UJI MUTAGEN
(AMES TEST)
Marlia Singgih Wibowo
Pendahuluan
Lingkungan di sekitar kita banyak mengandung senyawa karsinogen (cancer-causing agents) misalnya sinar UV, polutan industri, pestisida, food additives dan produk tobacco
Analisis terhadap berbagai senyawa kimia yang makin hari semakin banyak digunakan, menjadi perhatian
utama peneliti toksikologi, karena kecurigaan terhadap kemungkinan bahaya kanker yang mungkin diakibatkan oleh senyawa tersebut.
Senyawa karsinogen ini dapat menginduksi kanker
karena mereka bersifat mutagen (dapat menyebabkan mutasi, yang dapat mengubah susunan DNA
MUTAGEN
Mutagen adalah zat atau senyawa yang dapat
meningkatkan laju perubahan di dalam gen. Mutasi (perubahan) dapat mempengaruhi reproduksi sel,
bahkan kadangkala menyebabkan kerusakan sel atau pertumbuhan sel yang tidak terkendali
Beberapa contoh mutagen, antara lain senyawa kimia mustard, etil metil sulfonat, sinar uv, radiasi sinar x, dll.
Beda MUTAGEN dan KARSINOGEN
Karsinogen
menyebabkan KANKER
Mutagen
menyebabkan MUTASI,
tidak selalu menyebabkan
KANKER
Uji senyawa karsinogen
Uji jangka pendek (short-term test) : dikembangkan
untuk mengidentifikasi senyawa karsinogenik yang
berpotensi atas dasar kapasitasnya untuk menginduksi mutasi pada DNA di dalam sel secara vitro atau in-vivo. Contoh test : Ames test. Pada Ames test,
digunakan mikroba Salmonella typhimurium. Selain uji
mutasi bakteri, ada pula uji mutasi sel mamalia secara in-vitro, uji mutasi gen secara in-vivo menggunakan mencit, uji kerusakan DNA secara in-vitro.
Uji jangka menengah : uji kronis 1 tahun : Uji
menggunakan 50 ekor tikus
Uji jangka panjang : uji kronis 2 tahun : Multi stage
AMES Test
• Ames test adalah uji untuk menentukan apakah suatu senyawa adalah mutagen. Nama test ini diambil dari nama penemunya yaitu Bruce Ames. Bruce Ames dkk pada tahun 1970an menemukan suatu metode uji dengan menggunakan bakteri khusus yang sangat sensitif terhadap senyawa2 mutagen
• Penggunaan Ames test adalah berdasarkan asumsi bahwa setiap senyawa yang bersifat mutagenik terhadap bakteri yang digunakan, dapat berubah menjadi karsinogen yang dapat menyebabkan kanker
• The Food and Drug Administration (FDA) USA saat ini menggunakan metode yg dikembangkan Ames untuk menapis senyawa2 kimia secara cepat dan murah
• Walaupun demikian, pada kenyataannya, beberapa senyawa yang menyebabkan kanker pada hewan percobaan (misalnya dioksin) tidak menunjukkan positif pada Ames test (atau kebalikannya)
Mikroba uji yang digunakan dalam Ames test adalah
Mengapa menggunakan galur mutan?
Biakan induk (Wild-type) dari Salmonella typhimurium dapat tumbuh dalam media tanpa penambahan asam amino. Hal ini dimungkinkan karena mereka membuat asam amino mereka sendiri dengan jalur biosintesis yang berbeda2
Pada mutan Salmonella typhimurium , tidak dapat tumbuh tanpa asam amino histidin karena mutasi
ditujukan pada gen yang mengkode salah satu dari 9 enzim yang digunakan pada jalur biosintesis histidin
.
Oleh karena itu, mutan Ames hanya akan tumbuh bila ada histidin di dalam medium pertumbuhan karena mutan tersebut tidak dapat mensintesis sendiri histidin tersebut. Mutan ini adalah mutan auxotroph yang disebut mutan histidinedependent or his -(baca : hiss-minus)
Mutan auxotroph
Mutan auxotroph adalah mutan yang tidak dapat
mensintesis salah satu molekul organik yang diperlukan untuk pertumbuhannya.
Dalam uji ames, bila mutan auxotroph ini berinteraksi dengan senyawa sample , lalu berubah menjadi
prototroph
Mutan prototroph kembali memiliki kemampuan
mensintesis histidin, sehingga dapat tumbuh baik dalam media tanpa histidin
Contoh Ames test untuk uji kualitatif
Suatu suspensi biakan Salmonella typhimurium galur
histidine-requiring (his−) ditumbuhkan dalam pelat agar yang
mengandung campuran rat liver enzymes yang tidak mengandung histidin
Sebuah filter paper di impregnasi dengan 10µg 2-aminofluorene, suatu karsinogen. Efek mutagenik senyawa ini dapat menyebabkan bakteri tersebut memperoleh
kembali kemampuannya untuk tumbuh walaupun di dalam media tidak ada histidinnya. Hal ini
menyebabkan tumbuhnya koloni bakteri disekitar disk filter paper.
Mengapa medium untuk Ames test
ditambahkan ekstrak hati (liver extract = S9)?
Banyak senyawa kimia tidak bersifat mutagen atau
karsinogen, tetapi dapat berubah menjadi mutagen atau karsinogen setelah dimetabolisme di dalam tubuh (hati)
Bakteri uji adalah mikroba prokaryot, sedangkan manusia adalah eukaryot, oleh karena itu perlu
ditambahkan campuran enzim2 hati organisme eukaryot (dalam hal ini hati tikus)
Bagaimana menghitung hasil
Ames test ?
Jumlah koloni bakteri yang tumbuh merupakan ukuran aktivitas mutagenik (potensi) dari senyawa yang
digunakan
Angka ini biasanya merepresentasikan jumlah revertants (bakteri yang termutasi) per mikrogram of mutagen atau per gram sampel yang mengandung mutagen
Koreksi terhadap hasil Ames test
Pada umumnya mutasi spontan terjadi pada awal pembiakan bakteri dalam medium yang tidak
mengandung histidin
Hal ini perlu diperhitungkan sebelum menguji senyawa kimia yang dianalisis.
Pada awal pengujian ditumbuhkan 108 sel bakteri, maka
setelah beberapa waktu dihitung jumlah bakteri yang tumbuh, dan angka ini digunakan untuk pengurangan jumlah bakteri yang memang termutasi oleh senyawa kimia.
Dengan cawan petri terpisah, baru dilakukan uji mutagen dengan menggunakan senyawa kimia yang diuji di
dalam media yang ditambahkan campuran enzim hati tikus
Biakan selanjutnya diinkubasi pada suhu 37°C selama 48 jam di tempat gelap
Jumlah koloni yang terbentuk menunjukkan revertans yang terbentuk yang sebanding dengan potensi
Galur mutan Salmonella typhimurium
Galur mutan dari Salmonella typhimurium yang
digunakan dalam Ames test memiliki sensitivitas yang berbeda-beda
Galur TA 1535 memiliki satu substitusi basa yang
menyebabkan missense mutation di dalam gen yang
mengkode enzim pertama dalam sintesis histidin. Enzim yang dimiliki mutan mengandung proline sementara
biakan induk mengandung leucine
Galur TA 100 mirip dengan 1535, tetapi dapat mendeteksi jenis-jenis mutagen yang berbeda
Galur lain yang digunakan misalnya galur yang
mengalami mutasi yang berbeda-beda ( bisa frameshift, missense atau nonsense), pada operon histidin
Beberapa galur yang digunakan juga termutasi pada
uvrB, rfa , yang berakibat meningkatkan permeabilitas
PROSEDUR
Ekstrak homogenate rat liver (S9) dicampur dengan strain dari bakteri his-. Dengan tidak adanya histidin, bakteri
tidak dapat tumbuh di dalam medium minimum (control). Pada saat bakteri dicampur dengan bahan yang diduga
mutagen (X), terbentuknya revertant colonies
menunjukkan bahwa beberapa his- bacteria telah
termutasi (reverted) menjadi his+ dan dapat disimpulkan
Jumlah koloni yang dihasilkan setara dengan besarnya
efisiensi mutagen
mengembalikan sifat mutan ke asalnya
Suatu mutagen A menghasilkan jumlah revertans yang lebih
tinggi dari kontrol, berarti mutagen A adalah betul-betul mutagen dan mungkin suatu karsinogen.
Suatu mutagen B tidak
menghasilkan jumlah revetans lebih banyak dari kontrol, maka dapat dikatakan bahwa
senyawa B bukanlah suatu mutagen.
Interpretasi hasil
A mutagenic potential of a test item is assumed if the mutant frequency is 2.0 or higher. A dose effect
relationship could underline this conclusion.
A possible mutagenic potential is assumed if the
quotient ranges between 1.7 to 1.9 in combination with a dose effect relationship.
No mutagenic potential is assumed if all quotients range between 1.0 (or lower) to 1.6.
A nonexistent dose effect relationship could underline this conclusion
Mutagenicity Test
based on National Toxicology
Program - USA
Marlia Singgih Wibowo School of Pharmacy ITB
Salmonella or E.coli test
Menguji chemicals akan kemampuan mutagenicity pada
Salmonella typhimurium atau Escherichia coli dilakukan
berdasarkan anggapan bahwa senyawa yang bersifat mutagenic pada bacteri tersebut, berpeluang menjadi carcinogen pada hewan, dan selanjutnya kemungkinan berpotensi pula menjadi penyebab kanker pada manusia
Walaupun kira-kira ¾ senyawa kimia yang beredar saat ini di dunia, menunjukkan reaksi positive pada Ames test dan merupakan rodent carcinogens, namun tidak
semuanya menyebabkan kanker pada manusia
Namun metode Ames test penting dilakukan untuk
skrining awal senyawa-senyawa yang akan digunakan dalam pengobatan manusia.
Galur mikroba yang digunakan
Beberapa strain S. typhimurium dapat
digunakan antara lain : TA97, TA98, TA100,
TA102, TA104, TA1535, TA1537, and TA1538.
Escherichia coli strain WP2 uvrA pKM101 . This
E. coli
strain is similar in mutagen detection to S.
typhimurium
strain TA102
Mikroba uji
(Prof.Lynn Ferguson, Univ.Auckland)
This test can capture frame-shift mutagens
(through S. typhimurium strain TA98 and TA1537),
base-pair-substitution mutagens (through strain S.
typhimurium TA100) or mutagens which act
through the production of oxygen radicals (through
strain S. typhimurium TA102). We maintain
different strains of Salmonella typhimurium for this
assay and the test is carried out according to the
OECD guidelines for Testing of Chemicals No.471
(adopted since 21st July 1997).
Seluruh bakteri yang digunakan dalam Ames
test membawa defective (mutant) gene yang
membuat nya tidak mampu mensintesis
essential amino acid histidine jadi mereka hanya
survive dan tumbuh pada medium yang
mengandung excess histidine.
Dengan adanya mutagenic chemical, defective
histidine gene mampu termutasi balik sehingga
mampu mensintesis histidinnya kembali
Efek ini, yang memperoleh kemampuannya
kembali (regaining of normal activity or function),
disebut "reverse" mutations dan process nya
disebut "reversion."
Mutant colonies nya,disebut "revertants."
Ada mutagenicity assay lain yang menggunakan
sel type yang lain yang mengukur "forward"
mutations, yaitu mutation yang memperbaiki
fungsi gene nya, yang tadinya tidak mampu
dilakukan (causes a loss, rather than a gain, of
function.)
Standard Procedure
(National Toxicology Program)
In the Ames assay, a test tube containing a suspension of one strain of Salmonella typhimurium (or E. coli) plus S9 mix or plain buffer without S9, is incubated for 20 minutes at 37º C with the test chemical.
Control cultures, with all the same ingredients except the test chemical, are also incubated.
In addition, positive control cultures are prepared; these contain the particular bacterial tester strain under
investigation, the various culture ingredients, and a known potent mutagen*.
After 20 minutes, agar is added to the cultures and the contents of the tubes are thoroughly mixed and poured onto the surface of petri dishes containing standard
The plates are incubated, and bacterial colonies
that do not require an excess of supplemental
histidine appear and grow. These colonies are
comprised of bacteria that have undergone
reverse mutation to restore function of the
histidine-manufacturing gene. The number of
colonies is usually counted after 2 days.
Mutasi spontan
Spontaneous mutations (those that occur by chance, not by chemical treatment) will appear as colonies on the
control petri dishes.
If the test chemical was mutagenic to any particular
strain of bacterium, the number of histidine-independent colonies arising on those plates will be significantly
greater than the corresponding control plates for that strain of bacteria.
The positive control plates are also counted, and the number of mutant colonies appearing on them must be significantly increased over the spontaneous control number for the test to be considered valid.
Failure of the positive control chemical to induce mutation is reason to discard the experiment.
Interpretasi hasil
Several doses (usually at least 5) of each test chemical and multiple strains of bacteria are used in each experiment.
In addition, cultures are set up with and without added liver S9 enzymes at varying concentrations.
Therefore, a variety of culture conditions are employed to maximize the opportunity to detect a mutagenic chemical.
In analyzing the data, the pattern and the strength of the mutant
response are taken into account in determining the mutagenicity of a chemical.
All observed responses are verified in repeat tests. If no increase in mutant colonies is seen after testing several strains under several different culture conditions, the test chemical is considered to be nonmutagenic in the Ames test.
Kontrol positif
For strains tested in the absence of S9
TA98, 2-nitrofluorene or alternatively,
TA98 and TA1538, 4-nitro-o-phenylenediamine
TA100 and TA1535, sodium azide
TA97 and TA1537, 9-aminoacridine
TA102, mitomycin C
TA104, methyl methanesulfonate
E.coli WP2 uvrA pKM101, methyl methanesulfonate
For strains tested with S9
All strains, 2-aminoanthracene (or occasionally, sterigmatocystin)
Reference
Mortelmans K, Zeiger E. The Ames
Salmonella
/microsome mutagenicity
assay. Mutat Res. 2000 Nov 20;455
(1-2):29-60.
Cytochrome P450 2E1 (CYP2E1) is a heme
monooxygenase that is involved in the metabolic
activation of nitrosamines to electrophilic species that can react with DNA, resulting in DNA damage and
mutation.1 CYP2E1 is also responsible for the oxidation
of many small lipophilic compounds, including many solvents and environmental contaminants.2 This
enzyme is one of many cytochromes P450 found
primarily in the liver, but also in other tissues including the lungs and kidneys. The enzyme is found on the
endoplasmic reticulum of the cell along with cytochrome P450 reductase, its obligate electron donor protein.
