3 METODE
3.1 Waktu dan Lokasi Penelitian
Penelitian dilaksanakan pada bulan Juli hingga Desember 2010. Bahan baku diambil dari petani rumput laut di Kabupaten Kotawaringin Barat Kecamatan Kumai desa Teluk Bogam. Rumput laut asal bibit Kota Baru dan pulau Karimun dibudidayakan oleh petani secara berkelanjutan pada perairan tersebut. Bahan baku diambil sesuai dengan umur panen yang biasa mereka lakukan. Lokasi pengambilan sampel dapat dilihat pada Gambar 9.
Gambar 9 Lokasi budidaya rumput laut oleh petani.
Ekstraksi karagenan dilakukan di Laboratorium Biokimia Hasil Perairan Program Studi THP. Analisis karagenan meliputi kadar air, kadar abu, kadar abu tidak larut asam, sulfat, logam berat di Laboratorium Kimia Pangan Program Studi Ilmu dan Teknologi Pangan IPB. Analisis viskositas, kekuatan gel, titik jendal, titik leleh, dan derajat putih dilakukan di Laboratorium Pengolahan dan Biokimia Pangan dan Gizi Program Studi Ilmu dan Teknologi Pangan IPB. Pemeriksaan histologi terhadap jaringan rumput laut dilakukan di Laboratorium Mikroteknik Departemen Agronomi dan Hortikultura Fakultas Pertanian IPB, Balai Besar penelitian Veteriner Bogor, Laboratorium Histologi Fakultas Kadokteran Hewan.
3.2 Bahan dan Alat
Bahan utama yang digunakan dalam penelitian adalah rumput laut dewasa jenis Kappaphycus alvarezii asal bibit dari Kota Baru (Kalimantan Selatan) dan pulau Karimun. Kitosan berbentuk serbuk halus, NaOH, HCl, BaSO4, KCl,
BaCl2, akuades. Sedangkan alat-alat yang digunakan untuk proses ekstraksi
karagenan adalah blender, pirek, timbangan analitik, kompor listrik, oven pengering. Alat yang digunakan untuk analisis mutu karagenan adalah cawan porselin, desikator, labu erlenmeyer, gelas piala, oven, tanur, termometer, Viscometer Brookfield, dan Whitness meter. Bahan dan alat yang digunakan untuk analisis mikroskopis rumput laut adalah parafin, parafomaldehida, toulidin blue, alkohol, xylol, silet, scalpel, pinset, inkubator, bunsen, mikrotom, mikroskop, kamera.
3.3 Metode Penelitian
Metode yang digunakan pada pembuatan preparat rumput laut yaitu metode parafin yang selanjutnya jaringan diwarnai dengan toulidin blue. Sedangkan metode untuk memperoleh karagenan berdasarkan SNI 01-4498-1998 dan penggunaan NaOH digantikan dengan kitosan.
3.3.1 Pembuatan preparat jaringan rumput laut
Histologi diamati pada rumput laut segar dengan perlakuan daerah asal bibit (Kota Baru,pulau Karimun) dan umur panen yang berbeda (35, 45, 60 hari). Bagian rumput laut yang akan dianalisis adalah bagian thallus (batang). Analisis histologi diawali dengan pembuatan preparat rumput laut dan pengambilan gambar objek pada mikroskop. Pembuatan preparat rumput laut dimulai dengan memotong rumput laut dengan panjang ± 0,3 cm, dimasukkan ke dalam basket dan diberi label. Potongan rumput laut dimasukkan ke dalam larutan paraformaldehyda 4% selama 24 jam, tahapan ini disebut fiksasi. Selanjutnya yaitu tahap dehidrasi dengan memindahkan jaringan pada toples yang berisi alkohol bertingkat yaitu 70% 80%, 90%, 95% masing-masing selama 24 jam setelah itu dipindahkan ke absolut I, absolut II, absolut III, masing-masing selama 24 jam.
Penanaman jaringan dengan cara memasukkan ke dalam parafin I, II, III pada inkubator dengan suhu 65 oC masing-masing selama satu jam. Setelah jaringan dalam parafin membeku maka dipotong menjadi segi empat dan ditempelkan pada blok kayu, selanjutnya dipotong menggunakan mikrotom putar dengan ketebalan antara 5 µ setelah itu jaringan diaffixasi dan diinkubasi selama 24 jam kemudian preparat diwarnai dengan toulidine blue sebagai pewarna jaringan. Prosedur pewarnaan dapat dilihat pada Lampiran 4. Setelah diwarnai preparat difoto dengan cara menghubungkan kamera dengan mikroskop. Diagram alir pembuatan preparat dapat dilihat pada Gambar 10.
Gambar 10 Diagram alir pembuatan preparat rumput laut.
3.3.2 Karagenan dari Kappaphycus alvarezii
Rumput laut direndam dengan air selama 24 jam serta dipucatkan dengan NaOH 1% dan H2O2. Selanjutnya rumput laut dicuci pada air yang mengalir
sampai pH netral, kemudian diblender sampai homogen untuk memudahkan proses ekstraksi. Proses ekstraksi dilakukan pada suhu 90-100 oC selama 60 menit dengan perbandingan antara rumput laut kering dan akuades adalah 1:30. Ekstraksi dilakukan pada masing-masing umur panen dengan asal bibit serta penambahan kitosan berbeda dilakukan dua kali penyaringan supaya mengurangi jumlah residu sehingga dapat meningkatkan rendemen karagenan yang dihasilkan.
Rumput laut umur 30, 45 , 60 hari
Dipotong
± 0,3 cm Fiksasi 24 jam
Dehidrasi
Penjernihan
Penanaman pada parafin Pemotongan
Pewarnaan jaringan
Pada proses akhir dari ekstraksi, ditambahkan kitosan untuk proses pemurnian dengan konsentrasi 0,05%; 0,10% ; 0,15% selama 30 menit. Setelah itu dilakukan penyaringan untuk memisahkan karagenan dengan kitosan. Larutan karagenan dikeringkan di dalam oven selama 24 jam pada suhu 60 oC. Lembaran karagenan yang telah kering dihancurkan supaya menghasilkan tepung karagenan.
Pada penelitian ini dilakukan pengujian kadar air, kadar abu, kadar abu tidak larut asam pada rumput laut kering. Tepung karagenan diuji lebih lanjut dalam hal rendemen, kekuatan gel, kadar air, kadar abu, viskositas, kadar sulfat, titik jendal, titik leleh, logam berat. Diagram alir pembuatan karagenan dapat dilihat pada Gambar 11.
Rumput laut kering Asal bibit : • Kota Baru • Pulau Karimun Umur panen: • 30 hari • 45 hari • 60 hari
Perendaman dengan air, NaOH dan H2O2 selama 24 jam
Pencucian
Ekstraksi 1:30 (rumput laut: air) selama 2 jam pada suhu 90-95 oC
Penyaringan dengan kain balacu Pemotongan dengan blender
Filtrat Residu Ekstraksi II Filtrasi Penambahan kitosan 0,05%; 0,10%; 0,15%
Pemanasan 30 menit pada suhu 90 oC
Pemisahan kitosan dengan nilon mess Filtrat
Pengeringan selama 24 jam pada suhu 60 oC Tepung Karagenan
Gambar 11 Diagram alir penelitian.
Proksimat: • Kadar air • Kadar abu • Kadar abu tidak larut • Analisis kimia • Analisis fisika Analisis histologis
3.3.3 Analisis komposisi kimia rumput laut dan tepung karagenan
Bahan rumput laut yang digunakan adalah jenis Kappaphycus alvarezii yang merupakan spesies yang sama namun asal bibit berbeda pada masing-masing umur panen 30, 45, dan 60 hari. Dalam hal ini dilakukan analisa proksimat yaitu kadar air, kadar abu, kadar abu tidak larut asam pada rumput laut kering dan tepung karagenan yang digunakan. Selanjutnya dilakukan analisa fisik tepung karagenan yaitu rendemen, kekuatan gel, viskositas, titik jendal, titik leleh, derajat putih, kadar abu tidak larut asam, kadar sulfat, dan logam berat. Prosedur analisa terhadap rumput laut dan tepung karagenan yaitu sebagai berikut:
1. Rendemen (FMC Corp 1977)
Rendemen karagenan sebagai hasil ekstraksi dihitung berdasarkan rasio antara berat karagenan yang dihasilkan dengan berat rumput laut kering yang digunakan.
Rendemen (%) = berat karagenan kering
berat rumput laut kering x 100%
2. Kadar air metode oven “934.01 (AOAC 2005)
Sebanyak 2 gram sampel uji dikeringkan hingga berat konstan pada suhu 95-100 oC dibawah tekanan ≤ 100 mm Hg selama kurang lebih 5 jam. Aluminium yang memiliki tutup dengan diameter ≥ 50 mm dan dalam 40 mm. Kehilangan dalam pengeringan dilaporkan sebagai perkiraan kandungan kelembaban.
(b/b) kelembaban = 100 xberat hilang selama pengeringan (g) berat sampel uji
3. Kadar abu (AOAC 2005)
Analisis kadar abu yaitu untuk mengetahui jumlah abu yang terdapat pada suatu bahan terkait dengan mineral dari bahan yang dianalisis. Cawan abu porselin dipijarkan dalam tungku pengabuan bersuhu sekitar 650 oC selama 1 jam. Cawan abu porselin tersebut didinginkan selama 30 menit setelah suhu tungku turun menjadi sekitar 200 oC, dan dilakukan penimbangan. Sampel ditimbang sebanyak 1-2 gram dan dimasukkan ke dalam cawan abu porselin. Cawan tersebut dimasukkan ke dalam tungku secara bertahap hingga suhu 650 oC. Proses pengabuan dilakukan sampai abu berwarna putih. Setelah suhu tungku pengabuan
turun menjadi sekitar 200 oC, cawan abu porselin didinginkan selama 30 menit dan ditimbang beratnya.
% kadar abu
=
C‐AB‐A x 100% Keterangan: A = Berat cawan abu porselen kosong (gram)
B = Berat cawan abu porselen dengan rumput laut/ karagenan (gram)
C = Berat cawan abu porselen dengan rumput laut/ karagenan setelah dikeringkan (gram)
4. Kadar abu tidak larut asam (FMC Corp 1997)
Rumput laut yang telah diabukan dididihkan dengan 25 ml HCl 10% selama 5 menit. Bahan-bahan yang tidak terlarut disaring dengan menggunakan kertas saring tak berabu. Kertas saring diabukan dengan cara yang sama seperti di atas, lalu didinginkan dalam desikator untuk selanjutnya ditimbang. Kadar abu tidak larut asam dihitung dengan rumus:
Kadar abu tidak larut asam (%) = Berat abu
berat sampel x 100%
5. Kekuatan gel (Faridah et al. 2006)
Larutan karagenan 1,6% dan KCl 0,16% dipanaskan dalam bak air mendidih dengan pengadukan secara teratur sampai suhu 80 oC. Volume larutan dibuat
sekitar 50 ml. Larutan panas dimasukkan ke dalam cetakan berdiameter kira-kira 4 cm dan dibiarkan pada suhu 10 oC selama 2 jam. Gel dalam cetakan dimasukkan ke dalam alat ukur (curd tension meter) sehingga plunger yang akan bersentuhan dengan gel berada ditengahnya. Plunger diaktifkan dan dilakukan pengamatan. Pembacaan dilakukan pada saat pegas kembali. Perhitungan kekuatan gel adalah sebagai berikut:
Kekuatan gel (dyne/cm2) = F
S x 980 dyne/cm
2
Keterangan: F = tinggi kurva
S = luas permukaan sensing rod (cm2)
6. Viskositas (FMC Corp 1977)
Viskositas adalah pernyataan tahanan dari suatu cairan untuk mengalir. Satuan dari viskositas adalah poise (1 poise = 100 cP). Makin tinggi viskositas menandakan makin besarnya tahanan cairan yang bersangkutan. Larutan
karagenan dengan konsentrasi 1,5% dipanaskan dalam bak air mendidih sambil diaduk secara teratur sampai suhu mencapai 75 oC. Viskositas diukur dengan Viscometer Brookfield.
Spindel terlebih dahulu dipanaskan pada suhu 75 oC kemudian dipasang ke alat ukur viscometer Brookfield. Posisi spindel dalam larutan panas diatur sampai tepat, viskometer dihidupkan dan suhu larutan diukur. Ketika suhu larutan mencapai 75 oC dan nilai viskositas diketahui dengan pembacaan viskosimeter pada skala 1 sampai 100. Pembacaan dilakukan setelah satu menit putaran penuh 2 kali untuk spindle no 1.
7. Titik jendal dan titik leleh (Suryaningrum dan Utomo 2002)
Larutan karagenan dengan konsentrasi 6,67% (b/b) disiapkan dengan akuades dalam gelas ukur volume 15 ml. Suhu sampel diturunkan secara perlahan-lahan dengan cara menempatkan pada wadah yang telah diberi pecahan es. Titik jendal diukur pada saat larutan karagenan mulai membentuk gel dengan menggunakan thermometer digital.
Larutan karagenan dengan konsentrasi 6,67% (b/b) disiapkan dengan akuades. Sampel diinkubasi pada suhu 10 oC selama ± 2 jam. Pengukuran titik leleh dilakukan dengan cara memanaskan gel karagenan dalam waterbath. Di atas gel karagenan tersebut diletakkan gotri dan ketika gotri jatuh ke dasar gel karagenan maka suhu tersebut dinyatakan sebagai titik leleh karagenan.
8. Derajat putih (Faridah et al. 2006)
Alat yang digunakan adalah Whiteness meter. Contoh sebanyak 3 gram, ditempatkan dalam satu wadah tertentu. Sebelumnya alat sudah disiapkan dan dihidupkan, standar petunjuk harus berada dalam posisi nol. Filter yang dapat digunakan ada tiga macam yaitu: biru, hijau dan merah dengan panjang gelombang masing-masing secara berurutan 425 nm, 550 nm, dan 520 nm. Perlakukan ini dapat diulang beberapa kali sampai mendapatkan nilai rata-rata yang tepat.
9. Kadar sulfat (FMC Corp.1997)
Prinsip yang dipergunakan adalah gugus sulfat yang telah ditimbang dan dihidrolisa diendapkan sebagai BaSO4. Contoh sebanyak 1 gram ditimbang dan
dimasukkan ke dalam labu erlemeyer yang ditambahkan 50 ml HCl 0,2 N kemudian direfluks sampai mendidih selama 6 jam sampai larutan menjadi jernih. Larutan ini dipindahkan ke dalam gelas piala dan dipanaskan sampai mendidih. Selanjutnya ditambahkan 10 ml larutan BaCl2 di atas penangas air selama 2 jam.
Endapan yang terbentuk disaring dengan kertas saring tak berabu dan dicuci dengan akuades mendidih hingga bebas klorida. Kertas saring dikeringkan ke dalam oven pengering, kemudian diabukan pada suhu 1000 oC sampai diperoleh abu berwarna putih. Abu didinginkan dalam desikator kemudian ditimbang. Perhitungan kadar sulfat adalah sebagai berikut :
Kadar sulfat (%) = P ,
B x 100%
Keterangan: 0,4116 = Masa atom relatif SO4 dibagi dengan massa atom relatif
BaSO2
p = Berat endapan BaSO4 (g)
10. Logam berat (Apriyantono et al. 1989)
Prinsip yang digunakan adalah penghilangan bahan-bahan organik dengan pengabuan kering, residu dilarutkan dalam asam encer. Larutan disebarkan dalam nyala api yang ada di dalam alat AAS sehingga absorpsi atau emisi logam dapat dianalisis dan diukur pada panjang gelombang. Kandungan logam berat yang ingin dianalisis adalah Pb, Zn, Cu dan As menggunakan Spektrofotometer Absorpsi Atom (AAS).
Prosedurnya sebanyak 5-6 ml HCl 6 N ditambahkan ke dalam cawan berisi abu, kemudian dipanaskan di atas hot plate (pemanas) dengan pemanasan rendah sampai kering. Setelah itu ditambahkan 15 HCl 3 N, lalu cawan dipanaskan di atas pemanas sampai mulai mendidih. Setelah didinginkan dan disaring, filrat dimasukkan ke dalam labu takar yang sesuai. Padatan tertinggal diusahakan sebanyak mungkin dalam cawan dan diencerkan dengan air sampai tanda tera. Blanko disiapkan menggunakan pereaksi yang sama.
Alat AAS diset sesuai petunjuk dalam manual alat tersebut. Larutan standar logam, blanko dan larutan sampel diukur. Selama penetapan sampel, dilakukan pemeriksaan apakah nilai standar tetap konstan, kemudian dibuat kurva standar untuk masing-masing logam (nilai absorbsi/emisi vs konsentrasi logam dalam μg/ml).
3.4 Rancangan Percobaan
Rancangan percobaan yang digunakan pada penelitian ini adalah rancangan acak lengkap tiga faktor yaitu asal bibit (Kota Baru, pulau Karimun) sebagai faktor pertama, faktor kedua adalah umur panen (30, 45 dan 60 hari), serta penamabahan kitosan (0,05%;0,10%;0,15%) sebagai faktor ketiga. Setiap perlakuan diulang sebanyak 3 kali. Data hasil pengamatan diolah dengan analisis ragam dan apabila berbeda nyata dilanjutkan dengan Uji Beda Berjarak Duncan (Steel dan Torie 1993). Data diolah dengan program SPSS 16 pada tingkat kepercayaan 95%.
Faktor asal bibit (A) A1 : Kota Baru A2 : Pulau Karimun Faktor umur panen (B)
B1 : Umur panen 30 hari B2 : Umur panen 45 hari B3 : Umur panen 60 hari Faktor penambahan kitosan (C)
C1 : 0,05% C2 : 0,10% C3 : 0,15%
Data hasil pengamatan diolah dengan analisis ragam dan dilanjutkan dengan Uji Beda Jarak berganda Duncun (Steel dan Torrie 1993). Data diolah dengan program SPSS 16 pada tingkat kepercayaan 95%. Model rancangan yang digunakan yaitu sebagai berikut:
Yikjl= μ + Ai + Bj +Ck + ABij + ACik+ ABCijk + €ijkl
Dimana :
Yikjl = Nilai pengamatan pada faktor A taraf ke-I, faktor B ke j, faktor C ke-k,
dan ulangan ke-l μ = Nilai tengah umum
Ai = pengaruh asal bibit taraf ke I (i= Kota Baru dan pulau Karimun).
Bj = pengaruh umur panen taraf ke-j (j=30,45, dan 60 hari)
Ck = pengaruh konsentrasi kitosan taraf ke-k (k=0,05%;0,10%;0,15%)
ABCijk = pengaruh interaksi antara asal bibit taraf ke-I, umur panen taraf ke-j,
dan konsentrasi kitosan taraf ke-k.
