UNESA Journal of Chemistry Vol.5 No.1 January 2016
PENENTUAN pH DAN SUHU OPTIMUM ENZIM PROTEASE DARI ISOLAT
ST-30 YANG DIHASILKAN DARI SINGGAHAN, TUBAN
DETERMINATION OF pH AND TEMPERATURE OPTIMUM PROTEASE
ENZYME OF ST-30 ISOLATE RESULTING FROM HOT SPRING
SINGGAHAN, TUBAN
Nur Chalim Maulidah* dan Nuniek Herdyastuti
Departement of Chemistry, Faculty of Mathematic and Natural Sciences State University of Surabaya
Jl. Ketintang Surabaya (60231), Telp. 031-8299761 *Corresponding author, email: maulidah.nurchalim@gmail.com
Abstrak.Telah dilakukan penelitian yang bertujuan untuk menentukan pH dan suhu optimum enzim protease
dari isolat ST-30 yang dihasilkan dari sumber air panas Singgahan, Tuban. Penentuan pH dan suhu optimum berdasarkan aktivitas enzim protease yang dilakukan setelah melalui tahap pemurnian parsial menggunakan amonium sulfat dengan fraksi 0-35%, 35-65%, dan 65-95%. Aktivitas protease ditentukan secara kolorimetri menggunakan spektrofotometri pada panjang gelombang 748 nm dan penentuan kadar protein menggunakan metode Lowry. Hasil fraksinasi amonium sulfat pada fraksi 0-35% menunjukkan aktivitas spesifik tertinggi yaitu 1,2650 U/mg dengan tingkat kemurnian 37,43 kali ekstrak kasarnya dan memperoleh persentase hasil 97,10%. Enzim protease dari isolat ST-30 menunjukkan kondisi optimum yaitu pada pH 7 dan suhu 75°C dengan masing-masing aktivitas enzim sebesar 0,3377 U/mL dan 0,2874 U/mL.
Kata kunci: Aktivitas Enzim Protase, pH Optimum, Suhu Optimum
Abstract.Research has been done that aims to determine of pH and temperature optimum protease enzyme of ST-30 isolate from hot spring Singgahan, Tuban. Determination of pH and temperature optimum based on protease enzyme activity that is made after partial purification step using ammonium sulfate fractionation with fraction 0-35%, 35-65%, and 65-95%. Protease activity was determined by colorimetric using spectrophotometry at a wavelength of 748 nm and protein content determined using Lowry method. The result of ammonium sulfate fractionation in fraction 0-35% which showed the highest specific activity is 1,2650 U/mg with 37,43 fold purification than the crude extract and obtain a yield of 97,10%. Protease enzyme of ST-30 isolate shows the optimum condition that is at pH 7 and temperature 75°C with each enzyme activity are 0,3377 U/mL and 0,2874 U/mL.
Key words: Protease Enzyme Activity, pH Optimum, Temperature Optimum
PENDAHULUAN
Enzim adalah biokatalis yang memainkan peran dalam semua tahap metabolisme dan reaksi biokimia. Enzim sebagai katalis organik digunakan dalam berbagai proses pada skala industri [1]. Industri saat ini membutuhkan enzim yang tahan lingkungan yaitu mempunyai stabilitas tinggi dan dapat diperoleh dari bakteri yang hidup di lingkungan ekstrim seperti bakteri termofilik [2].
Enzim protease merupakan enzim proteolitik yang mengkatalisis pemecahan ikatan peptide pada protein oleh reaksi hidrolisis [3]. Enzim protease banyak digunakan dalam industry makanan, farmasi, kulit, dan tekstil [4]. Enzim ini jumlahnya mencapai 60% dari total produksi enzim di seluruh dunia [5].
Penggunaan protease dari bakteri mesofilik mempunyai kekurangan yaitu tidak dapat digunakn pada suhu tinggi karena protease dari bakteri mesofilik stabil pada suhu rata-rata 37°C, sedangkan saat ini penggunaan protease dalam industri deterjen ataupun kulit mensyaratkan stabil pada suhu yang lebih tinggi [6][7]. Pada industri kulit, protease digunakan untuk proses dehairing yang membutuhkan suhu antara 40-100°C [8]. Enzim protease yang stabil pada suhu tinggi dikenal sebagai protease termostabil yang dihasilkan oleh bakteri termofilik dan efektif digunakan dalam industry deterjen pada suhu rata-rata 60°C [7]. Salah satu bakteri yang dapat menghasilkan enzim protease termostabil adalah isolat ST-30 yang berhasil diisolasi dari sumber air panas Singgahan, Tuban yang mempunyai aktivitas protease tertinggi dibandingan isolat lain yang positif protease yaitu sebesar 0,2522 U/mL dengan indeks proteolitik sebesar 9 [9].
Karakter dari suatu enzim dapat ditentukan tergantung pada kondisi optimum meliputi, pH, suhu, konsentrasi substrat, dan konsentrasi enzim. Setiap enzim memiliki pH optimum, dibawah dan diatas pH optimum aktivitas enzim jauh lebih rendah dan pada pH yang ekstrim, enzim menjadi benar-benar tidak aktif [10]. Demikian pula dengan pengaruh suhu terhadap reaksi enzimatik. Laju reaksi enzimatik akan meningkat seiring dengan peningkatan suhu sampai suhu optimum. enzim akan terdenturasi pada suhu yang terlalu tinggi dan protease termostabil diantaranya yang dihasilkan
oleh bakteri termofilik isolat EP1001 dari sumber air panas alkali Zimbabwe mempunyai aktivitas optimum pada suhu 75°C dengan pH 10 [12]. Protease termostabil dari bakteri termofilik Bacillus strain HUTBS62 yang diisolasi dari sumber air panas dekat Laut Mati, Yordania mempunyai kondisi optimum pada pH 6,8 dan suhu 80°C [13]. B. pumilus JT3 yang diisolasi dari sumber air panas Mae’en, Yordania menunjukkan aktivitas protease termostabil pada suhu optimum 60°C dengan pH 8 [14]. Protease isolat TM2A-2 yang diisolasi dari sumber air panas Tamalantik, Mamasa bekerja optimum pada suhu 50°C dan pH 7 [2].
Keperluan karakterisasi akan lebih baik apabila menggunakan pemurnian yang dilakukan dimulai dengan cara pengendapan yang meliputi pengendapan menggunakan garam, pelarut organik, dan pengendapan berdasarkan titik isoelektriknya (PI), kemudian dialisis lalu dilanjutkan pemurnian menggunakan kromatografi seperti kromatografi penukar ion, gel filtrasi, afinitas, dan teknik
Beberapa penelitian sebelumnya telah berhasil melakukan pemurnian enzim protease secara parsial menggunakan amonium sulfat yaitu enzim protease dari Bacillus HUTBS62 yang mempunyai aktivitas spesifik 83 U/mg dengan tingkat kemurnian 6,5 kali ekstrak kasarnya pada fraksi pengendapan 55-60% [13]. Protease dari Bacillus subtilis mempunyai tingkat kemurnian 3,12 kali ekstrak kasarnya pada fraksi pengendapan amonium sulfat 75% [17]. Protease Termostabil dari Bacillus subtilis ITBCCB148 mempunyai aktivitas spesifik tertinggi pada fraksi 50-60% dengan aktivitas spesifik sebesar 0,55 U/mg [18].
sehingga diharapkan dapat meningkatkan aktivitas enzim protease yang dihasilkan oleh isolat ST-30.
METODE PENELITIAN Alat
Shaker, mikropipet (Transferpette S), autoclave (Hirayama), laminar flow (Thermo scientific), Spektrofotometer UV-Vis (shimadzu 1800), stirrer (dragonlab), digital vortex mixer (VWR), pH meter (Eutech), sentrifus dingin (Eppendorf 5810 R), pengaduk magnet dan peralatan gelas yang umum digunakan.
Bahan
NaCl (Merck), yeast extract (DifcoTM),
MgSO4.7H2O (Merck), K2HPO4 (Merck), kasein
(Oxoid), CuSO4.5H2O (Merck), Na3 sitrat (Merck),
Na2CO3 (Merck), NaOH (Merck), Tirosin (Merck),
Folin-Ciocalteau (Merck), BSA (Sigma), (NH4)2SO4
(Merck), Na-EDTA (Merck), BaCl2 (Merck), asam
tricloroasetat (TCA), buffer sitrat pH 3, 4, buffer
asetat pH 5,buffer fosfat pH 6, 7, 8, buffer borat-boraks pH 9, buffer karbonat-bikarbonat pH 10, buffer Na2HPO4-NaOH pH 11, 12.
PROSEDUR PENELITIAN Pembuatan Inokulum
Kultur isolat ST-30 ditumbuhkan pada media cair Minimal Synthetic Medium (MSM), kemudian diinkubasi selama 18 jam pada suhu 53°C dengan kecepatan 175 rpm.
Produksi Enzim Protease Isolat ST-30
Produksi enzim dilakukan dengan menambahkan 10% inokulum ke dalam 100 mL medium produksi (MSM), kemudian diinkubasi selama 18 jam pada suhu 53°C dengan kecepatan 175 rpm. Selanjutnya, disentrifugasi pada suhu 4°C dengan kecepatan 5000 rpm selama 15 menit. Supernatan yang diperoleh merupakan crude enzyme protease dari isolat ST-30 [9].
Fraksinasi Enzim dengan Amonium Sulfat
Protease difraksinasi menggunakan amonium sulfatdengan fraksi 0-35%, 35-65%, dan 65-90% (b/v). Masing-masing fraksi pengendapan ditentukan aktivitas protease dan kadar protein. Fraksi terbaik selanjutnya didialisis dengan 0,05 M buffer fosfat pH 7. Dialisis dihentikan apabila sudah tidak terbentuk endapan ketika diuji dengan larutan BaCl2.
Uji Aktivitas Protease
Aktivitas protease ditentukan berdasarkan jumlah tirosin yang dilepaskan [19]. Larutan enzim 0,5 mL ditambahkan 0,5 mL larutan buffer fosfat pH 7 0,05 M dan dipreinkubasi selama 5 menit. Selanjutnya, ditambahkan 0,5 mL substrat kasein 2% dan diinkubasi selama 10 menit, kemudian ditambkan 1 mL asam trikoloroasetat (TCA) 0,4 M dan diinkubasi selama 30 menit. Selanjutnya, disentrifugasi pada suhu 4°C dengan kecepatan 5000 rpm selama 15 menit, kemudian diambil 0,5 mL supernatan lalu ditambahkan 2,5 mL natrium karbonat 0,5 M dan dipreinkubasi selama 10 menit. Selanjutnya, ditambahkan 0,5 mL Follin-Ciocalteau (1:2) dan diinkubasi selama 30 menit [19]. Pada blanko, penambahan TCA dilakukan setelah larutan enzim. Selanjutnya, ditentukan absorbansinya menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 748 nm. Kadar tirosin yang dihasilkan diperoleh dari persamaan regresi linear larutan standar tirosin (Gambar 1).
Gambar 1. Kurva Standar Tirosin
Pengukuran aktivitas enzim protease dapat dihitung dengan persamaan sebagai berikut:
Keterangan :
[Tr] = konsentrasi tirosin dari sampel (μg/mL) V = volume total sampel (mL)
q = waktu inkubasi (menit) p = volume enzim (mL) fp = faktor pengenceran
Penentuan Kadar Protein
Follin Ciocalteau dan 10 mL air). Selanjutnya, dikocok dan didiamkan selama 20-30 menit [20], kemudian diukur serapannya menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 757 nm.
Penentuan pH Optimum
Larutan enzim sebanyak 0,5 mL ditambahkan dengan 0,5 mL larutan buffer 0,05 M dengan variasi pH 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, dan 12. Selanjutnya, diinkubasi selama 5 menit, kemudian ditambahkan 0,5 mL substrat kasein 2% lalu diinkubasi selama 10 menit pada suhu 53°C. Selanjutnya, dilakukan pengujian aktivitas enzim protease menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 748 nm.
Penentuan Suhu Optimum
Larutan enzim sebanyak 0,5 mL dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan dengan 0,5 mL larutan buffer pada pH optimum dan dipreinkubasi selama 5 menit. Selanjutnya, ditambahkan 0,5 mL substrat kasein 2%, kemudian campuran diinkubasikan pada suhu 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 dan 100°C selama 10 menit. Selanjutnya, dilakukan pengujian aktivitas enzim protease menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 748 nm.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Produksi Enzim Protease Isolat ST-30
Bakteri ditumbuhkan pada media padat kemudian dipindahkan ke media cair yang berfungsi sebagai media produksi pada kondisi pH 7 dan suhu
53°C dengan kecepatan aerasi 175 rpm. Suhu dan pH yang digunakan selama proses inkubasi disesuaikan dengan kondisi lingkungan asal sumber air panas Singgahan, Tuban.Media cair yang digunakan adalah Minimal Synthetic Medium (MSM). Media cair MSM tersebut diperkaya kasein sebagai inducer agar produksi enzim protease maksimum.
Produksi enzim dilakukan pada jam ke-18 dimana pada jam tersebut bakteri mencapai fase log yaitu fase pertumbuhan maksimal bakteri sehingga diharapkan dapat menghasilkan crude enzyme (ekstrak kasar) yang optimum [21]. Pada fase log ini, bakteri sudah dapat beradaptasi secara baik dengan lingkungan pertumbuhannya sehingga mempunyai waktu penggandaan (doubling time) yang lebih cepat [22].
Enzim protease yang dihasilkan oleh isolat ST-30 bersifat ekstraseluler, sehingga untuk mendapatkan enzim tersebut dilakukan sentrifugasi pada suhu 4°C.Ekstrak kasar enzim yang diperoleh, selanjutnya difraksinasi menggunakan amonium sulfat.
Fraksinasi menngunakan amonium sulfat didasarkan atas kelarutannya yang tinggi, sehingga lebih mudah untuk berinteraksi dengan molekul air. Oleh sebab itu, molekul amonium sulfat akan mengendap. Proses tersebut dinamakan salting out [20].
Tabel 1. Data Hasil Fraksinasi Enzim Protease Isolat ST-30 Pada Berbagai Konsentrasi Amonium Sulfat
Fraksi Pengendapan Aktivitas Enzim(U/mL) Kadar Protein(mg/mL) Aktivitas Spesifik(U/mg)
0-35% 0,2440 0,1931 1,2650
35-65% 0,2052 0,4951 0,4150
65-95% 0,2618 0,4831 0,5425
Tabel 2. Tahapan Pemurnian Enzim Protease dari Isolat ST-30
Pada Tabel 1 menunjukkan bahwa aktivitas spesifik tertinggi diperoleh pada fraksi pengendapan
0-35% dengan aktivitas spesifik sebesar 1,2650
Ekstrak kasar 3,7184 0,1257 0,0338 1 100
Pengendapan
(NH4)2SO4 0-35% 0,0966 0,1220 1,2650 37,43 97,10
Pada proses penambahan amonium sulfat dengan konsentrasi 0-35% mempunyai aktivitas spesifik tertinggi disebabkan jumlah protein yang terendapkan merupakan enzim protease dari isolat ST-30. Hal ini didukung dengan besarnya aktivitas enzim yang diperoleh pada fraksi pengendapan tersebut. Berbeda dengan fraksi lain yaitu 65-95% meskipun mempunyai aktivitas enzim protease besar, namun aktivitas spesifik yang diperoleh rendah. Hal ini disebabkan keseluruhan protein yang terendapkan, ada sebagian protein yang bukan merupakan protein, sehingga dengan mengetahui kadar protein keseluruhan maka dapat diketahui besarnya protein yang berfungsi sebagai enzim melalui kemampuannya dalam mengubah substrat menjadi produk yang diinginkan.
Pada Tabel 2 menunjukan perbandingan persentase hasil pemurnian dan tingkat kemurnian dengan ekstrak kasar protease. Pada fraksi pengendapan 0-35% menunjukkan persentase hasil sebesar 97,10% dengan tingkat kemurnian 37,43 kali
ekstrak kasarnya. Pemurnian yang baik dapat ditentukan berdasarkan pada tingkat kemurnian dan persentase hasil. Tingkat kemurnian yang tinggi dan persentase hasil yang rendah, menunjukkan kandungan proteinnya sedikit, dan sebaliknya persentase hasil yang tinggi dengan tingkat kemurnian yang rendah menunjukkan adanya protein lain selain protein target dalam jumlah banyak [23]. Perolehan persentase hasil yang tinggi pada penelitian ini menunjukkan masih adanya protein lain selain protein target.
Tingkat kemurnian enzim juga didasarkan pada aktivitas spesifik dimana semakin besar aktivitas spesifiknya, maka semakin tinggi tingkat
kemurnian enzim. Hal ini disebabkan total protein pada proses pemurnian mengalami penurunan akibat penambahan amonium sulfat yang dapat mengendapkan protein target, sehingga diharapkan dapat memperoleh total aktivitas enzim yang tinggi. Akan tetapi, pada fraksi pengendapan 0-35% memperoleh total aktivitas lebih rendah dibandingkan ekstrak kasar protease (Tabel 2). Hal ini diduga protein yang terendapkan ada yang mengalami kerusakan enzim dimana kerusakan tersebut dapat disebabkan oleh adanya penambahan amonium sulfat yang mungkin mengganggu sisi fraksi 0-35% selanjutnya didialisis. Tujuan dialisis adalah untuk menghilangkan residu garam amonium sulfat yang bercampur dengan protein karena dapat mengganggu sisi aktif enzim dalam mengikat substrat, sehingga dapat mempengaruhi aktivitas enzim. Pada proses dialisis garam amonium sulfat akan berdifusi keluar melalui membran semipermeable ke dalam pelarut buffer sehingga molekul enzim dapat terbebas dari molekul garam tersebut. Dialisis akan dihentikan apabila semua garam amonium sulfat telah keluar dari membran dengan mengujinya menggunakan larutan BaCl2
dimana ion sulfat (SO42-) akan membentuk endapan
putih BaSO4 dengan reaksi sebagai berikut:
NH4(SO4)(aq) + BaCl2(aq) → BaSO4(s) + 2NH4Cl(aq)
Penentuan pH Optimum
Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim protease dari isolat ST-30 dapat dilihat pada Gambar 2. Enzim protease dari isolat ST-30 optimum pada pH 7 dengan aktivitas sebesar 0,3377 U/mL.
Gambar 2. Grafik Aktivitas Enzim Protease Isolat ST-30 Pada Berbagai Variasi pH
efektivitas pengikatan enzim dengan substrat [11]. Dengan demikian, struktur tiga dimensi enzim akan mengalami perubahan konformasi dimana substrat tidak dapat lagi berikatan dengan tepat di bagian molekul enzim. Hal ini menyebabkan enzim mengalami denaturasi sehingga aktivitas enzim yang diperoleh rendah.
Setiap enzim protease memiliki pH optimum bervariasi tergantung dari jenis protease serta sumbernya. Jenis protease dapat dibedakan berdasarkan pH optimum yaitu protease asam, netral, dan basa [5]. Berdasarkan pH optimum yang diperoleh, maka protease isolat ST-30 adalah protease netral. Beberapa protease termostabil yang telah diteliti rata-rata mendapatkan pH optimum 7 diantaranya adalah enzim protease yang diproduksi bakteri termofilik dari sumber air panas Tamalantik, Mamasa mempunyai pH optimum 7 [2]. Karakteristik protease bakteri E. agglomerans LAS-2b yang diisolasi dari sumber air panas Lejja Kabupaten Soppeng Sulawesi Selatan bekerja optimum pada pH 7 [25]. Protease termostabil dari bakteri Bacillus strain HUTBS26 yang diisolasi dari sumber air panas dekat Laut Mati, Yordania mempunyai pH optimum 6,8 [13].
Penentuan Suhu Optimum
Hasil aktivitas enzim protease dari isolat ST-30 pada berbagai variasi suhu pada Gambar 3. Enzim protease dari isolat ST-30 optimum pada suhu 75°C dengan aktivitas sebesar 0,2874 U/mL.
Gambar 3. Grafik Aktivitas Enzim Protease Isolat ST-30 Pada Berbagai Variasi Suhu
Pada suhu optimum, tumbukan antara enzim dan substrat sangat efektif, sehingga pembentukan kompleks enzim-substrat semakin mudah terbentuk dan produk yang dihasilkan meningkat. Pada suhu yang lebih rendah dari suhu optimum, aktivitas enzim rendah. Hal ini disebabkan tumbukan antara molekul enzim dengan substrat berkurang, sehingga
kompleks enzim-substrat yang terbentuk sedikit. Hal ini mengakibatkan berkurangnya kemampuan kompleks enzim-susbtrat dalam mengubah substrat menjadi produk, sehingga produk yang dihasilkan sedikit.
Kenaikan suhu akan meningkatkan gerak termodinamik dimana benturan antara molekul enzim dengan substrat meningkat. Hal ini menyebabkan enzim mengalami denaturasi dimana struktur tiga dimensinya berubah. Semakin jauh suhu diatas suhu optimum, semakin besar deformasi struktur tiga dimensi sehingga makin sukar substrat berikatan tepat dengan enzim. Hal ini mengakibatkan kompleks enzim-substrat akan sukar terbentuk sehingga produk yang dihasilkan semakin sedikit [26].
Beberapa penelitian protease termostabil mendapatkan suhu optimum yang berbeda-beda diantaranya adalah suhu optimum enzim protease bakteri EP1001 yang diisolasi dari sumber air panas di Zimbabwe adalah 75°C [12]. Protease yang dihasilkan oleh isolat BII-6, BII-4 dan LII yang diisolasi dari dua tempat sumber air panas Padang Cermin, di Lampung, dan Banyuwedang, di Bali berturut-turut mempunyai suhu optimum 65, 60 dan 85°C [27]. Bakteri termofilik B. pumilus JT3 yang diisolasi dari sumber air panas Mae’en, Jordan memiliki aktivitas protease termostabil dengan suhu optimum 60°C [14].
PENUTUP Simpulan
Enzim protease dari isolat ST-30 memperoleh tingkat mempunyai aktivitas spesifik tertinggi pada fraksi amonium sulfat 0-35% yaitu sebesar 1,2650 U/mg. Hasil optimasi enzim protease dari isolat ST-30 mempunyai pH dan suhu optimum yaitu pada pH 7 dan suhu 75°C dengan masing-masing aktivitas sebesar 0,3377 U/mL dan 0,2874 U/mL.
Saran
Perlu dilanjutkan untuk mengetahui kondisi optimum lainnya seperti konsentrasi enzim dan substrat, pengaruh ion logam, serta stabilitas termal terhadap aktivitas enzim protease dari isolat ST-30.
DAFTAR PUSTAKA
2. Rahayu, S. 2014. Isolasi dan Karakterisasi Life Sciences.2 (2): 38–46.
4. Rakshit, S.K., dan Haki, G.D. 2003. Developments in Industrially Important Thermostable Enzymes: A Review. Bioresource Technolog. 89: 17-34.
5. Rao, Mala B., Aparna M. Tanksale, Mohini S. Ghatge, and Vasanti V. Deshpande. 1998. Molecular and Biotechnological Aspects of Microbial Proteases. Microbiology and Molecularbiology. 62 (3): 597–635.
6. Jin Jang, Hyeung, Chang-Hun Lee, Woentae Lee, dan Yu Sam Kim. 2002. Two Flexible Loops in Subtilisin-like, Thermophilic Protease, Thermicin, from Thermoanaerobacter yonseiensis. Biochemistry and Molecular Biology. 35 (2): 498-507.
7. Chenel, J. P., R. D. Tyagi, dan R. Y. Surampalli. 2008. Production of Thermostable Protease Enzyme in Wastewater Sludge Using Thermophilic Bacterial Strains Isolated From Sludge. Institut National de la Recherche Scientifique, Centre Eau, Terre et Environnement, Université du Québec.
8. Madhavi, Jatavathu, Jatavathu Srilakshmi, dan M. V. Raghavendra Rao. 2011. Efficient Leather Dehairing by Bacterial Thermostable Protease. International Journal of Bio-Science and Bio-Technology. 3 (4): 11-26.
9. Rusdwitasari, Yeni Nur. 2014. Aktivitas Bakteri Proteolitik yang Diisolasi dari Sumber Air Panas Singgahan, Tuban. UNESA Journal of Chemistry. 3 (3): 183-188.
10. Satyanarayana, U., dan Chakrapani, U. 2006. Biochemistry. Third Edition. Chintamoni Das Lane, Kolkata: Arunaba Sen Books and Allied (P) Ltd.
11. Kusumadjaja, Aline Puspita. 2005. Determination of Optimum Condition of Papain Enzyme FromPapaya Var Java (Carica Papaya). Indonesian Journal of Chemistry. 5 (2): 147-151.
12. Wilson, Parawira, dan Remigio, Zvauya. 2012. Production and Characterisation of Protease Enzyme Produced By A Novel Moderate Thermophilic Bacterium (EP1001) Isolated From An Alkaline Hot Spring, Zimbabwe. African Journal of Microbiology Research. 6 (27): 5542-5551.
13. Aqel, Hazem, Farouk Al-Quadan, Tahani K. Yousef. 2012. A novel neutral protease from thermophilic Bacillus strain HUTBS62. Journal of Bioscience and Biotechnology. 1 (2): 117-123.
14. Al-Qodah, Zakaria, Hala Dagishtani, dan Kholoud Alananbeh. 2013. Isolation and characterization of thermostable protease producing Bacillus pumilus from thermal spring in Jordan. Academic Journals. 7 (29): 3711-3719.
15. Voet, Donald, dan Voet, Judith G. 2011. Biochemistry. Four Edition. United States of America: John Wiley & Sons, Inc.
16. Monica, Athitya Diah. 2007. Studi Aktivitas Spesifik Selulase dari Lactobacillus collinoides yang Dimurnikan dengan Pengendapan Bertingkat Amonium Sulfat. Skripsi. Malang: Jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya. 17. Padmapriya, Muthu, dan Williams, Christudhas.
2012. Purification and characterization of neutral protease enzyme from Bacillus Subtilis. Journal of Microbiology and Biotechnology Research. 2 (4): 612-618.
18. Yandri A.S, Dian Herasari, dan Tati Suhartati. 2007. Isolasi, Pemurnian dan Karakterisasi Enzim Protease Termostabil dari Bakteri Isolat Lokal Bacillus subtilis ITBCCB148. Jurnal Sains MIPA. 13 (2): 100-106.
19. Cupp-Enyard, Carrie. 2008. Sigma's Non-specific Protease Activity Assay-Casein as a Substrate. Journal of Visualized Experiments. 20. Scope, Robert K. 1994. Protein Purification
Principles and Practice. New York: Springer-Verlag New York, Inc.
21. Yuanita, Dian Novalia. 2014. Screening Bakteri Proteolitik Termofilik Dari Sumber Air Panas Singgahan, Tuban. UNESA Journal of Chemistry. 3 (3): 49-54.
22. Yuwono, Triwibowo. 2005. Biologi Molekular. Jakarta: Erlangga.
24. Lehninger, Albert L. 1982. Dasar-dasar Biokimia. Terjemahan oleh Maggy Thenawidjaja. Jakarta: Erlangga.
25. Fitriani. 2014. Eksplorasi Mikroba Penghasil Enzim Protease Dari Sumber Air Panas Lejja Kabupaten Soppeng Sulawesi Selatan.
Indonesia Chimica Acta. Makassar: Universitas Hasanuddin.
26. Sadikin, Mohamad. 2002. Biokimia Enzim. Jakarta: Widya Medika.
