EFEK INTERVENSI TAKOKAK (Solanum torvum Swartz)
TERHADAP KADAR SUPEROKSIDA DISMUTASE ERITROSIT DAN 8-ISOPROSTAN SERUM PADA WANITA DEWASA GEMUK
PUTRI NOVITASARI
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Efek Intervensi Takokak (Solanum torvum Swartz) terhadap Kadar Superoksida Dismutase Eritrosit dan 8-Isoprostan Serum pada Wanita Dewasa Gemuk adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.
Bogor, September 2016
RINGKASAN
PUTRI NOVITASARI. Efek Intervensi Takokak (Solanum torvum Swartz) terhadap Kadar Superoksida Dismutase Eritrosit dan 8-Isoprostan Serum pada Wanita Dewasa Gemuk. Dibimbing oleh SRI ANNA MARLIYATI dan EVY DAMAYANTHI.
Individu gemuk diketahui memiliki kondisi stres oksidatif lebih tinggi dibandingkan individu normal. Stres oksidatif pada individu gemuk dapat dikurangi dengan meningkatkan sistem pertahanan antioksidan melalui modifikasi diet. Salah satunya adalah dengan meningkatkan konsumsi pangan tinggi kadar polifenol. Polifenol cukup penting dibahas karena ketersediaannya luas di tanaman dan cukup melimpah dalam diet manusia, juga aktivitas antioksidannya yang cukup besar. Aktivitas antioksidan senyawa polifenol dapat melindungi sel terhadap kerusakan yang disebabkan oleh senyawa oksigen reaktif. Salah satu tanaman yang diketahui secara alami mengandung senyawa polifenol adalah takokak. Takokak merupakan salah satu sayur jenis terong yang memiliki kandungan polifenol dan aktivitas antioksidan yang tinggi. Sudah ada beberapa penelitian yang mengkaji total fenol dan aktivitas antioksidan dari buah takokak, termasuk efeknya secara in vitro maupun terhadap hewan coba, namun, belum ada studi klinis dilaporkan khususnya terhadap individu gemuk yang dikatakan memiliki kondisi stres oksidatif yang lebih besar.
Tujuan penelitian ini adalah untuk mengkaji pengaruh polifenol dalam buah takokak terhadap kadar antioksidan enzim (superoksida dismutase [SOD] eritrosit) dan stres oksidatif (8-isoprostan serum) pada wanita dewasa gemuk. Penelitian ini merupakan kuasi eksperimental dengan desain cross-over, sebanyak
8 subjek wanita gemuk di Desa Benteng−Ciampea, Kabupaten Bogor, Jawa Barat
secara acak dibagi rata pada kelompok kontrol (n=4) dan kelompok takokak (n=4) selama 2 x 1 minggu periode intervensi dengan 1 minggu periode wash-out di antara periode intervensi. Kelompok takokak mengonsumsi home diet dan ±160 gram takokak masak (sebagai lauk atau camilan), sedangkan kelompok kontrol hanya mengonsumsi home diet. Food record dikumpulkan 2x24 jam setiap minggu. Sampel darah diambil setiap pagi pada hari ke-1, ke-8, ke-15, dan ke-22 intervensi untuk dianalisis kadar superoksida dismutase (SOD) eritrosit dan serum 8-isoprostan.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa kadar air tertinggi terdapat pada takokak masak santan (80.07 gram). Kadar protein tertinggi terdapat pada takokak masak tanpa santan (2.91 gram). Sedangkan kadar lemak (3.67 gram), karbohidrat (20.48 gram), dan abu (2.00 gram) tertinggi pada takokak mentah. Kadar total fenol paling tinggi yaitu pada jenis takokak masak tanpa santan (355.73 mg gallic acid equivalent (GAE)/ 100 gram) dan paling rendah pada jenis takokak mentah (59.47 mg GAE/ 100 gram). aktivitas antioksidan paling tinggi terdapat pada jenis takokak masak tanpa santan (44.48 mg ascorbic acid equivalent antioxidant capacity (AEAC)/ 100 gram) dan paling rendah pada jenis takokak mentah (33.45 mg AEAC/ 100 gram).
memiliki pendapatan per kapita kurang dari rata-rata (Rp. 260417,-). Subjek kurang mengonsumsi sayuran dan buah-buahan yang diketahui tinggi polifenol (sekitar seminggu 1x) dalam kesehariannya. Subjek tidak perlu berusaha keras untuk menghindari makanan atau pangan yang tinggi polifenol yang ada di dalam daftar yang dibuat oleh peneliti.
Peningkatan kadar SOD eritrosit setelah intervensi pada kelompok takokak tidak berbeda signifikan dibandingkan dengan kelompok kontrol (P=0.607). Penurunan kadar 8-isoprostan serum setelah intervensi pada kelompok takokak berbeda signifikan dengan kelompok kontrol yang mengalami peningkatan (P<0.05). Hasil ini memperlihatkan bahwa konsumsi buah takokak masak sehari-hari dapat memperbaiki kondisi stres oksidatif.
SUMMARY
PUTRI NOVITASARI. Effect of Turkey Berry (Solanum torvum Swartz) Intervention on Level of Erythrocyte Superoxide Dismutase and Serum 8-Isoprostane in Obese Adult Women. Supervised by SRI ANNA MARLIYATI and EVY DAMAYANTHI.
Overweight and obese individuals are known to have higher oxidative stress condition compared to normal individuals. Oxidative stress in overweight and obese individuals can be reduced by increasing the antioxidant defense system through dietary modification. One way is increasing the consumption of polyphenols rich foods. Polyphenols are important to be discussed because of the widespread availability in plants and quite abundant in the human diet, as well as its antioxidant activity. The antioxidant activity of polyphenols may protect cells against oxidative damage caused by reactive oxygen species. One of the plants that are known naturally contains polyphenols is turkey berry. Turkey berry is eggplant type vegetable that contain high polyphenols level and antioxidant activity. There have been several studies that examine total phenol and antioxidant activity of turkey berry fruits, including its in vitro and on animals effect, however, there are no clinical studies were reported particularly on overweight and obese individuals whom have higher oxidative stress condition.
This study was aimed at assessing the effect of polyphenols in turkey berry fruits on level of enzyme antioxidant (erythrocyte superoxide dismutation [SOD]) and oxidative stress (serum 8-isoprostane) in overweight & obese adult women. The study was quasi experimental trial in cross-over design. As number as 8 obese
women subjects in Benteng Village−Ciampea, Bogor District, West Java were randomly assigned to a control group (n=4), and turkey berry group (n=4) for 2 x 1 wk of intervention periods with a 1-wk wash-out periode between intervention periods. Turkey berry group consumed home diet and ±160 grams of cooked turkey berry (as a side dish or snack) while the control group only consumed home diet. Food records were collected twice each week. Blood samples were obtained in the morning at day(s)- 1, 8, 15, and 22 of interventions and analyzed for the level of erythrocyte SOD and serum 8-isoprostane.
The results showed that the highest water content was found in cooked turkey berry with coconut milk (80.07 grams). The highest protein content was found in cooked turkey berry without coconut milk (2.91 grams). While the highest content of fat (3.67 grams), carbohydrate (20.48 grams), and ash (2.00 grams) were found in raw turkey berry. The highest total phenol content was found in cooked turkey berry without coconut milk (355.73 mg gallic acid equivalent (GAE)/ 100 grams) and the lowest was found in raw turkey berry (59.47 mg GAE/ 100 grams). The highest antioxidant activity was found in cooked turkey berry without coconut milk (44.48 mg ascorbic acid equivalent antioxidant capacity (AEAC)/ 100 grams) and the lowest was found in raw turkey berry (33.45 mg AEAC/ 100 grams).
week) in their daily life. Subjects did not have to try hard to avoid foods that high in polyphenols content in the list prepared by the researcher.
Increased levels of erythrocyte SOD after intervention on turkey berry groups did not significantly different compared with the control group (P=0.607). Decreased level of serum 8-isoprostane after intervention on turkey berry group significantly different to the increased level on control group (P<0.05). It seems that daily consumption of cooked turkey berry fruits can improve oxidative stress condition.
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains
pada
Program Studi Ilmu Gizi
EFEK INTERVENSI TAKOKAK (Solanum torvum Swartz)
TERHADAP KADAR SUPEROKSIDA DISMUTASE ERITROSIT DAN 8-ISOPROSTAN SERUM PADA WANITA DEWASA GEMUK
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR 2016
Judul Tesis : Efek Intervensi Takokak (Solanum torvum Swartz) terhadap Kadar Superoksida Dismutase Eritrosit dan 8-Isoprostan Serum pada Wanita Dewasa Gemuk
Nama : Putri Novitasari NIM : I151140361
Disetujui oleh Komisi Pembimbing
Dr Ir Sri Anna Marliyati, MSi Ketua
Prof Dr Ir Evy Damayanthi, MS Anggota
Diketahui oleh
Ketua Program Studi Magister Ilmu Gizi
Prof Dr Ir Dodik Briawan, MCN
Dekan Sekolah Pascasarjana
Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tesis yang
berjudul ―Efek Intervensi Takokak (Solanum torvum Swartz) terhadap Kadar Superoksida Dismutase Eritrosit dan 8-Isoprostan Serum pada Wanita Dewasa
Gemuk‖ ini disusun sebagai salah satu syarat untuk mendapatkan gelar Magister Sains pada Program Studi Ilmu Gizi, Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Penulis mengucapkan terimakasih yang sebesar-besarnya kepada:
1. Dr Ir Sri Anna Marliyati, MSi selaku ketua komisi pembimbing dan Prof Dr Ir Evy Damayanthi, MS selaku anggota komisi pembimbing yang telah banyak memberikan bimbingan, saran, dan kritik yang membangun serta motivasi sehingga penulis dapat menyelesaikan tesis ini dengan baik.
2. Prof Dr Ir Dodik Briawan, MCN selaku ketua program studi yang senantiasa memberikan masukan dan bimbingan hingga terselesaikannya tesis ini. 3. Prof Dr Ir Ikeu Tanziha MS yang sudah memoderatori ujian tesis saya dan
memberikan saran yang membangun.
4. Dr Ir Diah Mulyawati Utari, MKes selaku dosen penguji. Terima kasih atas waktu yang diluangkan dan masukannya yang sangat bermanfaat demi kesempurnaan tesis ini.
5. Mbak Nurul, Mbak Nunung, dan Mbak Malie dari sekret pasca GM yang selalu membantu kelancaran administrasi selama proses penyelesaian tesis ini. 6. Mamah Kokom Nurmala, Bapak Sunarto, dan Suami Sandy Riswanto yang
senantiasa selalu mendukung dan mendoakan kelancaran tesis saya. Tidak lupa pada anak Rasyid Omar Zain yang selalu menjadi pelipur lara. Semuanya merupakan motivasi terbesar agar saya dapat menyelesaikan tesis ini dengan baik dan tepat waktu.
4. Ibu-ibu yang bersedia berpartisipasi pada penelitian ini; Bapak Denny, dr. Akhmad Saikhu, Bidan Ati Cibanteng dan perawat yang membantu dari Puskesmas Ciampea; Ibu Yati dan Ibu Lupi Benteng yang sangat membantu kelancaran saat turun lapang; dan Bapak Agus dari Kantor Desa Benteng yang membantu kelancaran mulainya penelitian lapang.
5. Teman-teman enumerator Icha, Lendy, dan Amida; Nisa Uun yang sangat baik membantu turun lapang; seluruh teman kelas GMS 2014 atas persahabatan, motivasi, dan dukungan yang diberikan selama penulis melangsungkan studi dan penelitian di sekolah Pascasarjana IPB, khususnya Wulan Tami Masdeni Ajan Uci & Yuri.
7. Seluruh pihak yang telah membantu, baik secara langsung maupun tidak langsung yang tidak bisa penulis sebutkan satu persatu.
Penulis berharap karya ilmiah ini dapat bermanfaat untuk pembaca serta kritik dan saran yang membangun sangat penulis harapkan.
Bogor, September 2016
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL ix
DAFTAR GAMBAR ix
DAFTAR LAMPIRAN ix
PENDAHULUAN 1
Latar Belakang 1
Perumusan Masalah 2
Tujuan Penelitian 3
Manfaat Penelitian 4
Hipotesis 4
TINJAUAN PUSTAKA 4 Konsep Radikal Bebas 4
Sistem Pertahanan Antioksidan 5
SOR sebagai Faktor Pembangunan Penyakit 6
Status Antioksidan dan Stres Oksidatif Individu Gemuk 7
Polifenol 8
SOD (Superoksida Dismutase) 9
Peroksidasi Lipid (8-Isoprostan) 10
Takokak (Solanum torvum) 12
Asam Fenolat dalam Takokak 13
Flavonoid dalam Takokak 14
KERANGKA PEMIKIRAN 16 METODE 18 Desain Penelitian 18
Tempat dan Waktu Penelitian 18
Bahan Penelitian 18
Peralatan Penelitian 19
Kriteria, Jumlah, dan Cara Pemilihan Subjek Penelitian 19
Instrumen Penelitian 21
Jenis dan Cara Pengumpulan Data 21
Prosedur Penelitian 22
Persiapan dan pemasakan takokak 22
Penentuan kandungan zat gizi, total fenol, dan aktivitas antioksidan dari takokak 23
Alur penelitian 23
Periode run-in 23
Periode intervensi 23
Periode wash-out 24
Pengambilan darah 24
Pemeriksaan biokimia darah 25
Kadar SOD eritrosit 25
Kadar 8-isoprostan serum 25
DEFINISI OPERASIONAL 27
HASIL DAN PEMBAHASAN 28
Takokak 28
Kandungan gizi takokak per 100 gram 28
Kadar total fenol takokak per 100 gram 29
Aktivitas antioksidan takokak per 100 gram 30
Faktor mentah masak takokak 32
Kandungan zat gizi, total fenol, aktivitas antioksidan takokak per sajian 33 Karakteristik Subjek 33
Status Antropometri dan Kesehatan Subjek 34
Konsumsi Pangan dan Asupan Zat Gizi 35
Makanan kesukaan, ketidaksukaan, dan alergi 35
Pola konsumsi pangan subjek sebelum intervensi 35
Perbedaan asupan dan kecukupan zat gizi antar periode 36
Perbedaan asupan dan kecukupan zat gizi antar kelompok 38
Kepatuhan 40
Parameter Biokimia Sebelum dan Setelah Intervensi 40
Kadar SOD eritrosit 39
Kadar 8-isoprostan serum 43
Generalisasi Penelitian 45
Keterbatasan Penelitian 46
SIMPULAN DAN SARAN 47 Simpulan 47 Saran 47
DAFTAR PUSTAKA 48
LAMPIRAN 55
DAFTAR TABEL
1 Komposisi kimia buah takokak tiap 100 gram 13
2 Waktu pengambilan data penelitian 21
3 Jenis dan cara pengumpulan data 22
4 Definisi operasional 27
5 Kandungan zat gizi takokak per 100 gram 28
6 Kadar total fenol takokak per 100 gram 29
7 Aktivitas antioksidan takokak per 100 gram 31
8 Daftar faktor mentah masak takokak 32
9 Kandungan zat gizi, total fenol, dan aktivitas antioksidan takokak
masak per sajian 33
10 Sebaran subjek berdasarkan karakteristik umum dan sosial ekonomi 33 11 Rata-rata status antropometri dan tekanan darah subjek 34 12 Rata-rata asupan energi dan zat gizi subjek per hari sebelum intervensi 36 13 Rata-rata asupan energi dan zat gizi antar periode intervensi 37 14 Rata-rata supan energi dan zat gizi antar kelompok intervensi 39 15 Kepatuhan subjek berdasarkan konsumsi takokak dan konsumsi pangan
yang harus dihindari selama intervensi 40
16 Hasil analisis statistik uji beda kadar SOD eritrosit 43 17 Hasil analisis statistik uji beda kadar 8-isoprostan serum 45
DAFTAR GAMBAR
1 Mekanisme pembentukan isoprostan dari PUFA membran sel 11
2 Mekanisme pembentukan F2-isoprostan 12
3 Takokak (Solanum torvum) 13
4 Kerangka pemikiran efek intervensi takokak terhadap kadar SOD eritrosit dan 8-isoprostan serum pada wanita dewasa gemuk 17
5 Jumlah subjek penelitian 20
6 Alur penelitian 23
7 Perubahan kadar SOD eritrosit selama intervensi 42 8 Perubahan kadar 8-isoprostan serum selama intervensi 44
DAFTAR LAMPIRAN
1 Persetujuan etik 55
2 Daftar pangan tinggi kadar polifenol 56
3 Analisis statistik uji beda kandungan gizi, total fenol, aktivitas
antioksidan takokak per 100 gram 57
4 Analisis statistik lanjutan uji Bonferroni kandungan gizi, total fenol,
aktivitas antioksidan takokak per 100 gram 57
5 Analisis statistik uji beda asupan energi dan zat gizi subjek antar
periode intervensi 59
6 Analisis statistik uji beda asupan energi dan zat gizi subjek antar
kelompok intervensi 60
9 Kurva standar SOD 64
10 Pengukuran kadar SOD sampel 64
11 Contoh perhitungan kadar SOD eritrosit subjek 65
12 Kurva standar 8-isoprostan 66
13 Pengukuran kadar 8-isoprostan sampel 67
14 Dokumentasi penelitian 68
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Metabolisme tubuh manusia berjalan terus menerus, salah satunya adalah kerja tubuh menetralisasi paparan berbagai jenis radikal bebas, baik yang berasal dari hasil reaksi kimia dalam tubuh (endogen) dan dari lingkungan manusia (eksogen). Proses ini melibatkan zat-zat yang bersifat antioksidan baik endogen maupun eksogen. Radikal bebas yang diidentifikasi dapat memicu beberapa kerusakan oksidatif adalah senyawa oksigen reaktif (SOR) dan senyawa nitrogen reaktif (SNR) (Charles 2012). Stres oksidatif didefinisikan sebagai ketidakseimbangan antara produksi radikal bebas dengan netralisasi oleh antioksidan (Azeez et al. 2012).
Individu dengan Indeks Massa Tubuh (IMT) ≥25.0 kg/m2 dikelompokan sebagai gemuk, di dalamnya mencakup kondisi berat badan berlebih (overweight) dan obesitas (Balitbangkes 2013). Studi menunjukkan bahwa pada orang gemuk, stres oksidatif menjadi salah satu faktor penting terhadap perkembangan beberapa penyakit tidak menular seperti kanker, diabetes, dan penyakit kardiovaskular. Penyakit-penyakit tersebut merupakan penyebab umum kematian dan disabilitas di dunia (Camps et al. 2016; Rani et al. 2016).
Overweight dan obesitas meningkatkan stres oksidatif pada individu seperti yang ditunjukkan oleh peningkatan peroksidasi lipid, seperti malonilaldehida (MDA) atau isoprostan. Peroksidasi lipid dikaitkan dengan beberapa indeks adipositas dan pertahanan antioksidan sistemik yang rendah, seperti antioksidan enzim (superoksida dismutase [SOD], glutation peroksidase [GPx], atau katalase [CAT]). Stres oksidatif pada individu gemuk dapat dikurangi dengan meningkatkan sistem pertahanan antioksidan melalui pengurangan volume lemak seperti olahraga atau modifikasi diet (Vincent et al. 2007).
Antioksidan adalah senyawa yang memiliki kemampuan untuk mencegah atau menurunkan laju reaksi oksidatif dari suatu zat (Makahleh et al. 2015). Antioksidan diklasifikasikan ke dalam dua kelompok yaitu endogen dan eksogen. Antioksidan endogen diantaranya adalah SOD, CAT, dan GPx (Milbury & Richer 2008). Antioksidan eksogen dapat diperoleh dari makanan sehari-hari dan diperlukan untuk meminimalkan stres oksidatif (Sulistyowati 2006). Antioksidan eksogen diantaranya seperti vitamin C, vitamin E, karotenoid, selenium, dan polifenol (Milbury & Richer 2008).
Polifenol cukup penting dibahas karena ketersediaannya luas di tanaman dan cukup melimpah dalam diet manusia, juga aktivitas antioksidannya yang cukup besar (Issa et al. 2006; Moukette et al. 2015). Senyawa polifenol dengan aktivitas antioksidan dapat melindungi sel DNA terhadap kerusakan yang disebabkan oleh SOR. Gugus hidroksil yang melekat pada cincin aromatik berperan sebagai donor elektron atau hidrogen sehingga terjadi pembersihan (scavenging) atau penghalang (interceptor) terhadap radikal bebas (Issa et al. 2006). Salah satu tanaman yang diketahui secara alami mengandung senyawa polifenol adalah takokak (Kusirisin et al. 2009; Ramamurthy et al. 2012).
2
hijau dan bercabang banyak. Buah takokak sering dikonsumsi oleh masyarakat Jawa Barat dan telah banyak digunakan sebagai obat tradisional di Indonesia (Andarwulan et al. 2012). Takokak sering digunakan dalam pengobatan antara lain untuk sakit perut, infeksi kulit, antimikroba, antivirus, peningkat imun, anti-luka, antioksidan, anti-inflamasi, jantung dan anti-penggumpalan darah (Kamble et al. 2009).
Buah takokak mengandung polifenol jenis asam fenolat (asam kafeat, asam galat, dan asam ferulat) dan flavonoid (quersetin, rutin, dan katekin) (Gandhi et al. 2011; Kusirisin et al. 2009; Ramamurthy et al. 2012). Hasil penelitian Rahman et al. (2013), bahwa ekstrak etanol buah takokak segar umur cukup mempunyai kadar total fenol sebesar 187 mg gallic acid equivalents (GAE)/100 g dan aktivitas antioksidan sebesar 98 mg ascorbic acid equivalent antioxidant capacity (AEAC)/100 g.
Penelitian tentang takokak ini menjadi penting untuk dilakukan karena mengingat takokak sudah sangat familiar dikonsumsi oleh masyarakat di beberapa daerah di Indonesia dan sudah lama dipercaya baik untuk kesehatan. Sampai saat ini, studi tentang takokak masih terbatas, khususnya studi klinis ilmiah yang mengkaji manfaat dari sifat antioksidan yang terkandung dalam takokak bagi kesehatan, khususnya terhadap individu gemuk yang diketahui memiliki tingkat stres oksidatif lebih tinggi dibandingkan orang normal.
Perumusan Masalah
Hasil penelitian Keaney et al. (2003) menunjukkan bahwa semakin tinggi IMT maka semakin tinggi stres oksidatif. Kadar 8-isoprostan sebagai penanda
stres oksidatif meningkat secara linear pada pria dan wanita dengan IMT >25−27
kg/m2, yakni setiap peningkatan IMT sebesar 5 kg/m2 dikaitkan dengan peningkatan kadar 8-isoprostan sebesar 9.9%. Diketahui pula wanita memiliki kadar 8-isoprostan di urin lebih tinggi daripada laki-laki.
Polifenol terkenal memiliki aktivitas pembersih radikal bebas efektif. Aktivitas antioksidan polifenol sudah banyak ditunjukkan pada penelitian in vitro dan pada hewan percobaan, diduga mekanisme perannya dalam menangkal stres oksidatif sama pada manusia, merupakan titik kunci dalam berbagai patogenesis penyakit tidak menular (Annuzzi et al. 2014). Studi epidemiologi telah menunjukkan hubungan antara asupan polifenol lebih tinggi dan resiko yang lebih rendah dari penyakit kardiovaskular, diabetes mellitus, kanker, dan gangguan neurodegeneratif (Arts & Hollman 2005).
3 Takokak merupakan salah satu sayur jenis terong yang memiliki kandungan polifenol dan aktivitas antioksidan yang tinggi (Kusirisin et al. 2009; Rahman et al. 2013; Ramamurthy et al. 2012; Waghulde et al. 2011; Wetwitayaklung & Phaechamud 2011). Diketahui bahwa ekstrak takokak memiliki kekuatan pereduksi, aktivitas pembersihan terhadap DPPH dan hidrogen peroksida yang tinggi (Waghulde et al. 2011). Sudah ada beberapa penelitian yang mengkaji total fenol dan aktivitas antioksidan dari buah takokak, termasuk efeknya secara in vitro maupun terhadap hewan coba (Kusirisin et al. 2009; Rahman et al. 2013; Rahman et al. 2015; Ramamurthy et al. 2012; Waghulde et al. 2011; Wetwitayaklung & Phaechamud 2011), namun, belum ada studi klinis dilaporkan.
Banyak studi dilaporkan tentang hubungan antara kegemukan dan stres oksidatif. Hasilnya mendukung teori bahwa kegemukan meningkatkan stres oksidatif. Seperti telah disebutkan, stres oksidatif memainkan peran patogenik penting dalam beberapa penyakit tidak menular pada manusia, dan stres oksidatif yang meningkat pada subjek gemuk bisa meningkatkan risiko penyakit. Karena itu, antioksidan alami dalam makanan mungkin menjadi salah satu intervensi untuk mencegah penyakit stres oksidatif. Diharapkan bahwa khasiat antioksidan akan lebih efektif pada subjek yang gemuk daripada pada subjek dengan berat badan normal. Berdasarkan rumusan masalah tersebut, maka pertanyaan penelitian ini yaitu bagaimana pengaruh polifenol dalam takokak terhadap kadar antioksidan enzim (SOD eritrosit) dan stres oksidatif (8-isoprostan serum) pada wanita dewasa gemuk.
Tujuan Penelitian
Tujuan Umum:
Mengkaji efek intervensi takokak (Solanum torvum Swartz) terhadap kadar SOD eritrosit dan 8-isoprostan serum pada wanita dewasa gemuk.
Tujuan Khusus:
1. Mengkaji kandungan gizi, kadar total fenol, dan aktivitas antioksidan takokak.
2. Mengidentifikasi karakteristik subjek penelitian. 3. Mengkaji pola konsumsi pangan subjek.
4. Mengkaji pengaruh intervensi takokak terhadap kadar antioksidan enzim (SOD eritrosit) pada subjek wanita gemuk.
4
Manfaat Penelitian
Bagi masyarakat, penelitian ini diharapkan dapat meningkatkan pengetahuan tentang manfaat takokak khususnya untuk meningkatkan status antioksidan dan menurunkan stres oksidatif yang berkaitan pada peningkatan status kesehatan. Bagi pemerintah, diharapkan dapat menjadi acuan dalam rangka meningkatkan budidaya tanaman takokak. Bagi institusi pendidikan, penelitian ini diharapkan dapat memberikan bukti ilmiah di bidang pangan, gizi dan kesehatan terhadap penurunan risiko terjadinya penyakit-penyakit tidak menular.
Hipotesis
1. Intervensi takokak meningkatkan kadar SOD eritrosit dibandingkan kontrol. 2. Intervensi takokak menurunkan kadar 8-isoprostan serum dibandingkan kontrol.
TINJAUAN PUSTAKA
Konsep Radikal Bebas
Istilah "senyawa oksigen reaktif" (SOR) dan "senyawa nitrogen reaktif" (SNR) menggambarkan molekul oksigen dan molekul mengandung-nitrogen yang reaktif, baik radikal maupun tidak radikal. Molekul-molekul ini bisa masuk ke reaksi-reaksi yang dapat menghasilkan produksi radikal bebas atau langsung merusak substrat biokimia organik. Sebuah molekul dapat menjadi sangat reaktif walaupun secara teknis bukan suatu radikal (elektronnya berpasangan) (Milbury & Richer 2008).
Radikal bebas adalah spesies kimia yang memiliki elektron yang tidak berpasangan. Elektron tidak berpasangan biasanya mencari elektron lain untuk menjadi pasangan. Contoh radikal bebas reaktif adalah radikal hidroksil (HO*) dan alkoksil (LO*), sedangkan radikal oksida nitrat (NO*) adalah contoh radikal stabil. SOR mengandung molekul oksigen, lebih aktif dari molekul oksigen triplet yang ada di udara. Radikal superoksida (O2*), hidrogen peroksida (H2O2), radikal
hidroksil, dan singlet oksigen (1O2) dianggap sebagai spesies oksigen khas reaktif,
tapi dalam arti yang lebih luas, spesies lain seperti radikal alkoksil, radikal peroksil (LO2*), nitrogen dioksida (NO2*), lipid hidroperoksida (LOOH), protein
hidroperoksida, dan hipoklorit (HOCl) juga dianggap sebagai spesies oksigen reaktif. Beberapa dari mereka memiliki elektron yang tidak berpasangan dan radikal bebas, tetapi yang lain tidak (Papas 1999).
5 normal lipid, protein, dan DNA. SOR diproduksi baik secara endogen maupun eksogen (Khansari 2009).
Sumber ROS endogen adalah mitokondria, cytokrom p450, peroksisom, dan aktivasi sel inflamatori. Mitokondria lebih banyak menghasilkan H2O2 karena
mitokondria 90% menggunakan O2 secara seluler. Selama mitokondria mereduksi
O2 untuk menghasilkan air, beberapa beberapa produk akan dihasilkan seperti
superoksida (O2*), hidrogen peroksida (H2O2) dan radikal hidroksil (OH*).
Sumber SOR endogen yang lain berasal dari neutrofil, eosinophil, makrofag. Aktifasi makrofag dengan menginisiasi oksigen akan menyebabkan peningkatan ROS yang meliputi O2, nitrit oksida (NO) dan hidrogen peroksida (H2O2).
Pembentukan radikal bebas dari intraseluler dapat berasal dari lingkungan seperti ultraviolet, radiasi dan polutan (Khansari 2009).
Sistem Pertahanan Antioksidan
Antioksidan adalah setiap zat yang ketika hadir dalam konsentrasi rendah dibandingkan dengan substrat yang dapat dioksidasi, secara signifikan menunda atau mencegah oksidasi substrat tersebut (Milbury & Richer 2008). Semua bentuk kehidupan memelihara lingkungan reduksi dalam sel. Pemeliharaan status ini dicapai melalui sistem pertahanan antioksidan, untuk melindungi homeostasis seluler terhadap SOR berbahaya yang dihasilkan selama metabolisme seluler normal, juga pada status patofisiologi. Zat antioksidan adalah molekul kecil yang dapat mengikat radikal bebas dengan menerima atau menyumbangkan elektron untuk menghilangkan kondisi tidak berpasangan. Biasanya, ini berarti bahwa molekul antioksidan menjadi radikal bebas dalam proses pembersihan SOR untuk lebih stabil dan menjadi molekul kurang reaktif. Dalam kebanyakan kasus, molekul pengikat (scavenger molecule) memberikan radikal hidrogen yang bergabung dengan radikal bebas. Akibatnya, hal ini menghasilkan radikal baru yang memiliki enhanced lifetime dibandingkan dengan sebelumnya, karena sistem terkonjugasi. Radikal extended lifetime ini memungkinkan untuk bereaksi dengan radikal kedua dengan pembentukan molekul baru dan dengan demikian satu molekul pengikat dapat menghilangkan dua radikal (Rodrigo 2009).
Molekul antioksidan dapat diproduksi secara endogen atau disediakan eksogen melalui diet atau suplemen antioksidan. Enzim antioksidan endogen utama adalah SOD, CAT, dan GPx. SOD mengkonversi anion superoksida menjadi H2O2, yang merupakan substrat untuk CAT dan GPx. Katalase
memetabolisme H2O2 menjadi air dan oksigen, dan GPx mereduksi H2O2 dan
hidroperoksida organik ketika bereaksi dengan GSH. Glutation tereduksi hadir pada konsentrasi tinggi di semua sel mamalia, terutama di sel ginjal, hepatosit, dan eritrosit. Tripeptide ini melindungi kelompok thiol protein dari oksidasi tanpa enzimatik atau sebagai co-substrat GPx (Rodrigo 2009).
6
SOR sebagai Faktor Pembangunan Penyakit
SOR diperkirakan berkontribusi pada patogenesis sejumlah gangguan yang tampaknya tidak berhubungan, termasuk diabetes mellitus tipe 2, kanker dan penuaan, gagal jantung, hipertensi, preeklamsia dan aterosklerosis, penyakit neurodegeneratif, dan lainnya. Semua patologi ini adalah penyebab penting morbiditas dan mortalitas pada abad kedua puluh, dan telah dipelajari secara ekstensif selama beberapa tahun terakhir. Beberapa contoh penyakit yang dikenal secara luas akan dijelaskan secara singkat sebagai berikut:
Penyakit kardiovaskular
Penyakit kardiovaskular adalah penyebab kematian pertama di dunia. Senyawa oksigen reaktif memiliki kunci peran dalam homeostasis dari dinding pembuluh darah dan ada bukti kuat yang menunjuk ke SOR faktor penting untuk pengembangan penyakit kardiovaskular (Rodrigo 2009). Asupan flavonoid berbanding terbalik dengan angka kematian akibat penyakit jantung koroner dalam studi epidemiologi (Waghulde et al. 2011).
Hipertensi
Hipertensi mungkin adalah penyakit kronis yang paling umum di dunia. Hipertensi merupakan faktor risiko utama untuk penyakit lain seperti jantung atau stroke otak, insufisiensi jantung atau gagal ginjal kronis, dan lainnya. Senyawa oksigen reaktif yang diduga berkontribusi pada patogenesis hipertensi melalui penurunan sel endotel dan melalui uncoupled eNOS. Stres oksidatif kronis menyebabkan penuaan dari sel endotel. Ini ditandai dengan pelepasan sel endotel atau bagian dari membran sel endotel. Dengan kekuatan stres oksidatif, kapasitas komunikasi sel endotel untuk memperbaiki cedera endotel terbatas, dan integritas vascular menjadi tergantung pada penggabungan sel progenitor endotel, dengan kapasitas sintesis NO rendah (Zicha et al. 2001). Selain itu, peningkatan sintesis superoksida mengurangi bioavailabilitas NO dengan inaktivasi, menyebabkan pembentukan ONOO–. Kemudian, protonasi ONOO– berikut akan putus, membebaskan peroksidan OH*. Endotel dipengaruhi oleh reaksi ini dalam dua cara yang berbeda: 1) Pengikatan nitrit oksida mengganggu aktivitas vasodilatasi, menyebabkan tekanan darah tinggi dan permanen 2) Radikal hidroksil menyebabkan kerusakan di sel endotel melalui cara ini (Rodrigo 2009).
Stroke dan aterosklerosis
Hubungan antara risiko tinggi stroke dan stres oksidatif kronis telah banyak didokumentasikan. Hal ini terutama disebabkan disfungsi endotel. Nitrit oksida memiliki sifat antiaterosklerotik ampuh karena setelah dilepaskan dari sel endotel, ia bekerja dengan prostasiklin untuk menghambat agregasi platelet. Nitrit oksida memblok adhesi neutrofil ke sel endotel dan ekspresi molekul adhesi. Ini menarik menunjukkan bahwa pada konsentrasi tinggi NO juga menghambat proliferasi sel otot polos. Oleh karena itu, di bawah semua kondisi di mana NO defisit absolut atau relatif dihadapi, proses aterosklerosis sedang dimulai atau dipercepat (Rodrigo 2009).
Sindrom metabolik dan diabetes
7 beberapa faktor, seperti perubahan fluiditas membran, penurunan ketersediaan NO dan peningkatan kadar kalsium intraseluler (Ueda et al. 2000). Pasien diabetes menunjukkan, selama periode postprandial, sebuah peningkatan parameter kadar
plasma MDA dan penurunan kelompok sulphydryl, α-tokoferol dan total radical-trapping antioxidant.
Kanker
Adanya SOR dan SNR seperti OH*, NO*, OONO–, berkontribusi terhadap inflamasi kronis yang dapat menimbulkan penyakit. SOR dan SNR diproduksi dari aktifasi sel inflamatori dari mutasi gen penekan tumor sampai translational modifikasi protein terkait (apoptosis, perbaikan DNA, pemberhentian siklus sel). RNS akan berlanjut menghasilkan aldehide yang reaktif yaitu MDA (malondialdehid) dan 4-hydroxynonenal (4-HNE) (second massanger free radical/toxic). MDA dan 4HNE dapat menginduksi mutasi gen penekan tumor. Hal tersebut dapat meningkatkan resiko timbulnya kanker yang terkait inflamasi kronis. SNR sebagai mediator signal transduction, termasuk MAPK signal cascade, memacu induksi protooncogen, c-Fos, C-Jun dan AP-1 yang akan melibatkan proliferasi, differensiasi, apoptosis dan tranformasi (Hussain 2007). Kerusakan ginjal
Bukti eksperimental yang cukup mendukung pandangan bahwa ROS dapat memainkan peran kunci dalam proses patofisiologi penyakit ginjal (Yasunari et al. 2002), termasuk gagal ginjal kronis, hemodialisis, gagal ginjal akut diinduksi rhabdomyolysis, fibrosis ginjal, glomerulosklerosis, pembentukan batu ginjal, dan hiperlipidemia, dan lainnya. Kelimpahan PUFA membuat organ ginjal rentan terhadap serangan SOR. Keterlibatan SOR dalam mekanisme kerusakan ginjal didukung oleh dua baris bukti eksperimental: (i) deteksi produk cedera oksidan di jaringan ginjal atau urin, dan (ii) eksperimental demonstrasi efek perlindungan dari inhibitor metabolisme ROS (Shokoji et al. 2003). Glomerulus jauh lebih sensitif terhadap cedera oksidatif dari segmen nefron lainnya. Stres oksidatif dapat mengubah struktur dan fungsi glomerulus karena efek SOR pada sel mesangial dan endotel. SOR yang semakin diyakini sebagai molekul sinyal intraseluler penting dalam jalur mitogenik terlibat dalam patogenesis glomerulonefritis (Touyz 2001).
Status Antioksidan dan Stres Oksidatif Individu Gemuk
Banyak literatur menunjukkan bahwa kelebihan berat badan dan obesitas merupakan penyebab utama dari penyakit penyerta, termasuk DM tipe 2, penyakit kardiovaskular, berbagai kanker, dan masalah kesehatan lainnya yang dapat menyebabkan morbiditas dan mortalitas lebih lanjut. Oleh karena itu, pendekatan kesehatan masyarakat untuk mengembangkan strategi berbasis populasi untuk pencegahan kelebihan berat badan sangat penting (Sanchez et al. 2011).
8
ini memberikan bukti kuat bahwa peningkatan stres oksidatif berhubungan dengan peningkatan adipositas.
Penelitian Choi et al. (2011), mengevaluasi efek intervensi astaxantin (ASX) dalam mengurangi stres oksidatif yang disebabkan overweight dan obesitas dengan mengacu pada biomarker dari peroksidasi lipid dan aktivitas antioksidan. Hasilnya bahwa intervensi 5 mg dan 20 mg ASX selama 3 minggu secara signifikan menurunkan kadar MDA plasma dan meningkatkan aktivitas SOD plasma pada kedua kelompok dosis, dibandingkan dengan baseline. Penelitian ini membuktikan intervensi berefek lebih besar pada kelompok subjek overweight dan obesitas dibandingkan dengan kelompok normal.
Polifenol
Polifenol adalah senyawa bioaktif yang tersebar luas di tanaman dan juga merupakan konstituen signifikan dari diet manusia. Polifenol terkenal memiliki aktivitas pembersih radikal bebas efektif. Aktivitas pembersih radikal (radical-scavenging activity) dari polifenol mengandalkan struktur molekul, pola substitusi dari gugus hidroksil, ketersediaan hidrogen fenolik dan kemungkinan stabilisasi radikal HO dan NO via donasi hidrogen atau melalui delokalisasi ekspansi elektron (Moukette et al. 2015).
Polifenol adalah antioksidan yang paling berlimpah dalam makanan. Asupannya adalah 10 kali lebih tinggi dari vitamin C dan 100 kali lebih tinggi dibandingkan vitamin E atau karotenoid. Polifenol seperti katekin atau quersetin dapat langsung mengikat SOR, seperti superoksida, hidrogen peroksida, atau asam hipoklor, yang bisa sangat merusak dengan merusak lipid, protein, dan DNA. Inti fenolik dapat bertindak sebagai penyangga dan menangkap elektron dari SOR untuk membuat mereka kurang reaktif. Di satu sisi, flavonoid adalah konstituen utama dari kelompok polifenol dengan lebih dari 4000 senyawa. Di sisi lain, senyawa tanpa flavonoid mengandung cincin aromatik dengan satu atau lebih gugus hidroksil. Kelompok ini mencakup stilben (resveratrol), asam fenolik (gallic acid), saponin (ginsenosida), dan polifenol lainnya seperti kurkumin dan tannin (Rodrigo 2009). Studi epidemiologis menunjukkan hubungan terbalik antara diet diperkaya polifenol dengan berkurangnya risiko penyakit kardiovaskular (Ulbricht & Southgate 1991).
Flavonol quersetin, salah satu senyawa polifenol yang paling banyak ditemukan pada diet manusia, diketahui dapat melemaskan otot polos pembuluh darah dan pengobatan menurunkan tekanan darah yang kronis dan disfungsi endotel dalam model eksperimental. Dengan demikian, efek menguntungkan dari polifenol dalam pencegahan hipertensi mungkin akibat dari pengaruh kompleks terhadap keseimbangan NO dalam sistem kardiovaskular (Sanchez et al. 2006).
9 dan DNA sehingga mencegah kanker. Beberapa penelitian pada hewan juga menunjukkan tingkat penurunan demensia dengan menunda hilangnya kognisi dan beberapa pemulihan fungsi dengan penuaan (Milbury & Richer 2008).
Flavonoid diketahui mengurangi risiko penyakit jantung dan kanker, tapi jenis flavonoid manakah yang lebih protektif dalam kondisi tertentu masih dieksplorasi lebih lengkap. Seperti semua antioksidan, flavonoid juga memiliki potensi untuk berubah menjadi pro-oksidan setelah mereka telah teroksidasi. Secara kimiawi, potensial reduksi dari radikal flavonoid dalam media netral lebih tinggi dari vitamin C. Akibatnya, radikal flavonoid memiliki potensi untuk mengoksidasi dan menguras vitamin C in vivo, meskipun hal ini belum dibuktikan. Beberapa flavonoid seperti epigallocatechin, epigallocatechin gallate, dan quercetin terletak dalam redox pecking order sehingga mereka berpotensi memperbaiki vitamin E radikal, tapi sekali lagi ini masih belum ditampilkan in vivo (Milbury & Richer 2008).
Penelitian manfaat polifenol masih dalam “infancy stages”. Belum ada manfaat pasti atau efek samping yang dilihat sampai saat ini dan tidak ada (Dietary Reference Intakes) DRIs untuk senyawa polifenol saat. Seperti semua antioksidan lain, dianjurkan bahwa peningkatan dan beragam diet buah dan sayuran (antara 5-9 porsi setiap hari), kacang-kacangan, dan biji-bijian yang bermanfaat (Milbury & Richer 2008).
SOD (Superoksida Dismutase)
Enzim SOD adalah salah satu dari jenis enzim antioksidan endogen dan berperan melindungi sel dari proses oksidasi (kerusakan oksidatif), merupakan sistem pertahanan pertama untuk menekan pembentukan radikal bebas. Enzim ini terdapat pada semua organisme aerob dan umumnya berada dalam tingkat subseluler (intraseluler). Karena berada dalam lingkungan aerob maka dibutuhkan oksigen untuk kehidupannya sehingga peka terhadap terjadinya kerusakan karena oksidasi atau disebut stres oksidatif. Enzim SOD bekerja di dalam sel dan berperan pada tahap awal terjadinya stres oksidatif yaitu dengan mengubah radikal anion superoksida menjadi hidrogen peroksida dan molekul oksigen. Rimbach et al. (2008) menyebutkan bahwa isoflavon berperan sebagai antioksidan lewat mekanisme penghambat oksidasi LDL, stimulasi aktivitas enzim antioksidan (SOD dan CAT) serta induksi sintesa glutathione.
Radikal anion superoksida dapat secara efektif dikurangi melalui reaksi dengan SOD. Hidrogen peroksida yang dihasilkan kemudian diubah ke air yang tidak beracun oleh CAT atau GPx. Pada manusia, kombinasi SOD dan GPx telah lama dikenal untuk menjadi alat yang ampuh untuk detoksifikasi kation dari anion superoksida yang dihasilkan dari dalam sel. SOD adalah enzim yang ditemukan oleh McCord dan Fridovich, yang memainkan peran penting dalam mekanisme pertahanan dari sel biologis yang terkena oksigen. SOD mengkatalisis dismutasi dari radikal anion superoksida (O2*–) menjadi molekul oksigen dan hidrogen peroksida. Reaksi ini diakui sebagai sistem antioksidan yang melindungi sel-sel dari toksisitas superoksida (Aldini et al. 2010).
10
inti sel mamalia. Pada manusia, hati memiliki jumlah dan aktivitas SOD1 yang relatif tinggi. SOD1 manusia adalah homodimer mengandung satu ion tembaga dan satu ion seng di setiap 16-kDa subunit yang terdiri dari 153 asam amino. Ion tembaga dipegang oleh interaksi dengan ligan imidazolate dari residu histidin di SOD1 dalam situs aktif enzim. Ion seng (Zn2+) memberikan kontribusi untuk stabilisasi enzim. (2) Mn-SOD (SOD2) dari manusia adalah homotetramer dengan individu 22-kDa subunit yang memiliki satu ion Mn di pusat aktif. SOD2 umumnya terletak di matriks mitokondria dan mengkatalisis reaksi yang sama seperti SOD1. Pada manusia, aktivitas SOD2 di korteks ginjal lebih tinggi daripada di jaringan lain. (3) Ekstraseluler (EC)-SOD (SOD3) ditemukan dalam cairan ekstraseluler seperti plasma manusia dan getah bening, dan ada sebagai tetramer identik 30-kDa subunit di sebagian besar spesies. SOD3 juga enzim yang mengandung tembaga dan seng yang bertindak sebagai pembersih superoksida untuk melindungi jaringan dari kerusakan oksidatif ekstraseluler (Zelko 2002).
Singkatnya, superoksida, hidrogen peroksida (H2O2), radikal hidroksil,
radikal alkoksi, radikal alkil peroksi, dan LOOH semuanya adalah SOR. Superoksida dihasilkan selama pengurangan oksigen dalam rantai pernapasan dalam mitokondria dan diubah oleh SOD atau dismutasi spontan menjadi H2O2,
yang menghasilkan radikal reaktif hidroksil melalui reaksi dengan ion logam aktif redoks (Aldini et al. 2010). Hasil sidik ragam pada hewan coba tikus yang diberikan DMBA menunjukkan bahwa perlakuan konsentrasi takokak berpengaruh signifikan terhadap kadar SOD, semakin tinggi konsentrasi takokak maka kadar SOD akan semakin meningkat (Rahman et al. 2015).
Peroksidasi Lipid (8-Isoprostan)
11
Gambar 1 Mekanisme pembentukan isoprostan dari PUFA membran sel (Ari-Agung
et al. 2013)
Selama dekade terakhir, kuantifikasi F2-isoprostan (F2-IsoPs) telah terbukti menjadi biomarker yang paling dapat diandalkan dari kerusakan oksidatif in vitro dan in vivo. F2-IsoPs bersifat stabil, molekul yang kuat yang terdeteksi di semua jaringan manusia dan cairan biologis, termasuk plasma, urin, cairan bronkoalveolar, dan cairan cerebrospinal, memberikan ukuran yang paling akurat dari stres oksidatif. (Aldini et al. 2010). 8-isoprostan adalah senyawa seperti prostaglandin (PG)-F2 milik kelas F2-isoprostan yang dihasilkan in vivo dari peroksidasi non enzimatik asam arakidonat yang dikatalis oleh radikal-bebas (Montuschi et al. 1999). Setidaknya satu dari isoprostan, 8-isoprostan (8-epi
PGF2α), telah terbukti memiliki aktivitas biologis. 8-isoprostan telah diusulkan sebagai penanda kekurangan antioksidan dan stres oksidatif dan kadarnya meningkat pada perokok berat. 8-isoprostan plasma dari subjek sehat berkisar 40-100 pg/ml yang meningkat dengan usia subjek (Wang et al. 1995). Mekanisme lebih jelas tentang pembentukan F2-IsoPs dari asam arakidonat disajikan dalam Gambar 2.
Asam Arakhidonat (PUFA membran sel)
Lipid hidroperoksida
Conjugated Diene
Radikal bebas
Oksigen
Radikal Alkoksi Radikal peroksil
bekerja pada asam arakhidonat
12
Gambar 2 Mekanisme pembentukan F2-isoprostan. Isoprostan terbentuk dari oksidasi asam arakidonat melalui mekanisme enam tahap. Empat potensial regoisomer digambarkan, masing-masing memiliki enam belas stereoisomer (tidak ditampilkan)
Takokak (Solanum torvum)
13
bebas yang melindungi kerusakan sel, sebagai anti-kanker dan melindungi serangan karsinogen (Eleazu 2012; Percival 1998).
Takokak pun mampu melancarkan sirkulasi darah, menghilangkan rasa sakit (analgetik) dan menghilangkan batuk (antitusif) (Rahmat 2009). Takokak memiliki aktivitas pembersih superoksida yang tinggi yakni di atas 70%. Kandungan kimia yang terdapat pada takokak mampu bertindak sebagai antioksidan dan dapat melindungi jaringan tubuh dari efek negatif radikal bebas (Sirait 2009). Gambar takokak (Solanum torvum) dapat dilihat pada Gambar 3.
Gambar 3 Takokak (Solanum torvum)
Takokak mengandung sejumlah bahan kimia yang berpotensi aktif secara farmakologi seperti isoflavonoid sulfat dan glikosida steroid, chlorogenone dan neochlorogenone, turunan triacontane, oligoglycosides 22-β-O-spirostanol, 26-O -
β-glukosidase (Waghulde et al. 2011). Takokak mengandung 2,3,4-trimethyltriacontane, octacosanyl triacontanoate, 5-hexatriacontanone, triacontanol, 3-tritriacontanone, tetratriacontanoic acid, sitosterol, stigmasterol, campesterol (Mahmood et al. 1983). Tabel 1 menyajikan komposisi kimia buah takokak tiap 100 gram.
Tabel 1 Komposisi kimia buah takokak tiap 100 gram
Komposisi Satuan Jumlah
Air g 89
Protein g 2
Lemak g 0.1
Karbohidrat g 8
Serat g 10
Kalsium mg 50
Fosfor mg 30
Besi mg 2
Vitamin A IU 750
Vitamin B1 mg 0.08
Vitamin C mg 80
Sumber: Sirait (2009)
Asam Fenolat dalam Takokak
14
antikarsinogenik, dan antiinflamasi. Turunan asam galat, 4-O-methylgallic acid (4OMGA), telah dilaporkan sebagai metabolit utama asam galat dalam tubuh manusia. Penelitian mengenai farmakokinetik asam galat dengan bentuk tablet asam galat (25 mg GA) dan teh hitam (50 mg GA) pada 10 subjek sehat diketahui bahwa waktu paruh asam galat sekitar 1 jam dengan waktu luruh dalam plasma yaitu selama 12 jam (Shahrzad et al. 2001).
Asam ferulat dan asam kafeat merupakan jenis asam fenolat turunan asam hidroksisinamat. Asam ferulat dan asam kafeat jarang ditemukan dalam bentuk bebas, kecuali dalam makanan olahan yang mengalami pembekuan, sterilisasi, atau fermentasi. Asam kafeat bebas maupun teresterifikasi umumnya merupakan asam fenolat paling melimpah mewakili 75% – 100% dari total asam hidroksisinamat dalam buah. Asam ferulat merupakan asam fenolat yang paling melimpah pada bagian luar dari serealia (aleurone dan pericarp). Asam ferulat biasanya ditemukan dalam bentuk trans, teresterifikasi menjadi arabinoxylans dan hemiselulosa (Manach et al. 2004). Penelitian terhadap 5 subjek manusia yang diberikan 250 ml dosis tunggal biji kopi hijau menunjukkan bahwa kadar asam ferulat dalam plasma meluruh dalam waktu 3 jam (Matsui et al. 2007). Sedangkan asupan anggur merah yang mengandung total polifenol 2014 mg/L dan 11.04 mg/L pada 12 subjek manusia menunjukkan bahwa waktu luruh asam kafeat dalam plasma yaitu selama 4 jam (Caccetta et al. 2000). Asam kafeat dan asam ferulat terdeteksi pada plasma dan urin manusia setelah asupan oral asam klorogenat yang diketahui memiliki efek biologi dan farmakologi beragam, seperti aktivitas antioksidan, aktivitas anti-karsinogen, dan aktivitas antihipertensi (Matsui et al. 2007).
Flavonoid dalam Takokak
Flavonol merupakan jenis flavonoid yang paling melimpah dalam pangan (Manach et al. 2004), yang diketahui terkandung dalam takokak adalah quersetin dan rutin. Quersetin merupakan flavonol yang paling paling umum dikonsumsi manusia karena keberadaannya yang tersebar luas pada tanaman pangan. Penelitian crossover acak pada 9 subjek manusia yang diberikan daging bawang merah kering (99.2% quersetin glikosida dan 0.8% quersetin aglikon) atau kulit bawang merah kering (83.3% quersetin aglikon dan 16.7 % quersetin glukosida), mengandung 1.4 mg quersetin/ kg BB menunjukkan bahwa quersetin aglikon
lebih tinggi bioavailabititasnya dibandingkan bentuk glikosidanya (quersetin 3,4’ -O-bis- β -glukosida, quersetin 3-O-β- glukosida, quersetin 4’-O- β - glukosida,
15 pangan. Hasil membuktikan bahwa matriks pangan merupakan faktor kunci (Wiczkowski et al. 2008).
16
KERANGKA PEMIKIRAN
Stres oksidatif adalah ketidakseimbangan antara radikal bebas dan antioksidan, yakni jumlah radikal bebas lebih besar daripada jumlah antioksidan. Stres oksidatif dapat menyebabkan kerusakan sel dan merupakan dasar patogenesis penyakit kardiovaskular, penyakit paru-paru, penyakit autoimmun, keganasan, gangguan metabolik dan penuaan (Halliwell & Gutteridge 2015). Banyak faktor yang bisa mempengaruhi derajat stres oksidatif, seperti aktivitas fisik, usia, ras, berat badan, merokok, gaya hidup sedenter, alkohol, jenis kelamin, obat-obatan, stres, paparan racun, dan lainnya (Nielsen et al. 1997; Block et al. 2002; Candrawati 2013).
Radikal bebas adalah suatu gugus molekul atom atau ion yang mempunyai satu elektron yang tidak berpasangan (Lieberman & Marks 2009). Radikal bebas yang diidentifikasi dapat memicu beberapa kerusakan oksidatif adalah senyawa oksigen reaktif (SOR) dan senyawa nitrogen reaktif (SNR) (Charles 2012). SOR bisa terdapat dalam bentuk O2*–, radikal hidroksil (OH), asam hipoklorit (HOCl),
radikal alkoksil dan radikal peroksil (Halliwell & Gutteridge 2015). SOR dapat merusak sel dengan merusak membran lipid melalui serangkaian reaksi kimia yang disebut peroksidasi lipid. Peroksidasi lipid ini terjadi karena membran sel mengandung asam lemak tak jenuh ganda (Polyunsaturated Fatty Acid – PUFA) dalam jumlah tinggi. Peroksidasi membran lipid akan menyebabkan perubahan pada sel, seperti penurunan transport kalsium dalam retikulum sarkoplasma, peningkatan permeabilitas membran, pembentukan metabolit toksik, serta gangguan fungsi mitokondria dan enzim (Lieberman & Marks 2009).
17 utuh dan hancuran buah takokak mengandung alkaloid, flavonoid jenis flavon, terpenoid, dan saponin. Penelitian lain yang dilakukan oleh Rahman et al. (2015) pada hewan coba tikus putih yang terpapar DMBA kemudian diintervensikan ekstrak etanol takokak dengan berbagai konsentrasi, memberikan bukti bahwa konsentrasi takokak berpengaruh nyata terhadap peningkatan kadar SOD. Berdasarkan penelitian terdahulu, perlu diketahui efek konsumsi takokak utuh terhadap status antioksidan manusia mengingat takokak yang biasa dikonsumsi oleh masyarakat adalah dalam bentuk utuh, bukan bentuk ekstrak. Berikut di bawah ini adalah kerangka pemikiran penelitian (Gambar 4).
Keterangan: = diteliti
= tidak diteliti
Gambar 4 Kerangka pemikiran efek intervensi takokak terhadap kadar SOD eritrosit dan 8-isoprostan serum pada wanita dewasa gemuk
Penyakit Tidak Menular/Degeneratif
Peroksidasi lipid
8-isoprostan
Total Polifenol Plasma
Antioksidan Endogen (SOD)
Antioksidan Eksogen (Polifenol Takokak)
Stres oksidatif Usia, Ras
IMT, Jenis Kelamin Aktivitas fisik Stres
Merokok & Alkohol Obat-obatan
Gaya hidup sedentari Paparan toksin, dll
Antioksidan Radikal bebas
Pola konsumsi pangan
Stres oksidatif
Peroksidasi lipid
18
METODE
Desain Penelitian
Jenis penelitian ini adalah quasi eksperimental, desain cross-over dengan 2x1 minggu intervensi dipisahkan dengan periode washout dan diawali dengan 1 minggu periode run-in. Setelah randomisasi, satu kelompok menerima perlakuan dan kelompok lain menjadi kontrol. Setelah waktu yang ditentukan, perlakuan dihentikan beberapa saat, kemudian dilakukan silang (Sastroasmoro dan Ismael 2014). Untuk mengurangi carryover effect maka diterapkan satu periode washout selama 1 minggu. Protokol pelaksanaan penelitian sudah mendapatkan Persetujuan Etik dari komite etik Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia (FKUI) Nomor: i089/UN2.F1/ETIK/2015 dan dapat dilihat pada Lampiran 1.
Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Kampung Gunung Leutik, Desa Benteng, Kecamatan Ciampea, Kabupaten Bogor. Penentuan lokasi penelitian berdasarkan penelitian Pratiwi (2012), bahwa di lokasi tersebut masyarakatnya sudah sangat familiar dengan takokak dan sering mengonsumsi takokak dengan cara pengolahan yang bervariasi. Survei lokasi dan subjek dilakukan sejak akhir bulan Oktober 2015. Penjaringan subjek yang diakhiri penandatanganan persetujuan calon subjek dilakukan pada tanggal 16 November 2015. Penapisan calon subjek meliputi pengukuran antropometri (BB, TB, dan IMT) serta pemeriksaan tekanan darah oleh perawat dan pemeriksaan kesehatan oleh dokter dilakukan di Puskesmas Ciampea pada tanggal 18 November 2015.
Tanggal 22 November 2015, dilakukan pengambilan darah pertama (I) sebagai baseline 1 dengan bantuan bidan terdekat di Posyandu Anggrek. Kemudian subjek ditentukan secara acak untuk mendapatkan jenis perlakuan (kontrol atau takokak), lalu selama seminggu menjalani periode intervensi 1. Tanggal 29 November 2015, dilakukan pengambilan darah kedua (II) sebagai endline 1, setelah itu masuk ke dalam periode wash-out. Seminggu kemudian pada tanggal 06 Desember 2015, dilakukan pengambilan darah ketiga (III) sebagai baseline 2, lalu selama seminggu menjalani periode intervensi 2. Terakhir, tanggal 13 Desember 2015, dilakukan pengambilan darah keempat (IV) sebagai endline 2. Analisis sampel eritrosit dan serum dilakukan di Laboratorium Terpadu FKUI pada tanggal 12 Januari 2016. Analisis kandungan zat gizi, total fenol, dan aktivitas antioksidan takokak dilakukan di Laboratorium Mbrio Biotekindo Indonesia pada bulan Februari 2016.
Bahan Penelitian
19
Folin-Ciocalteu dan DPPH, air bebas mineral, etanol, Na-EDTA, es batu, serta bumbu-bumbu untuk memasak takokak.
Peralatan Penelitian
Alat-alat yang digunakan meliputi: timbangan BB dengan ketelitian 0.1 kilogram, pengukur TB microtoise dengan ketelitian 0.1 centimeter, pengukur tekanan darah sphygmomanometer dengan ketelitian 1.0 mmHg, peralatan untuk memasak, timbangan makanan, peralatan pengambil darah (syringe 5cc, kapas, alkohol, plester, tabung, vial), peralatan laboratorium (sarung tangan, tabung reaksi, piala gelas, pipet mikro dan tip, labu semprot, gelas ukur, botol penyimpanan, inkubator, microsentrifuge, lemari pendingin -80oC dan -20oC, plate shaker, ice maker, vortex, printer, 96-well plate, microplate reader).
Kriteria, Jumlah, dan Cara Pemilihan Subjek Penelitian
Kriteria inklusi pada penelitian ini adalah 1) ibu rumah tangga; 2) IMT
≥25.0 kg/m2
(kategori gemuk menurut Balitbangkes 2013); 3) berusia 25-45 tahun dan belum menopause; 4) menyukai takokak; 5) bersedia berpartisipasi dan menandatangani informed consent. Kriteria eksklusi pada penelitian ini yaitu 1) perokok aktif dan pecandu alkohol; 2) sedang hamil dan menyusui; 3) memiliki riwayat penyakit kronis dan degeneratif; 4) rutin mengonsumsi suplemen antioksidan dan/atau obat fitofarmaka; 5) sedang berpartisipasi pada penelitian lain. Kriteria Drop-Out adalah 1) subjek menyatakan tidak ingin melanjutkan; 2) ditemukan indikasi kriteria eksklusi pada subjek sewaktu penelitian berlangsung; 3) subjek tidak menjalani pemeriksaan darah secara lengkap. Rumus yang digunakan untuk menghitung jumlah subjek desain cross-over adalah sebagai berikut (Chow et al. 2008):
n = [(Zα/2 + Zβ)2σ2]/2ε2
n = [10.5 (9.6)2]/2(102)= 4.84 ≈ 5 orang Keterangan:
n = besar subjek total minimal 10.5 = β λ0%, P 0.05
σ = 9.6 (standar deviasi kadar SOD berdasarkan penelitian Utari 2011)
ε = 10 U/ml (selisih atau efek yang diharapkan berdasarkan penelitian Utari 2011) *Untuk antisipasi dropout = 20%, maka jumlah subjek total minimal menjadi 6 orang.
20
(informed consent) terhadap tindakan yang akan dilakukan. Form persetujuan merupakan dasar untuk dimulainya penelitian yaitu tahap screening (penapisan). Calon subjek yang sudah menandatangani persetujuan langsung dihimbau untuk menghentikan konsumsi pangan/ makanan/ minuman tinggi polifenol yang daftarnya diberikan oleh peneliti.
Setelah calon subjek menandatangani formulir persetujuan tertulis, selanjutnya dilakukan penapisan calon subjek. Pemilihan subjek bertujuan untuk meminimalkan keragaman, dimana semua subjek memiliki aktivitas yang hampir sama sehari-harinya. Semua subjek juga bertempat tinggal di kawasan yang sama, sehingga kegiatan dan jenis makanan lain selain yang telah diatur oleh peneliti juga diharapkan tidak jauh berbeda. Selain itu pengontrolan juga lebih mudah dilakukan. Penapisan awal adalah dengan memastikan usia calon subjek masuk ke dalam kriteria inklusi yang dibuat. Setelah itu, dilakukan anamnesis, pemeriksaan fisik dan tekanan darah serta antropometri sebagai pengukuran dasar untuk penapisan. Calon subjek yang tidak lulus penapisan, maka dinyatakan gugur. Sebaliknya, calon subjek yang lulus penapisan kemudian dinyatakan menjadi subjek penelitian.
Saat penjaringan calon subjek, terdapat 12 orang yang menandatangani persetujuan tertulis untuk bergabung dalam penelitian. Setelah penapisan, terdapat 2 orang yang tidak sesuai dengan kriteria penelitian pada poin IMT. Kesepuluh subjek kemudian memasuki periode run-in selama 7 hari. Saat pengambilan darah pertama terdapat 2 orang yang harus drop-out karena takut untuk diambil darah. Maka dari itu, subjek penelitian ini terdapat sebanyak 8 orang, kemudian secara acak subjek tersebut dibagi menjadi 2 kelompok masing-masing sebanyak 4 (empat) orang, yaitu kelompok kontrol dan kelompok takokak.. Dikarenakan penelitian ini menggunakan desain cross-over, maka semua subjek mengalami kedua perlakuan tersebut sehingga jumlah subjek untuk perlakuan terhitung sebanyak 16 orang. Pengacakan dilakukan menggunakan bantuan Ms. Excel. Pengacakan dilakukan oleh personil yang tidak turut dalam kegiatan penelitian. Gambar 5 menyajikan jumlah subjek pada penelitian ini.
21 Instrumen Penelitian
Formulir yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari 1) Formulir karakteristik subjek (nama, usia, pendidikan, pekerjaan, pendapatan/ pengeluaran, besar keluarga); 2) Formulir antropometri (BB, TB, IMT); 3) Formulir kesehatan (tekanan darah, status kesehatan saat pemeriksaan/ keluhan, riwayat kesehatan, kebiasaan konsumsi obat/ suplemen); 4) Formulir konsumsi (semi quantitative food frequency questionnaire (SQFFQ) dan food record).
Jenis dan Cara Pengumpulan Data
Data yang dikumpulkan meliputi karakterisik umum subjek, sosial ekonomi, riwayat dan status kesehatan, antropometri, konsumsi pangan, dan biokimia darah. Data karakterisik umum terdiri atas: nama dan tanggal lahir/ umur. Data sosial ekonomi meliputi: pendidikan, pekerjaan, dan pendapatan/ pengeluaran. Data riwayat kesehatan meliputi riwayat penyakit, kebiasaan konsumsi obat dan suplemen. Data-data tersebut diambil dengan teknik wawancara menggunakan kuesioner. Data status kesehatan dikumpulkan dengan cara pemeriksaan fisik, anamnesa, serta wawancara keluhan dan riwayat penyakit yang dilakukan oleh dokter, sedangkan pengukuran tekanan darah dilakukan oleh seorang perawat. Data antropometri meliputi: BB, TB, dan IMT. Saat pengukuran, subjek menggunakan pakaian ringan dan tanpa alas kaki. Data karakteristik umum subjek, sosial ekonomi, status kesehatan, dan antropometri dikumpulkan satu kali pada awal penelitian yakni sebelum periode run-in. Tabel 2 menyajikan waktu pengumpulan data.
Tabel 2 Waktu pengambilan data penelitian
Data Sebelum
22
Tabel 3 Jenis dan cara pengumpulan data
Variabel Indikator Cara Pengumpulan
Karakteristik Umum Nama
Antropometri BB, TB Pengukuran BB dan TB
Biokimia darah SOD eritrosit
Kuesioner food record dan Wawancara
Prosedur Penelitian
1. Persiapan dan pemasakan takokak
Takokak yang digunakan sebagai bahan intervensi berasal dari satu penjual takokak yang ada di Pasar Anyar, Kota Bogor. Persiapan dan pemasakan takokak dilakukan setiap hari selama periode intervensi (7 hari) sekitar pukul 04.00–05.30 pagi. Takokak dipetik tangkainya dan diambil bagian buahnya. Buah takokak lalu dicuci bersih dan ditimbang sebanyak 150 gram mentah per subjek per hari. Setelah itu, takokak mentah dimasak rebus dengan bumbu hingga matang selama ±10 menit. Bumbu masakan yang digunakan berbeda-beda setiap harinya berupa bumbu masak instan, baik bersantan maupun tanpa santan. Jenis masakan takokak yang digunakan secara berurutan adalah (1) Takokak Bumbu Gulai + santan, (2) Takokak Bumbu Soto, (3) Takokak Bumbu Rendang + santan, (4) Takokak Bumbu Semur, (5) Takokak Bumbu Kare + santan, (6) Takokak Saus Lada Hitam, dan (7) Takokak Bumbu Opor + santan.
23 2. Penentuan kandungan zat gizi, total fenol, dan aktivitas antioksidan dari
takokak
Takokak mentah dan masak dianalisis kandungan zat gizi (analisis proksimat), kadar total fenol (metode Folin-Ciocalteau), dan aktivitas antioksidannya (metode diphenylpicryl-hydrazyl [DPPH]). Analisis proksimat yang dilakukan meliputi analisis kadar air dan abu metode gravimetri (SNI 01-2891-1992), kadar protein metode Kjeldahl (SNI 01-2891-01-2891-1992), kadar lemak metode Soxhlet (IKP/K-1), dan kadar karbohidrat metode by difference (IKP/K-3).
3. Alur penelitian
Setelah mendapatkan subjek yang bersedia mengikuti penelitian dan memenuhi kriteria inklusi, maka penelitian dapat dilaksanakan. Penelitian ini dibagi menjadi empat periode secara berurutan terdiri atas 1) periode run-in, 2) periode intervensi I, 3) periode washout, dan 4) periode intervensi II. Setiap periode dilakukan selama satu minggu (7 hari).
a. Periode run-in
Periode run-in dilakukan selama 7 hari sebelum dilakukan pengacakan kelompok subjek. Selama periode ini, seluruh subjek mengonsumsi makanan rumah sehari-hari (home diet). Dilakukan pengumpulan data food record sebanyak 2x24 jam dan SQFFQ untuk mengetahui pola konsumsi subjek. Subjek tidak diperbolehkan mengonsumsi takokak dan hasil olahannya dan subjek diminta untuk tidak mengonsumsi pangan tinggi kadar polifenol (daftar pangan tinggi kadar polifenol disajikan pada Lampiran 2). Selain itu, subjek tidak diperkenankan mengonsumsi semua jenis suplemen dan obat. Periode run-in dilakukan bertujuan untuk membersihkan kadar polifenol dalam darah subjek dan merupakan tahap sosialisasi sebelum masuk pada periode intervensi 1. Alur penelitian terdapat pada Gambar 6 di bawah ini.
Gambar 6 Alur penelitian b. Periode intervensi (1 dan 2)
Periode intervensi dilakukan selama 7 hari. Selama periode ini, seluruh subjek mengonsumsi makanan rumah sehari-hari (home diet). Perbedaannya, kelompok takokak diminta untuk mengonsumsi takokak sebanyak sekitar 150 gram berat mentah per subjek per hari, diberikan setiap hari selama periode intervensi. Dikarenakan takokak yang diberikan dalam bentuk masak, adanya faktor pemasakan menyebakan takokak masak yang diberikan adalah sebanyak
24
±160 g per subjek per hari. Dilakukan pengumpulan data food record sebanyak 2x24 jam untuk mengetahui pola konsumsi subjek selama periode intervensi. Subjek pada kelompok kontrol tidak diperbolehkan mengonsumsi takokak dan hasil olahannya. Seluruh subjek dari kedua kelompok diminta untuk tidak mengonsumsi pangan yang tinggi kadar polifenol (kecuali takokak untuk kelompok takokak). Selain itu, selama periode intervensi, subjek tidak diperkenankan mengonsumsi semua jenis suplemen dan obat. Hal yang sama dilakukan pada periode intervensi 2, namun kelompok kontrol ditukar menjadi kelompok takokak, begitu pula sebaliknya kelompok takokak ditukar menjadi kelompok kontrol.
Subjek mempersiapkan seluruh kebutuhan makannya sendiri kecuali masakan takokak yang disiapkan oleh peneliti. Takokak masak tidak harus dihabiskan pada satu waktu, namun diminta untuk dihabiskan dalam satu hari, dapat dimakan sebagai lauk maupun sebagai cemilan tergantung preferensi subjek. c. Periode washout
Periode washout juga dilakukan selama 7 hari. Selama periode ini, seluruh subjek mengonsumsi makanan rumah sehari-hari (home diet). Dilakukan pengumpulan data food record sebanyak 2x24 jam. Subjek tidak diperbolehkan mengonsumsi takokak dan hasil olahannya dan subjek diminta untuk tidak mengonsumsi pangan tinggi kadar polifenol. Selain itu, subjek tidak diperkenankan mengonsumsi semua jenis suplemen dan obat.
Data makanan kesukaan dan ketidaksukaan termasuk alergi terhadap makanan dari subjek ditanyakan terlebih dahulu sebelum intervensi dilakukan. Periode intervensi diberikan selama 1 minggu berdasarkan hasil berbagai penelitian terdahulu yang memberikan hasil bahwa intervensi pangan tinggi polifenol dengan jangka waktu singkat sudah bisa meningkatkan status antioksidan dan menurunkan stres oksidatif (Khan et al. 2015; Serafini et al. 1998; Nielsen et al. 1999; Young et al. 1999). Selain itu, intervensi tidak terlalu lama dilakukan untuk menghindari rasa kebosanan subjek dan mengurangi efek samping jika terlalu lama konsumsi takokak.
Penentuan periode wash-out berdasarkan penelitian farmakokinetik senyawa polifenol dalam takokak yakni waktu luruh asam galat selama 12 jam (Shahrzad et al. 2001), asam ferulat selama 3 jam (Matsui et al. 2007), asam kafeat selama 4 jam (Caccetta et al. 2000), kuersetin selama >72 jam (Wiczkowski et al. 2008), dan katekin >8 jam (Bell et al. 2000). Sehingga dalam waktu 1 minggu diharapkan kadar polifenol dalam darah sudah benar-benar bersih. 4. Pengambilan darah
Pengambilan sampel darah dilakukan sebanyak 4 kali, yakni hari ke-1 (akhir periode run-in), ke-8 (akhir periode intervensi I), ke-15 (akhir periode wash-out), dan ke-22 (akhir periode intervensi II). Sebelum pengambilan darah, subjek diminta untuk puasa selama 10-12 jam terlebih dahulu, mulai malam hari terakhir setiap periode dan pengambilan darah dilakukan serentak pada pagi hari keesokannya dimulai pukul 06.30 hingga selesai. Pengambilan darah dilakukan di lipatan siku tangan subjek oleh seorang bidan.
