UJI MUTAGEN (AMES TEST)

UJI MUTAGEN

(AMES TEST)

Marlia Singgih Wibowo

Pendahuluan

‡ Lingkungan di sekitar kita banyak mengandung senyawa

karsinogen (cancer-causing agents) misalnya sinar UV, polutan industri, pestisida, food additives dan produk tobacco

‡ Analisis terhadap berbagai senyawa kimia yang makin hari

semakin banyak digunakan, menjadi perhatian utama peneliti toksikologi, karena kecurigaan terhadap

kemungkinan bahaya kanker yang mungkin diakibatkan oleh senyawa tersebut.

‡ Senyawa karsinogen ini dapat menginduksi kanker karena

mereka bersifat mutagen (dapat menyebabkan mutasi, yang dapat mengubah susunan DNA

MUTAGEN

‡ Mutagen adalah zat atau senyawa yang dapat

meningkatkan laju perubahan di dalam gen. Mutasi (perubahan) dapat mempengaruhi

reproduksi sel, bahkan kadangkala menyebabkan kerusakan sel atau pertumbuhan sel yang tidak terkendali

‡ Beberapa contoh mutagen, antara lain senyawa

kimia mustard, etil metil sulfonat, sinar uv, radiasi sinar x, dll.

Beda MUTAGEN dan KARSINOGEN

Karsinogen menyebabkan KANKER

Mutagen menyebabkan MUTASI, tidak selalu menyebabkan KANKER

Klasifikasi senyawa karsinogen menurut

aktivitasnya dalam tahapan karsinogenesis

„ Initiating agent (incomplete carcinogen) :

Senyawa kimia yang hanya menginisiasi sel

„ Promoting agent : senyawa yang

menyebabkan ekspansi sel yang terinisiasi

„ Progressor agent : senyawa yang dapat

mengubah sel yang terinisiasi atau sel yang ada dalam tahap promosi menjadi sel yang berpotensi menjadi sel kanker

„ Karsinogen lengkap (complete carcinogen) :

senyawa yang mampu menginduksi kanker dari sel normal, biasanya memiliki sifat

Epidemiologi karsinogenesis

‡

epidemiologi adalah studi tentang

distribusi dan determinan penyakit

melalui observasi terhadap eksperimen

yang terkontrol.

‡

Observasi atau pengamatan termasuk :

„ pengamatan episodik

„ pengamatan retrospektif „ pengamatan prospektif

Hubungan faktor karsinogenik dengan

kanker yang terjadi

Penyebab senyawa karsinogen

Kemungkinan kanker yang dapat terjadi

Bukti karsinogenitas

Minuman beralkohol Esophagus, hati, orofaring, laring Cukup aflatoksin Hati cukup Makanan (lemak, protein, kalori) Payudara, kolon, endometrium, kemih cukup merokok Mulut, faring, laring, paru-paru,

esophagus, kemih

cukup Senyawa pengalkil Kemih, leukemia cukup Senyawa arsen Kulit, hati cukup Kloramfenikol leukemia terbatas Estrogen premonopause Sel hati cukup Estrogen postmonopause Endometrium Terbatas

Penyebab kematian karena kanker

‡ Makanan : 35% ‡ Rokok : 30% ‡ Infeksi : 10% ‡ Perilaku seksual : 7% ‡ Pekerjaan : 4% ‡ Faktor geofisik : 3% ‡ Alkohol : 3% ‡ Polusi : 2% ‡ Produk industri < 1%

Uji senyawa karsinogen

‡ Uji jangka pendek (short-term test) :

dikembangkan untuk mengidentifikasi senyawa karsinogenik yang berpotensi atas dasar

kapasitasnya untuk menginduksi mutasi pada DNA di dalam sel secara in-vitro atau in-vivo. Contoh test : Ames test. Pada Ames test,

digunakan mikroba Salmonella typhimurium. Selain uji mutasi bakteri, ada pula uji mutasi sel mamalia secara in-vitro, uji mutasi gen secara in-vivo menggunakan mencit, uji kerusakan DNA secara in-vitro.

‡ Uji jangka menengah : uji kronis 1 tahun : Uji

menggunakan 50 ekor tikus

‡ Uji jangka panjang : uji kronis 2 tahun : Multi

AMES Test

• Ames test adalah uji untuk menentukan apakah suatu senyawa adalah mutagen. Nama test ini diambil dari nama penemunya yaitu Bruce Ames. Bruce Ames dkk pada tahun 1970an menemukan suatu metode uji dengan menggunakan bakteri khusus yang sangat sensitif terhadap senyawa2 mutagen

• Penggunaan Ames test adalah berdasarkan asumsi bahwa setiap senyawa yang bersifat mutagenik terhadap bakteri yang digunakan, dapat berubah menjadi karsinogen yang dapat menyebabkan kanker

• The Food and Drug Administration (FDA)

USA saat ini menggunakan metode yg

dikembangkan

Ames untuk

menapis

senyawa2 kimia secara cepat dan murah

• Walaupun demikian, pada kenyataannya,

beberapa senyawa yang menyebabkan

kanker pada hewan percobaan (misalnya

dioksin) tidak menunjukkan positif pada

Ames test (atau kebalikannya)

Ames test sangat murah dan mudah,

sehingga banyak yang beranggapan

bahwa test ini tidaklah valid

Bakteri yang digunakan : Galur

mutan

Salmonella typhimurium

Mengapa menggunakan galur mutan?

‡ Biakan induk (Wild-type) dari Salmonella

typhimurium dapat tumbuh dalam media tanpa

penambahan asam amino. Hal ini dimungkinkan karena mereka membuat asam amino mereka sendiri dengan jalur biosintesis yang berbeda2

‡ Pada mutan Salmonella typhimurium , tidak

dapat tumbuh tanpa asam amino histidin karena mutasi ditujukan pada gen yang mengkode salah satu dari 9 enzim yang digunakan pada jalur

.

Oleh karena itu, mutan Ames hanya akan tumbuh bila ada histidin di dalam medium pertumbuhan karena mutan tersebut tidak dapat mensintesis sendiri histidin tersebut. Mutan ini adalah mutan auxotroph yang disebut mutan histidinedependent or his -(baca : hiss-minus)

‡

Mutan auxotroph yang berinteraksi

dengan senyawa sample , berubah

menjadi prototroph

‡

Mutan prototroph dapat tumbuh baik

Contoh Ames test untuk uji kualitatif

‡ Suatu suspensi biakan Salmonella

typhimurium galur histidine-requiring (his−) ditumbuhkan dalam pelat agar yang

mengandung campuran rat liver enzymes yang tidak mengandung histidin

‡ Sebuah filter paper di impregnasi dengan 10µg 2-aminofluorene, suatu karsinogen. Efek mutagenik senyawa ini dapat menyebabkan bakteri tersebut memperoleh kembali kemampuannya untuk

tumbuh walaupun di dalam media tidak ada histidinnya. Hal ini

menyebabkan tumbuhnya koloni bakteri disekitar disk filter paper.

Mengapa medium untuk Ames test

ditambahkan ekstrak hati (liver extract)?

‡ Banyak senyawa kimia tidak bersifat mutagen

atau karsinogen, tetapi dapat berubah menjadi mutagen atau karsinogen setelah dimetabolisme di dalam tubuh (hati)

‡ Bakteri uji adalah mikroba prokaryot, sedangkan

manusia adalah eukaryot, oleh karena itu perlu ditambahkan campuran enzim2 hati organisme eukaryot (dalam hal ini hati tikus)

Bagaimana menghitung hasil

Ames test ?

‡

Jumlah koloni bakteri yang tumbuh

merupakan ukuran aktivitas mutagenik

(potensi) dari senyawa yang digunakan

‡

Angka ini biasanya merepresentasikan

jumlah revertants (bakteri yang

termutasi) per mikrogram of mutagen

atau per gram sampel yang mengandung

mutagen

Koreksi terhadap hasil Ames test

‡ Pada umumnya mutasi spontan terjadi pada awal

pembiakan bakteri dalam medium yang tidak mengandung histidin

‡ Hal ini perlu diperhitungkan sebelum menguji

senyawa kimia yang dianalisis.

‡ Pada awal pengujian ditumbuhkan 108 sel

bakteri, maka setelah beberapa waktu dihitung jumlah bakteri yang tumbuh, dan angka ini

digunakan untuk pengurangan jumlah bakteri yang memang termutasi oleh senyawa kimia.

‡ Dengan cawan petri terpisah, baru dilakukan uji

mutagen dengan menggunakan senyawa kimia yang diuji di dalam media yang ditambahkan campuran enzim hati tikus

‡ Biakan selanjutnya diinkubasi pada suhu 37°C

selama 48 jam di tempat gelap

‡ Jumlah koloni yang terbentuk menunjukkan

revertans yang terbentuk yang sebanding dengan potensi senyawa mutagen

Galur mutan

Salmonella typhimurium

‡ Galur mutan dari Salmonella typhimurium

yang digunakan dalam Ames test memiliki sensitivitas yang berbeda-beda

‡ Galur TA 1535 memiliki satu substitusi basa yang

menyebabkan missense mutation di dalam gen yang mengkode enzim pertama dalam sintesis histidin. Enzim yang dimiliki mutan mengandung proline sementara biakan induk mengandung

leucine

‡ Galur TA 100 mirip dengan 1535, tetapi dapat

‡

Galur lain yang digunakan misalnya galur

yang mengalami mutasi yang

berbeda-beda ( bisa frameshift, missense atau

nonsense), pada operon histidin

‡

Beberapa galur yang digunakan juga

termutasi pada uvrB, rfa , yang berakibat

meningkatkan permeabilitas sel terhadap

senyawa kimia tertentu

PROSEDUR

Ekstrak homogenate rat liver (S9) dicampur dengan strain dari bakteri his-. Dengan tidak adanya

histidin, bakteri tidak dapat tumbuh di dalam medium minimum (control).

Pada saat bakteri dicampur dengan bahan yang diduga mutagen (X), terbentuknya revertant colonies menunjukkan bahwa beberapa his

-bacteria telah termutasi (reverted) menjadi his+

dan dapat disimpulkan bahwa senyawa X adalah suatu mutagen.

‡ Jumlah koloni yang dihasilkan

setara dengan besarnya efisiensi mutagen

mengembalikan sifat mutan ke asalnya

‡ Suatu mutagen A

menghasilkan jumlah

revertans yang lebih tinggi dari kontrol, berarti mutagen A adalah betul-betul mutagen dan mungkin suatu

karsinogen.

‡ Suatu mutagen B tidak

menghasilkan jumlah

revetans lebih banyak dari kontrol, maka dapat

dikatakan bahwa senyawa B bukanlah suatu mutagen.

Metode lain untuk uji mutagen

‡ Menggunakan mencit transgenik yang

disuntikkan dengan senyawa kimia (kandidat mutagen)

‡ DNA dari jaringan tertentu diisolasi lalu disisipkan

dalam bakteriofaga, lalu ditransformasikan ke dalam E.coli

‡ E.coli ditumbuhkan dalam medium tertentu, dan

dihitung frekuensi mutasi berdasarkan

perbandingan jumlah koloni yang berwarna terhadap yang tidak berwarna