-25 Juli 2009 273 KESIMPULAN

1. Bakteri Azotobacter pada rhizosfer kerinyu lebih tinggi daripada rhizosfer alang-alang dan orok-orok.

2. Hasil isolasi bakteri Azotobacter dari kerinyu diperoleh 3 isolat, orok-orok diperoleh 4 isolat dan dari alang-alang diperoleh 3 isolat. Hasil seleksi isolat Azotobacter menunjukkan bahwa isolat A2.5 (dari alang-alang) memiliki jumlah sel dan konsentrasi N yang terbesar, diikuti oleh O2.6 (dari orok-orok) dan K1.1 (dari kerinyu).

3. Isolat-isolat Azotobacter memiliki sifat bentuk sel cocus tetapi pada umur dua minggu akan berubah menjadi batang pendek, bersifat gram variabel (bersifat gram negatif kemudian setelah dua minggu akan berubah menjadi gram positif), bentuk koloni convex, licin, moist, viscid. Bersifat aerob, dapat menggunakan nitrat sebagai akseptor elektron (dapat mereduksi nitrat), katalase positif, menghasilkan amonium.

DAFTAR PUSTAKA

Anonim.2007.Azotobacter.http:/www.microbiologybytes.com/index.html/2007. Tanggal diakses 30 April 2008.

Aquilanti, L., F. Favilli. dan F. Clementi. 2004. Comparison of Different Strategies for

Isolation and Preliminary Identification of Azotobacter from Soil Samples. Soil

Biology & Biochemistry. 36: 1475-1483.

Campbell, R. 1985. Plant Microbiology. Edward Arnold. London.

Gordon, J.C. and C.T. Wheeler. 1983. Biological Nitrogen Fixation in Forest

Ecosystems: Foundations and Applications. Martinus Nijhoff/Dr W.Junk

Publishers, The Hague/Boston/London. ISBN 90-247-2849-5. Printed in The Netherland.

Isroi. 2008. Bioteknologi Mikroba untuk Pertanian Organik.

http://isroi.wordpress.com/2008/02/25/bioteknologi-mikroba-untuk-pertanian-organik/. Tanggal diakses 17 April 2008.

Kusumawati. 2003. Respon Pertumbuhan Semai Tiga Klon Jati Hasil Kultur Jaringan

terhadap Perlakuan Variasi Dosis Pupuk NPK dan Ukuran Kantong Plastik.

Skripsi S1 Fakultas Kehutanan. Universitas Gadjah Mada. Yogyakarta.

Nugrahanto. 1999. Pengaruh Penggunaan Pupuk NPK, Urea dan ZA terhadap

Pertumbuhan Stek Pucuk Jati (Tectona grandis L.f). Skripsi S1 Fakultas

Kehutanan. Universitas Gadjah Mada. Yogyakarta.

Rao, N.S. 1979. Recent Advences in Biological Nitrogen Fixation. Oxford & IBH Publishing Co. New Delhi. Bombay. Calcutta.

Rao, N.S. 1982. Biofertilizer in Agriculture. Oxford & IBH Publishing Co. New Delhi. Bombay. Calcutta.

Richards, B.N. 1974. Introduction to the Soil Ecosystem. Longman Group Limited. London.

Sumadi.2008.AsimilasiNitrogen.http://209.85.175.104/search?q=cache:WIwJhNYFCvsJ: elearning.unej.ac.id/courses/MAB1504/document/Materi_Kuliah_Ir._Sumadi_ MS/Materi_Sumadi/Physiologi_6_%252B_7(bab_IX)_Asimilasi_Nitrogen.doc %3FcidReq%3DMAB1504+karakteristik+azotobacter&hl=id&ct=clnk&cd=7& gl=id. Tanggal diakses 17 April 2008.

Sutejo, K.A.G, dan Mulyani, M. 1990. Pupuk dan cara pemupukan. Rineka Cipta. Jakarta.

Supriyo, H., A. Bale dan C. Agus. 2006. Diktat Kesuburan Tanah. Laboratorium Ilmu Tanah Hutan Jurusan Budidaya Hutan Fakultas Kehutanan UGM. Yogyakarta. Wedhastri, S. 2002. Isolasi dan Seleksi Azotobacter spp. Penghasil Faktor Tumbuh dan

(7)

Tanah dan Lingkungan Vol 3 (1) pp 45-51. Yogyakarta.

Widiyanti. 2004. Pengaruh Olah tanah dan Pemberian Pupuk Kandang terhadap

Pertumbuhan Tanaman Jati (Tectona grandis L.f) pada Tanah Bekas Penggembalaan di KPH Ngawi. Skripsi S1 Fakultas Kehutanan. Universitas

Gadjah Mada. Yogyakarta.

LAMPIRAN

Tabel 1. Kelimpahan bakteri penambat N non simbiotik pada rhizosfer 3 tumbuhan bawah pada lahan pertanaman jati di Wanagama

No Sampel Azotobacter ( x 104 ) 1 Rhizosfer Alang-alang 3,3 2 Rhizosfer Orok-orok 13,7 3 Rhizosfer Kerinyu 47,0 Rerata 21,3

(8)

Seminar Nasional Biologi XX dan Kongres PBI XIV UIN Maliki Malang 24-25 Juli 2009 275 No Sumber Isolat Azotobacter Tahap I Tahap II 1 Kerinyu K1.1, K1.2, K1.3, K1.4, K1.5, K2.1, K2.2 K1.1, K1.2, K1.5 2 Alang-alang A1.1, A1.2, A1.3, A1.4, A1.5, A1.6, A1.7, A1.8, A1.9, A2.1, A2.2, A2.3, A2.4, A2.5, A2.6, A2.7 A2.2, A2.4, A2.5 3 Orok-orok O1.1, O1.2, O1.3, O2.1, O2.2, O2.3, O2.4, O2.5, O2.6, O2.7 O1.1, O1.2, O2.1, O2.6 No. Isolat Jumlah sel bakteri (107) Konsentrasi N (%) 1 O 1.1 41,32 0 (tdk terdeteksi) 2 O 1.2 24,00 1,75 3 O 2.1 72,00 1,75 4 O 2.6 113,32 3,5 5 A 2.2 58,64 1,75 6 A 2.4 69,32 1,75 7 A 2.5 117,32 3,5 8 K 1.1 88,00 3,5 9 K 1.2 68,00 3,5 10 K 1.5 29,32 3,5 11 Kontrol - 0 (tdk terdeteksi)

Tabel 3. Jumlah sel dan konsentrasi N pada medium dari Isolat bakteri Azotobacter dari rhizosfer tumbuhan orok-orok, alang-alang, dan kerinyu yang tumbuh pada pahan pertanaman jati di Wanagama, Yogyakarta

Tabel 2. Hasil isolasi bakteri Azotobater dari rhizosfer 3 tumbuhan bawah pada lahan pertanaman jati di Wanagama.