VALIDASI SEKUNDER METODE ANALISA KAPANG DAN
KHAMIR PADA SAOS
SKRIPSI
RIZQI FEBRINA
F24070053
DEPARTEMEN ILMU DAN TEKNOLOGI PANGAN FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER
INFORMASI
Saya menyatakan dengan sebenar-benarnya bahwa skripsi dengan judul
Validasi Sekunder Metode Analisa Kapang dan Khamir pada Saos adalah hasil karya saya sendiri dengan arahan dosen pembimbing akademis dan belum diajukan dalam bentuk apapun di perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Bogor, Juni 2013
Yang membuat pernyataan,
ABSTRACT
Rizqi Febrina. Method Secondary Validation of Mould and Yeast Analysis Sauce
Food are frequentlycontaminated by mold and yeast. The method used for analysis of mold on food in Indonesia set by BSN (Badan Standarisasi Nasional) was using potato dextrose agar (PDA) media. Problems are sometimes occured when using this media due to the spreading of mold colony that suppress other colonies to grow, resulting difficulties to asses morphology as well as enumeration of the mold. Statistifically, the outcome would be less acurate. Another method that could be used for the analysis of mold and yeast are the methods of ISO (International Standart Operation). Rose bengal dichloran chloramphenicol media (DRBC) was found to be a better media for quantative analysis of mold and yeast since it contains dichloran and rose bengal that could prevent the growth of spreading colonies. Laboratory experiments was needed to verify that using of different media can domonstrate the same performance for method enumeration. Secondary validation conducted for verification, if the laboratory using standard methods or adopting validated method. This Research was performed using the method of SNI 01-2897-1992 and ISO (International Standart Operation). Both of that methods were compared to obtained a valid methods. Parameters determined on method validation were accuracy precision, linearity, limit of detection, and limit of quantification. The results showed that all parameters were in accordance with the acceptance criteria of Internationa Standart Operation Method Validation. Accuracy was determined SNI method and ISO method with recovery percentage in range of 84%-109% for SNI and ISO method. The linearity in the concentration of 10; 100; 1000; and 10.000 cfu/gram
resulted in correlation coefficent of 0,9979–0,9981. limit of detection in this
method was 2cfu/gram and limit of quantification was 4 cfu/gram. For sauce product, the number of colonies grown in both media of DRBC and PDA were not significantly diffrent.
VALIDASI SEKUNDER METODE ANALISA KAPANG DAN
KHAMIR PADA SAOS
SKRIPSI
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN
pada
Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan
Oleh
RIZQI FEBRINA
F24070053
DEPARTEMEN ILMU DAN TEKNOLOGI PANGAN FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR
Judul Skripsi : Validasi Sekunder Metode Analisa Kapang dan Khamir pada Saos
Nama : Rizqi Febrina
NIM : F24070053
Menyetujui: Dosen Pembimbing
Dr. Harsi D Kusumaningrum NIP 197601312005012001
Mengetahui,
Ketua Departemen
Dr. Ir. Feri Kusnandar, M.Sc NIP. 19680526.199303.1.004
PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia-Nya sehingga skripsi ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Mei 2012 ini adalah validasi metode
analisa dengan judul “Validasi Sekunder Metode Analisa Kapang dan Khamir
pada Saos”.
Ucapan terimakasih, penulis sampaikan kepada LDITP (Laboratorium Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan) yang telah menyediakan pendanaan penelitian, Ibu Dr. Harsi D Kusumaningrum sebagi pembimbing, Ibu Dr. Didah Nurfaridah, S.TP, M.Si dan Ibu Siti Nurjanah, S.TP, M.Si sebagai penguji. Ungkapan terimakasih juga disampaikan kepada papa, mama, serta seluruh keluarga, atas doa dan kasih sayangnya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Juni 2013
DAFTAR ISI
PARAMETER UJI TERVALIDASI ... 10
VERIFIKASI METODE PADA PRODUK SAOS ... 17
KESIMPULAN ... 19
Rata-rata jumlah perolehan kembali kapang dan khamir dengan perhitungan mengacu pada SNI ... 13
Rata-rata jumlah perolehan kembali kapang dan khamir dengan perhitunga mengacu pada ISO ... 13
Jumlah kultur yang tumbuh pada saos berbagai merk ... 17
DAFTAR GAMBAR
Halaman Diagram persiapan media PDA... 4Diagram persiapan media DRBC... 4
Diagram persiapan sampel... 5
Perhitungan jumlah koloni kapang dan khamir ... 6
Diagram penentuan akurasi, presisisi dan linearitas ... 7
Kultur murni kapang Rhizopus Olighosporus... 9
Kultur murni Saccharomyces cerevisiae... 9
Jumlah koloni kapang dan khamir dengan perhitungan mengacu pada SNI..12
Jumlah koloni kapang dan khamir dengan perhitungan mengacu pada ISO... 12
Presisi metode dengan perhitungan mengacu pada SNI ... 14
Presisi metode dengan perhitungan mengacu pada ISO... 14
Linearitas dengan perhitungan mengacu pada SNI... 16
Linearitas dengan perhitungan mengacu pada ISO ... 16
Berbagai jenis kapang dan khamir yang tumbuh pada berbagai merk saos .. 17
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman Biodata...221
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Pangan merupakan sumber gizi bagi manusia. Pertumbuhan dan perkembangan mikroorganisme dalam makanan sangat erat hubungannya dengan kehidupan manusia. Pertumbuhan mikroorganisme dalam pangan dapat menyebabkan perubahan yang menguntungkan. Selain itu pertumbuham mikroorganisme dalam pangan juga dapat mengakibatkan perubahan fisik yang tidak diinginkan, sehingga bahan pangan tersebut tidak layak dikomsumsi.
Pangan menjadi layak atau tidak dikonsumsi tidak terlepas dari ada tidaknya mikoorganisme perusak dan patogen pangan. Mikroorganisme tersebut dapat terkandung di dalam makanan disebabkan karena kontaminasi pada bahan pangan selama proses pengolahan dan penyimpanan. Kontaminasi yang sering terjadi pada negara Indonesia yang beriklim tropis adalah kontaminasi disebabkan oleh kapang dan khamir.
Saos merupakan produk berbentuk pasta dengan aroma khas. Saos biasa ditambahkan sebagai bahan penyedap dan penambah rasa pada makanan. Saos adalah produk yang dihasilkan dari campuran bubur atau pasta atau padatan tomat maupun cabai yang diperoleh dari tomat yang masak, yang diolah dengan bumbu-bumbu, dengan atau tanpa penambahan bahan pangan lain. Saos seringkali memiliki masalah pertumbuhan kapang pada saat penyimpanannya.
Metode yang digunakan untuk analisis kapang dan khamir yang ditetapkan BSN (Badan Srandardisasi Nasional) melalui SNI 01-2897-1992, yaitu tentang tata cara uji kapang dan khamir menggunakan media potato dextrose agar (PDA). Namun terdapat kelemahan pada media potato dextrose agar (PDA), yaitu sulitnya menghitung jumlah kapang dan khamir disebabkan oleh pertumbuhan kapang yang melebar (spreading) dari satu atau dua jenis kapang tertentu pada cawan petri yang mengakibatkan tertutupnya koloni kapang dan khamir lain, atau bahkan terhambatnya pertumbuhan kapang dan khamir lain sehingga tingkat kepercayaan terhadap hasil menjadi kurang (Indriati dan Herawati 2009).
Metode lain yang dapat digunakan untuk analisis kapang dan khamir adalah metode ISO (International Standart Operation). Metode ISO (International
Standart Operation) memiliki sensitifitas yang cukup baik karena menggunakan
2
Namun, penggunaan media DRBC membutuhkan biaya yang lebih mahal dibandingkan menggunakan media PDA.
Validasi metode analisa adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya (SNI 19-17025-2000 Klausul 5.4.5.1). Validasi primer dilakukan jika laboratorium menggunakan metode analisis baru hasil pengembangan, atau metode yang dimodifikasi terhadap suatu metode standar. Validasi sekunder dilakukan untuk verifikasi, jika laboratorium menggunakan atau mengadopsi metode standar yang telah divalidasi (Sukarno 2005).
Pendeteksian kapang dan khamir pada skripsi ini dilakukan dengan menggunakan metode yang mengacu pada SNI 01-2897-1992 dan metode ISO
(Iternational Standart Operation) yaitu ISO 21527-1:2008(E). Kedua metode
tersebut dibandingkan hasilnya sehingga didapatkan metode yang valid. Metode valid diperlukan untuk dapat ditetapkan dengan jelas bidang penerapannya dan kehandalan mutlak yang diberikannya. Validasi metode pengujian adalah proses menetapkan dan mengevaluasi sifat atau gambaran dari manfaat, ini merupakan suatu bagian dari program jaminan mutu (Siregar 2007).
Tujuan Penelitian Tujuan Umum
Tujuan umum dari penelitian ini adalah menentukan metode yang tepat untuk analisis kapang dan khamir.
Tujuan Khusus
Tujuan khusus penelitian ini adalah :
1. Melakukan validasi sekunder atau verifikasi metode SNI 01-2897-1992 dan metode ISO 21527-1:2008(E).
2. Membandingkan hasil analisis kapang dan khamir yang diperoleh dari dua metode berbeda yaitu metode SNI 01-2897-1992 dan ISO 21527-1:2008(E) .
Manfaat Penelitian
Manfaat dari penelitian ini adalah :
1. Mendapatkan informasi mengenai metode analisa yang tepat untuk digunakan pada analisis kapang dan khamir.
2. Mendapatkan informasi mengenai tingkat validitas metode yang digunakan.
METODOLOGI PENELITIAN
Waktu dan Tempat
3
Laboratorium Mikrobiologi Pangan, Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan IPB.
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan memiliki grade analitik. Media yang digunakan pada penelitian ini adalah potato dextrose agar (PDA OXOID), dichloran rose bengal
chloramphenicol (DRBC OXOID), pottato dextrose broth (PDB OXOID),
aquadest, chloramphenicol, dan pengencer (0,1% pepton water OXOID). Sampel
yang digunakan adalah saos dengan berbagai merk. Kultur yang digunakan
Rhizopus oligosporus dan Saccharomyces cerevisisae (ATTC 9763).
Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah cawan petri, micro pipet,
erlenmeyer, gelas piala, alumunium foil, tissue, kapas, bunsen, vortex, hockey
stick, sudip, timbangan, kantong plastik steril, wadah pipet, inkubator 25°C,
stomacher, bunsen, outoclaf, laminar flow, oven/alat sterilisasi kering, tabung
reaksi dan tabung reaksi bertutup, oven suhu 30°C.
Metode Penelitian
Persiapan Pengencer
Pada metode ISO dan SNI menggunakan 0,1% pepton water sebagai pengencer. Pepton water ditimbang sebanyak 1 gr kemudian dicampurkan dengan 1 liter aquadest dalam labu takar. Labu takar digoyang hingga seluruh pepton
water larut dan tercampur dengan aquadest secara merata. Pengencer ditempatkan
di dalam tabung reaksi dalam jumlah 9 ml untuk membuat pengenceran 1:10 (1ml atau 1gr contoh dalam 9 ml) dan ditempatkan di dalam erlenmeyer masing-masing berisi 90ml untuk membuat pengenceran 1:10 (10 ml atau 1gr contoh dalam 90 ml). Pengencer disterilisasi 121° selama 15 menit.
Persiapan Media
Media pottato dextrose broth (PDB) ditimbang sebanyak 6 gram dicampur dengan 250 ml aquadest. Media dipanaskan di atas hotplate dan diaduk hingga larut kemudian dimasukkan ke dalam tabung tertutup masing-masing 7-10 ml. Tabung yang telah berisi media disterilisasi ke dalam otoklaf selama 15 menit pada suhu 121°C kemudian didinginkan pada suhu 50° C.
4
Gambar 1. Diagram persiapan media PDA
Media dichlorant rose bengal agar (DRBC) yang telah ditimbang sebanyak 31,5 dan dicampur dengan 1 liter aquadest. Media dipanaskan di atas hotplate
dan diaduk hingga larut. Media disterilisasi ke dalam otoklaf selama 15 menit pada suhu 121°C dan didinginkan pada suhu 50° C dan ditambahkan dengan 0,1 gr antibiotik kloramfenikol. Kemudian dituangkan ke dalam masing-masing cawan petri steril sebanyak 15-20 ml. Cawan yang berisi media dibiarkan memadat dan disimpan di dalam oven steril pada suhu 30°C selama 24 jam dengan posisi terbalik hingga permukaan media kering dan siap untuk dilakukan
spread. Persiapan media dapat dilihat pada Gambar 2.
Gambar 2. Diagram persiapan media DRBC disimpan pada oven steril suhu 30°C selama
24 jam dengan posisi terbalik hingga permukaan agar mengering
PDA + aquadest
dinginkan hingga suhu 50°C, ditambahkan
dituangkan ke dalam cawan petri 15-20ml dipanaskan hingga larut
diterilisasi 121°C, 15menit
kloramfenikol
+ aquadest
steril
disimpan pada oven steril suhu 30°C selama 24 jam dengan posisi terbalik hingga
permukaan agar mengering DRBC + aquadest
dinginkan hingga suhu 50°C, ditambahkan kloramfenikol
dituangkan ke dalam cawan petri 15-20ml dipanaskan hingga larut
diterilisasi 121°C, 15menit
5
Persiapan Sampel
a. Sampel negatif
Sampel ditimbang secara aseptik sebanyak 10 gr, kemudian dimasukkan ke dalam plastik steril berisi 90 ml pengencer. Kemudian sampel dihomogenkan hingga tercampur merata dengan pengencer dan dibiarkan kurang lebih 15 menit sebelum digunakan.
b. Sampel positif
Sampel ditimbang aseptik sebanyak 10 gr, kemudian dimasukkan ke dalam kantong plastik steril berisi 90 ml pengencer. Selanjutnya kapang Rhizopus
oligosporus dan khamir Saccharomyces cerevisiae diinokulasi ke dalam
sampel masing-masing sebanyak 0,5 ml ke dalam suspensi sampel dan dihomogenkan. Sampel dibiarkan kurang lebih 15 menit sebelum digunakan. c. Kontrol positif
Kapang Rhizopus oligosporus dan khamir Saccharomyces cerevisiae
diencerkan ke dalam 0,1% pepton dan dihomogenkan.
Persiapan sampel untuk validasi kapang khamir dapat dilihat pada Gambar 3.
Sampel negatif Sampel positif Kontrol positif
Gambar 3. Diagram persiapan sampel
Uji Kemurnian Kultur
Sebelum melakukan penelitian terlebih dahulu harus dilakukan persiapan kultur uji. Kultur murni larutan stok acuan merupakan faktor penting yang harus diperhatikan dalam melakukan validasi metode analisa. Untuk memastikan kemurnian kultur stok acuan diperlukan konfirmasi melalui serangkaian tahap analisis. Dalam penelitian ini kultur murni yang digunakan adalah kapang
Rhizopus oligosporus dan khamir Saccharomyces cerevisiae .
Kultur yang diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi Pangan IPB diperiksa kemurniaannya di bawah mikroskop. Biakan yang telah diperiksa kemurniannya dapat digunakan sebagai kultur stok dan kultur kerja. Kultur ditumbuhkan ke dalam media agar miring pottato dextrose agar (PDA) dan diinkubasi 25°C selama 5 hari untuk dijadikan kltur stok. Sedangkan untuk kultur kerja diambil satu ose kultur murni dan ditumbuhkan di dalam pottato dextrose
broth (PDB) dan diinkubasi pada suhu 25°C selama 5 hari.
Analisa Jumlah Kultur
6
hockey stick. Jumlah koloni yang tumbuh pada masing-masing cawan akan
diakumulasikan dan dihitung sebagai jumlah colony forming unit per milliliter
(cfu/ml). Pengenceran yang menunjukkan pertumbuhan sekitar 0, 10, 100, 1000 dan 10.000 CFU/ml akan digunakan sebagai standar penetapan inokulum. Perhitungan koloni secara ringkas dapat dilihat pada Gambar 4.
Analisa jumlah koloni kapang dan khamir dilakukan untuk mengetahui jumlah kultur. Kultur kerja yang akan digunakan terlebih dahulu diketahui jumlahnya penambahan kultur pada sampel dapat diatur sesuai dengan jumlah yang diinginkan. Cawan yang masuk ke dalam perhitungan adalah cawan petri dengan jumlah koloni 10-150 koloni (SNI) dan <150 koloni (ISO). Rumus perhitungan koloni adalah sebagai berikut :
N = ∑ C/ [(1 x n1) + (0,1 x n2) x d]
Dimana :
n1 = jumlah cawan pada pegenceran pertama n2 = jumlah cawan pada pegenceran kedua
d = pengenceran pada cawan pertama
∑ C = jumlah koloni pada cawan
N = jumlah koloni per ml atau gram
Gambar 4. Perhitungan jumlah koloni kapang dan khamir
Menentukan akurasi relatif, presisi, dan linearitas
7
dan disebar menggunakan hockey stick sehingga pertumbuhannya menyebar dan tidak saling menumpuk antara koloni satu dengan koloni lainnya kemudian diinkubasi 25°C selama 5 hari. Untuk lebih jelasnya dapat dilihat pada Gambar 5.
Sampel negatif Sampel positif
Gambar 5. Diagram penentuan akurasi relatif, presisi dan linearitas
Parameter akurasi ditentukan dengan menghitung nilai recovery menggunakan rumus:
%Recovery (R) = [(A-B)/C] x 100
Keterangan :
A = sampel dengan inokulum (sampel positif) B = sampel tanpa inokulum (sampel negatif) C = inokulum tanpa sampel (kontrol positif)
Keseragaman nilai yang diperoleh dari pengukuran berulang dinyatakan sebagai presisi dengan rumus:
(log a1- log b1)/x1 = perbedaan relatif hasil logaritma duplo i = 1,2,3,...,n
p = jumlah penentuan duplo (jumlah sampel uji)
8
Menentukan LOD dan LOQ
Tahapan penentuan LOD dan LOQ dihitung melalui garis linearitas. Selain itu dapat juga dilakukan dengan kalibrasi 3 tingkatan yang terkecil dengan pengulangan sebanyak 6 kali. Inokulasi kultur sebesar 3, 10, 30 cfu/ml ditambahkan ke dalam sampel dan diaduk hingga homogen. Sampel kemudian diinkubasi masing-masing 25°C selama 5 hari pada media PDA dan DRBC.
Gambar 6. Diagram penentuan LOD dan LOQ
Nilai LOD dan LOQ dihitung menggunakan rumus : LOD = 3,3 Sa
Verifikasi Jumlah Kapang dan Khamir pada Saos
Verifikasi dilakukan untuk mengetahui jumlah kapang dan khamir yang terdapat pada saos. Sampel saos dengan berbagai merk diperiksa jumlah kapang dan khamir. Saos sebanyak 10 gr dilarutkan ke dalam 90ml pengencer kemudian dipipet dan dimasukkan ke dalam 3 cawan petri yang berisi media padat PDA atau DRBC sebanyak 0.3 ml, 0.3 ml dan 0.4 ml. Untuk lebih jelasnya dapat dilihat
9
HASIL DAN PEMBAHASAN
Kemurian Kultur
Kemurnian kultur uji merupakan faktor penting yang harus diperhatikan dalam validasi metode analisis karena dapat mempengaruhi hasil uji (Sac 2002). Konfirmasi kemurnian kultur dilakukan dengan melihat pertumbuhan kultur murni di bawah mikroskop. Pertumbuhan kultur dapat dilihat pada Gambar 11 dan 12.
Gambar 11. Kultur murni kapang Rhizopus Oligosporus perbesaran 100 kali
Kultur uji yang digunakan pada penelitan ini adalah kapang dan khamir. Kapang yang digunakan merupakan kapang Rhizopus olighosporus yang banyak ditemui pada buah-buahan dan sayur-sayuran yang membusuk. Koloni kapang
Rhizopus olighosporus di bawah mikroskop berwarna keabu-abuan, sprorangiofor
berwarna kecoklatan, muncul berlawanan arah dengan rhizoid. Kultur uji khamir yang digunakan pada penelitian ini adalah Saccharomyces cerevisiae yang koloninya berwarna putih dan licin. Bentuknya bulat, lonjong ataupun panjang dengan bau yang khas. Saccharomycess cerevisiae tidak memiliki hifa dan tubuh buah seperti kapang. Saccharomycess cerevisiae tahan terhadap suhu tinggi, mempunyai sifat stabil dan mudah adaptasi.
Gambar 12. Kultur murni Saccharomyces cerevisiae perbesaran 100 kali
Analisa Jumlah Kultur
10
untuk perhitungan ISO setelah diinkubasi selama 5 hari pada suhu 25°C. Jumlah koloni kapang yang tumbuh pada media DRBC sebanyak 6,91 cfu/ml untuk perhitungan SNI dan 6,92 cfu/mluntuk perhitungan ISO. Nilai RSD media PDA sebsar 0,92% pada perhitungan SNI dan 0,83% pada perhitungan ISO. Nilai RSD pada media DRBC sebsar 0,81% pada perhitungan SNI dan 0,81% pada perhitungan ISO. Data kultur uji kapang dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2. Jumlah awal kultur uji kapang pada media PDA dan DRBC dihitung menggunakan perhitungan menurut SNI 9(10-150 koloni) dan ISO (<150 koloni) dilakukan 5 kali ulangan
pada media DRBC sebanyak 7,04 cfu/ml untuk perhitungan SNI dan 7,02 cfu/ml untuk perhitungan ISO. Nilai RSD media PDA sebsar 0,56% pada perhitungan SNI dan ISO. Nilai RSD pada media DRBC sebsar 0,59% pada perhitungan SNI dan 0,60% pada perhitungan ISO. Jumlah pertumbuhan khamir dapat dilihat pada Tabel 3.
11
RSD hitung yang lebih kecil dari 10% masih dapat diterima (Sac 2002). Jumlah koloni kapang khamir dapat dilihat pada Tabel 4.
Tabel 4. Jumlah awal kultur uji kapang dan khamir pada media PDA dan DRBC dihitung menggunakan perhitungan menurut SNI 9(10-150 koloni) dan ISO (<150 koloni) dilakukan 5 kali ulangan
Perhitungan SNI Perhitungan ISO PDA DRBC PDA DRBC Rata-rata 7,03 6,99 7,01 6,99 SD 0,05 0,04 0,04 0,04 RSD (%) 0,71 0,63 0,57 0,62
Berdasarkan hasil penelitian pertumbuhan koloni pada media DRBC lebih mudah dihitung dibandingkan media PDA. Hal tersebut dikarenakan kapang dan khamir yang tumbuh pada media DRBC ditekan penyebarannya sehingga kononi yang satu tidak menghambat pertumbuhan koloni lainnya. Pewarnaan pada media DRBC juga mempermudah perhitungan karena koloni akan tampak lebih jelas dan tidak menumpuk.
Parameter Uji Tervalidasi
Pada penelitian ini dilakukan validasi dua metode pengujian kapang dan khamir, yaitu metode SNI 01-2897-1992 dan metode ISO 21527-1:2008(E). Kedua metode ini merupakan metode pengujian kapang dan khamir yang sudah baku sehingga hanya perlu dilakukan validasi yang sifatnya kuantitatif. Metode SNI 01-2897-1992 menyebutkan bahwa pengujian kapang dan khamir menggunakan media PDA yang diinkubasi pada suhu 25°C selama 5 hari dan pengujian kapang dan khamir metode ISO 21527-1:2008(E) menggunakan media DRBC yang diinkubasi 25°C selama 5 hari. Kedua metode dikonfirmasi dengan parameter linearitas, akurasi relatif, presisi, LOD dan LOQ.
Akurasi
12
Gambar 13. Jumlah koloni kapang dan khamir yang diperoleh dari tiap tingkatan inokulum dengan perhitungan mengacu pada SNI (10-150 koloni) dengan 5 tingkat inokulum dilakukan 5 kali ulangan
Hasil perolehan kembali inokulum dapat dilihat pada Gambar 13 dan 14. Berdasarkan penelitian empat tingkatan inokulum dapat dilihat bahwa jumlah perolehan kembali media DRBC lebih tinggi dibandingkan dengan jumlah perolehan kembali media PDA yang dihitung menggunakan cara perhitungan SNI maupun ISO.
Gambar 14. Jumlah koloni kapang dan khamir yang diperoleh dari tiap tingkatan inokulum dengan perhitungan mengacu pada ISO (<150 koloni) dengan 5 tingkat inokulum dilakukan 5 kali ulangan
Perolehan kembali pada media DRBC yang lebih tinggi dibandingkan dengan media PDA menunjukkan bahwa media kapang dan khamir lebih optimal tumbuh pada media DRBC. Hal tersebut didukung dengan penelitian Indriati dan Heruwati (2009) yang menyatakan media DRBC lebih baik digunakan untuk menghitung jumlah koloni kapang dan khamir yang tumbuh karena dapet menekan pertumbuhan koloni yang sifatnya menyebar. Kapang dan khamir yang tumbuh pada media DRBC terpisah antar koloninya sehingga lebih mudah dalam perhitungan.
13
Inokulum Perolehan Inokulum Perolehan (log cfu/
Perolehan kembali pada ulangan pertama mendapatkan hasil dibawa 100% pada media PDA dan DRBC. Pada ulangan selanjutnya perolehan kembali yang didapatkan di atas 100. Rata-rata jumlah perolehan kembali koloni tiap tingkatan dapat dilihat pada Tabel 5 dan 6. Hasil perolehan kembali berkisar antara 84-109% masih dapat dikatan baik. Hal tersebut mengacu kepada AOAC (2002) dimana nilai perolehan kembali yang masih dapat diterima pada kisaran 80-120%. Dengan demikian kedua metode ini dapat diadopsi untuk keperluan analisis.
Tabel 6. Rata-rata jumlah perolehan kembali kapang dan khamir dengan
Inokulum Perolehan Inokulum Perolehan (log
14
Presisi
Presisi menggambarkan keseragaman nilai yang diperoleh dari pengukuran berulang pada suatu prosedur analisis (Leyva et al. 2008). Evaluasi presisi adalah langkah utama dari validasi (Walton 2001). Untuk bisa dipercaya maka harus didapatkan presisi yang baik. Pada verifikasi metode yang digunakan adalah ripitabilitas. Ripitabilitas ditunjukkan dari nilai RSD analisis.
Gambar 15. Presisi metode dinyatakan sebagai nilai relative standart deviation
(RSD) pada tiap tingkat inokulum dengan perhitungan mengacu pada SNI (10-150 koloni) dilakukan 5 kali ulangan
Gambar 15 dan 16 menunjukkan nilai RSD pada tiap tingkat inokulum dengan perhitungan mengacu pada metode SNI dan ISO.. Dari empat tingkatan inokulum terlihat nilai RSD pada media PDA lebih besar dibandingkan nilai RSD pada media DRBC. Nilai RSD PDA pada tingkatan 10. 100, 1000, 10.000 adalah 7,8%, 1,4%, 1,2%, dan 1,4%. Nilai RSD media DRBC pada tingkatan 100, 1000, 10.000 adalah 5,3%, 1%, 0,8% dan 0,8%. Nilai RSD dari penelitian masih berkisar antara 0%-7,8%.
Gambar 16. Presisi metode dinyatakan sebagai nilai relative standart deviation (RSD) pada tiap tingkat inokulum dengan perhitungan mengacu pada ISO (<150 koloni) dengan 5 tingkat inokulum dilakukan 5 kali ulangan
15
bahwa nilai RSD media DRBC lebih baik dibandingkan dengan nilai RSD media PDA. Hal tersebut menunjukkan bahwa DRBC memiliki presisi yang lebih baik jika dibandingkan dengan PDA. Semakin kecil nilai RSD yang dihasilkan maka keterulangan penelitian tersebut semakin baik.
Linearitas
Linearitas adalah kemampuan metode analisis yang memberikan respon yang secara langsung atau dengan bantuan transformasi matematik yang baik, proposional terhadap konsentrasi analit dalam sampel (Harmita 2004). Penetapan linearitas minimal dilakukan dengan lima level konsentrasi inokulim.
Tabel 7 Koefisien determinasi dan persamaan regresi linear perhitungan mengacu pada SNI (10-150 koloni) dengan 5 tingkat inokulum dilakukan 5 kali ulangan
Ulangan Media PDA Media DRBC Persamaan linear R Persamaan linear R
1 y = 1,0035x - 1,0158 0,9929 y = 1,0010x - 0,9969 0,9942 2 y = 1,0383x - 1,0484 0,9995 y = 1,0226x - 1,0073 0,999 3 y = 1,0383x - 1,0645 0,9996 y = 1,0127x - 0,9995 0,9988 4 y = 1,0363x - 1,0661 0,9981 y = 1,0267x - 1,0165 0,9993 5 y = 1,0253x - 1,0249 0,9997 y = 1,0332x - 1,0339 0,9993
Rata-rata y = 1,0283x - 1,0440 0,9998 y = 1,0192x - 1,0120 0,9995
Tabel 8 Koefisien determinasi dan persamaan regresi linear perhitungan mengacu pada ISO (<150 koloni) dengan 5 tingkat inokulum dilakukan 5 kali ulangan
Ulangan Media PDA Media DRBC Persamaan linear R Persamaan linear R 1 y = 1,0136x - 1,0661 0,9926 y = 1,0081x - 1,0326 0,9938 2 y = 1,0537x - 1,1258 0,9972 y = 1,0380x - 1,0848 0,9964 3 y = 1,0642x - 1,1952 0,9949 y = 1,0287x - 1,0792 0,9964 4 y = 1,0463x - 1,1163 0,9974 y = 1,0338x - 1,0522 0,9985 5 y = 1,0281x - 1,0338 0,9995 y = 1,0429x - 1,0883 0,9987
16
Gambar 17. Linearitas dengan perhitungan mengacu pada SNI (10-150 koloni) dengan 5 tingkat inokulum dilakukan 5 kali ulangan
Pengujian linearitas pada metode SNI dan ISO menghasilkan kurva linearitas yang proposional. Berdasarkan Gambar 17 dan 18 dapat dilihat linearitas kedua metode. Nilai linearitas pada Gambar 17 dinyatakan dalam y = ax + b dimana y adalah jumlah sel (log cfu/ml) dan x jumlah inokulum. Pada media PDA yang perhitungannya mengacu pada SNI diperoleh persamaaan y = 1,0283x - 1,0440 dan R2 = 0.9998. Linearitas DRBC pada perhitungan SNI y = y = 1,0192x - 1,0120 dan R2= 0.9995. Pada perhitungan menggunakan SNI nilai koefisien korelasi media PDA lebih tinggi dibandingkan dengan media DRBC.
Gambar 18. Linearitas dengan perhitungan mengacu pada ISO (<150 koloni) dengan 5 tingkat inokulum dilakukan 5 kali ulangan
Linearitas media PDA pada perhitungan ISO adalah y = 1.0031x-1.0325 dan R² = 0.9979. Linearitas media DRBC menggunakan perhitungan ISO y = 1,0100x-1,0299 dan R2= 0,9981. Nilai koefisien korelasi pada perhitungan SNI lebih kecil dibandingkan perhitungan ISO dikarenakan pada media ISO jumlah kapang yang dapat dihitung lebih besar (<150 koloni). Kedua metode masih dapat dikatakan linear jika nilai R² (koefisien kolerasi) mendekati 1. Linearitas perhitungan SNI dan ISO pada kedua metode dapat diterima karena memenuhi persyaratan. Nilai koefisien kolerasi yang memenuhi persyaratan adalah sebesar
17
LOD dan LOQ
Limit deteksi adalah jumlah konsentrasi terendah dari mikroorganisme yang dapat dideteksi yang masih memberikan respon yang signifikan. Batas deteksi merupakan parameter pada analisis dan merupakan kuantitas terkecil yang masih dapat memenuhi kriteria cermat dan seksama (Harmita 2004). Limit deteksi dapat juga ditentukan dengan persamaan linear. Persamaan liear yang diperoleh pada uji linearitas selanjutnya digunakan untuk menghitung limit deteksi.
Pada penentuan LOD dilakukan 6 kali ulangan dengan menambahkan tiga tingkatan terendah inokulum yaitu 3, 10, dan 30. Hasil penelitian menunjukkan pada konsentrasi terendah masih terdeteksi kapang khamir yang tumbuh yaitu 3cfu/gram.
Limit deteksi dapat juga ditentukan dengan menggunakan persamaan linear. Limit deteksi yang diperoleh dari perhitungan kurva linear adalah 2 cfu/gram untuk media PDA dan media DRBC. Nilai LOD yang didapatkan pada penelitian ini masih lebih baik dibandingkan dengan penelitian yang dilakukan oleh Alles et all. (2009) yang pada penelitiannya mendapatkan nilai LOD kapang dan khamir sebesar 10cfu/gram.
Selain limit deteksi, limit kuantifikasi (LOQ) juga merupakan parameter dalam validasi sekunder. Limit kuantifikasi adalah konsentrasi terendah dari mikroorganisme yang dapat ditentukan dengan tingkat presisi dan akurasi yang dapat diterima di bawah kondisi pengujian yang disepakati. Berdasarkan hasil penelitian nilai LOQ media PDA dan media DRBC adalah 4cfu/gram. Hal tersebut mengartikan bahwa jumlah kapang dan khamir yang terhitung di bawah nilai LOQ yang didapatkan memiliki akurasi dan presisi yang kurang baik.
Verifikasi Metode pada Produk Saos
Verifikasi sampel negatif dilakukan untuk mengetahui ada tidaknya kapang dan khamir pada saos. Verifikasi metode pengujian kapang dan khamir dilakukan dengan menggunakan 10 jenis saos dengan merk berbeda. Kapang dan khamir yang tumbuh pada saos dapat dilihat pada Gambar 19.
18
Hasil pengujian berbagai jenis saos yang ada di pasaran terdapat berbagai jenis kapang dan khamir yang tumbuh. Jumlah kapang khamir pada saos A, B, C, E, dan J masih memenuhi persyaratan karena jumlah koloni yang tumbuh pada saos tersebut masih memenuhi syarat mutu yaitu < 50 koloni/gr. Saos D, F, G, dan H tidak memenuhi syarat mutu karena jumlah koloni yang tumbuh >50 koloni/gr.
Salah satu parameter yang dalam verifikasi adalah RSD. Pada Tabel 9 dapat dilihat verifikasi dengan berbagai macam merk saos. Nilai RSD yang didapatkan dari hasil penelitian masih memenuhi persyaratan yaitu berkisar antara 0% -5.83%. Syarat RSD < 10% masih dapat terpenuhi oleh kedua metode yang diuji.
Tabel 9. Jumlah kultur yang tumbuh pada saos berbagai merk
Sampel Ulangan Media PDA Media DRBC
Log cfu/ml RSD(%) Log cfu/ml RSD(%)
apakah terdapat perbedaan nyata dengan α=5%. Analisi Uji T pada penelitian ini
19
et al. (1997) yang menyertakan hasil analisis kapang dan khamir pada tanaman
jali (barley) menggunakan media PDA dan DRBC tidak berbeda nyata. Namun penelitian tersebut tidak dengan menghitung jumlah kapang dan khamir yang tumbuh melainkan dengan dengan melihat ada atau tidaknya kapang dan khamir yang tumbuh pada kedua media.
Berdasarkan hasil verifikasi metode secara keseluruhan metode ISO memiliki hasil yang lebih baik dibandingkan dengan metode SNI. Hal tersebut didukung oleh hasil penelitian yang menunjukkan sebagian besar hasil perthitungan metode ISO memberikan jumlah koloni yang lebih tinggi dibandingkan dengan metode SNI. Hal tersebut dikarenakan dalam perhitungannya metode ISO lebih mudah dihitung karena koloni yang tumbuh pada media DRBC terlihat terpisah, tidak menyebar dikarenakan rose bengal yang terdapat di dalam media tersebut mampu menkan penyebaran koloni. Adanya warna yang berbeda antara koloni satu dan lainnya akan memudahkan perhitungan. Oleh karena itu, untuk perhitungan jumlah koloni disarankan untuk menggunakan metode ISO agar dihasilkan jumlah analisis yang lebih baik. Hal tersebut didukung dengan penelitian yang dilakukan oleh Alborch et al. (2012) yang menyatakan bahwa jumlah koloni kapang dan khamir yang ditumbuhkan menggunakan media DRBC lebih tinggi jumlahnya dibandingkan dengan jumlah kapang dan khamir yang ditumbuhkan pada media lainnya.
Penggunaan metode SNI memiliki keunggulan dari segi ekonomis dan lebih tahan terhadap cahaya. Namun, analisis menggunakan metode SNI memiliki kelemahan dalam hal perhitungan. Kapang dan khamir yang tumbuh pada media PDA penyebarannya tidak dapat ditekan sehingga koloni yang tumbuh akan saling bertumpuk dan sulit untuk dihitung. Selain itu PDA juga merupakan media yang tidak spesifik sehingga berbagai jenis mikroorganisme dapat tumbuh. Hal tersebut didukung dengan hasil penelitian Somashekar (2004) yang melakukan isolasi kapang dan khamir dari sampel tepung maizena dan kopi menggunakan media PDA. Mikroorgaisme yang tumbuh pada media PDA berbagai macam jenisnya namun sulit untuk diidentifikasi karena PDA bukan merupakan media selektif.
KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan
20
Saran
Pada penelitian ini digunakan kapang Rhizopus oligosporus dan khamir
Saccharomyces cerevisiae untuk penelitian selanjutnya adalah perlu dilakukan uji
dengan berbagai jenis kultur kapang dan khamir yang lain untuk dapat mengetahui tingkat selektifitas media terhadap masing-masing jenis kapang dan khamir. semiquantitative determination of yeast and mold in selected foods. Journal of AOAC International 92(5):1396-415.
[AOAC] Association of Analitycal Chemist. 1999. AOAC International Qualitative and Quantitative Microbiology Guidelines for Methods Validation. Journal of AOAC International vol. 62. No. 2 USA.
[BAM] Bacteriological Analitical Manual. 2001. Method for Detection of Enumeration of Yeast. AOAC Interbational 18th Edition. USA.
[BSN] Badan Standarisasi Nasional. 1992. SNI 01-2897-1992. Penentuan Mutu Mikrobiologi. Badan Standarisasi Nasional Indonesia.
[BSN] Badan Standarisasi Nasional. 2004. SNI 01-3546-2004. Saos Tomat. Badan Standarisasi Nasional Indonesia.
Harmita. 2004. Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode Dan Cara Perhitungannya. Majalah Ilmu Kefarmasian, Vol. I, No.3, Desember 2004, 117 – 135.
[ICH] International Conference on Harmonization. 1995. Validation of Analytical Procedurs: Definitions and Terminology. http://www.ich.org. [22 Juni 2013].
Indriati N and Heruwati ES. 2009. Molds Associated with Indonesian Traditional Fisheries Product. Indonesian Marine and Fisheries Product Processing and Biotechnology. Jakarta.
[ISO] 1614:2003. 2003. Microbiology of Food and Animal Feeding Stuffs-Protocol for the Validation of Alternative Methods. European Commitee for Standarization.
Leyva A, Quintana A, Sanchez M, Rodriquez EN, Cremata J, Sanchez JC. 2008. Method Development and Validation. Biologicals 36:134-141.
Rabie CJ, Lubben A., Marais GJ. Jansen H, International Journal of Food Microbiology 35 (1997) Il7- 127.
Ray Bibek. 2004. Third Edition Fundamental Food Microbiology. CRC Press. Washington DC.
21
Siregar CJP. 2007. Praktik Sistem Manajemen Laboratorium Pengujian yang Baik (Good Training Laboratory Managemen System Practice). Jakarta . Penertbit Buku Kedokteran EGP. Cetakan Pertama.
Somashekar D, Rati ER, Anand S, Chandrashekar A. 2004. Food Microbiology 21 (2004) 809–813.
22
LAMPIRAN
Lampiran 1. Biodata penulis
Rizqi Febrina, lahir di Pematangsiantar pada tanggal 16 Februari dari pasangan Bahri Tawar, SPd dan Sugiati, SE sebagai anak pertama dari dua bersaudara. Penulis menamatkan pendidikan jenjang TK di TK Al-Washliyah Pematangsiantar (1995), SD di SD Swasta Taman Siswa Pematangsintar (2001), jenjang SMP di SLTPN 4 Pematangsintar (2004), jenjang SMA di SMAN2 Pematangsintar (2007), dan jenjang S1 di Institut Pertanian Bogor dengan Mayor Ilmu dan Teknologi Pangan (ITP) (Approved by IFT) melalui jalur USMI dan mengambil beberapa mata kuliah supporting course (SC).
Selama mengikuti perkuliahan di IPB penulis aktif menjadi anggota Himpunan Mahasiswa Ilmu dan Teknologi Pangan (HIMITEPA), Ikatan Mahasiswa Muslim Asal Medan (IMMAM), dan Himpunan Mahasiswa Islam (HMI). Penulis menikuti beberapa kegiatan sebagai panitia dalam Lomba Cepat Tepat Ilmu Pangan (LCTIP), mengikuti seminar Pelatihan Sistem Managemen Halal (PLASMA), seminar Hazar Analysis Critical Control Point (HAACP). Penulis mengikuti beberapa kegiatanberupa pelatihan, kunjungan, seminar dan kepanitiaan seperti mengunjungi industri pengolahan pangan di wilayah Jawa Barat dan Jawa Tengah. Penulis telah mendapatkan sertifikat Good Laboratory
Practice dalam pelatihan GLP 2011. Tulisan yang pernah penulis hasilkan
bersama rekan-rekan sedisiplin ilmu antara lain Smiley Biscuit as Weaning Food
to Under Five Children’s Fe Deficiency in Developing Country (2011),
Industrialisasi dan Konsumsi Minuman Pala di Aceh Sebagai Minuman Pencegah Insomnia Pasca Gempa Tsunami (2011), dan Strategi Pengembanagan dan Pemasaran Produk “ALUTSA” Abon Berbasis Belut Dengan Variasi Rasa (2011). Penulis menyelesaikan tugas akhirnya dengan melakukan penelitian dengan
mengangkat judul “ Validasi Sekunder Metode Analisis Kapang dan Khamir pada
23
Lampiran 2 Rancangan validasi metode analisa
1. Validasi Metode Analisa
1.1Membuat 5 tingkatan untuk menentukan presisi, akurasi dan linearitas 1.1.1 Persiapan sampel 10 gram
1.1.2 Inokulasi kultur 0, 10, 100, 1000, 10.000 cfu/ml 1.1.3 Pemupukan pada 3 tingkat tertinggi duplo 1.1.4 Inkubasi 25°C selama 5 hari
1.2Membuat lima tingkatan untuk menentukan LOD dan LOQ 6.2.2 Persiapan sampel 10 gram
6.2.3 Inokulasi kultur 3, 10, 30 cfu/ml 6.2.4 Pemupukan duplo
6.2.5 Inkubasi 25°C selama 5 hari8
2. Perhitungan
2.1 Hitung koloni cawan petri.
2.1.1 Pilih cawan dengan jumlah koloni <150 koloni 7.1.2 Cara perhitungan :
N = ∑ C/ [(1 x n1) + (0,1 x n2) x d]
Dimana :
n1 = jumlah cawan pada pegenceran pertama n2 = jumlah cawan pada pegenceran kedua
d = pengenceran pada cawan pertama
∑ C = jumlah koloni pada cawan
N = jumlah koloni per ml atau gram
(log a1- log b1)/x1 = perbedaan relatif hasil logaritma duplo i = 1,2,3,...,n
24
