Kata kind : Aglurioasi, Deteka Fsdundua coli, Anek babi.
TEKNIK AGLUTINASI CEPAT UNTUK DETEKSI
ESCHERICHL4
COLT K88, K99 PADA ANAK BABI
PENDERITA DIARE
Djaenturi
Balm Penelitimr Veteriner, !L RE Maffadinata 30, Bogor, 16114
RINGKASAN
-ram Tebw Fvngaionoi rnn Pewliti 2000
Escherichia coli enterotoksigenik (ETEC) yang mempunyai antigen periekatan K88, K99, F41 dan 978P menyebabkan dime pada anak babi neonatal. Antigen tergebut dapat dideteksi dengan teknk aglutmasi cepat. Sampel ulas rektum loci peteanaim yang ditamgung pads media transport diinokulasikan pads media MacCoakey agar dan agar darah, semua yang bersifat hemolitik pads media agar dash dan beisifat laktose fermentatif pads media MacConkey agar disubkultur pada media nutnen agar dan media mmca + no vitalex untuk
dunlarbankan pads suhu 37° C selama sate malam. Serum anti K88, K99 dibuat don kelinci untuk aglutinasi cepat. Anti am= K88 atau K99 dipakai untuk deteksi antigen K88, K99 isolet E. coli yang disubkultur pads media mmca + Iso vitalex .E. cob K88 bennfat hemolitiik pads media agar dash dapat diisolasi dan anak babi dime donE. coli K99 bdak bersifat hemolitiik padamedia agar darah dapat dnsolasi don soak babi dime.
PENDAHULUAN
Kolibasillosis pada anak babi banyfk terjadi di Indonesia disebabkan oleh E. coli yang bersifat spesifik. E. coli menrpakan penghuni normal di dalam salum pencernaan (Setiawan et al. 1982, Hartaningsih dan Hasan, 1985). Kolibasillosis atau neonatal diare mervpakan salah satu penyebab utama kematian pads umur dua minggu pertama, penyaldt yang ditimbulkan dapat benafat akut dan fatal tenrtama pads hewan neonatal (Supar et al., 1988).
Agen penyakit dime dapat berasal dari tmja dalam lingktmgan hewan tersebut. Angka kematian anak sap dan anak babi yang mendenta infeksi ETEC cukup tinggi dapat mencapai 50% (Tzipori, 1985; Supar et al., 1988, Supar & Hirst; 1985). Konfirmasi diagnosis koh'basillosis uji secara laboratorik harus dapat mengisolasi E.
coli clan bewan pendenta dime, mengidentifkasi sifat virulensi bakten
tersebut, yaitu antigen perlekatanfmbriac (Supar et al., 1988) dan antigen toksin atau enterotoksin (Supar, 1997a b).
Pada kesempatan Jim penulis Akan mengemukakan tentang teknik aglutwasi cepat untuk deteksi K88, K99 secara in vitro dilaboratorium.
Semua sampel yang dicurigai E. coli dimkuusi pada media MacConkeyagar (DIFCO dan agar darah, koloni dari media tersebut disubkultur pada media nutrien agar miring (Supar dan Ibrohim, 1981) dan pada agar minca + iso vitalex (Guinee et
al, 1976) dan identifikasi. Untuk deteksiE. coli setiap isolatE. coli diinkubasikan pada suhu 37°C selama satu malam.
Antigen
Temu Teknts Fungmonal ron Perekti 2000
ISOLASI BAKTERI E. COLI DAN IDENTIFIKASI
CARA PEMBUATAN REAGEN AGLUTINASI
IsolatE. coli yang telah diketahui serotipenya seperti contoh G7 (K88) dan BL
413 (K99) ditumbuhkan pada media MacConkey agar dan agar darah diinkubasikan pada suhu 37°C. Setelah diinkubasi dipilih koloni yang halus dan diinokulasikan pada media nutrien agar untuk K88 dan agar minca + iso vitalex untuk K99 kultur tersebut dinkubasikan pada suhu 37°C selama satu malam (Supar dan Ibrohim, .1981).
Kultur tersebut dapat diperbanyak dengan cars menginokulasikannya pada agar nutrien dan agar minca + iso vitalex yang disiapkan dalam cawan petri dan dinkubasikan seperti sebelumnya. Sel bakteri yang tumbuh pada media nutrien agar dan minca + iso vitalex dibilas dengan larutan garam NaCl fisiologis 0,85% yang mengandung formalin 0,1% suspensi sel kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 3 .500 pin pada suhu 4°C selama 30 menit. Endapat sel dicuci dengan larutan gararn NaCl fisiologis 0,85% sebanyak 2 kali. Sel diperoleh kembali dengan cara sentrifugasi seperti sebelumnya. Suspensi sel dibuat dalam larutan garam NaCl fisiologis 0,85% dengan kepekatan sel secara dengan tabung kekeruhan MacFarland nomor 10 dibuat sebanyak 20 ml. Suspensi sel diuji sterilitasnya dengan cara meneteskan suspensi sel pada media agar darah dan dunkubasikan pada suhu 37T selama satu malam. Bila tidak terdapat pertumbuhan maka suspensi sel yanggiuji steril. Suspensi sel tersebut disimpan pada suhu 4°C sampai saat diperlukan untuk diinkubasikan pada kelinci. Penyuntikan
Suspensi antigen dengan kepekatan sel secara dengan tabung MacFarland nomor 10 dipersiapkan, disuntikkan pada kelinci secara subkutan dengan dosis 0,2 ml, empat hari kemudian disuntik lagi dengan dosis 0,5, selanjutnya kelinci disunikkan secara intra vena(vena hupingbagian tepi) dengan dosis 0,25 ml, 0,5 ml, 1,0 ml dan 2,0 ml pada interpal empat hari. Satu minggu setelah disunfkkan terakhir, dash kelinci diambil serum dipisahkan dan disimpan pada suhu -20°C sampai perlakuan berikutnya.
Antiserum spesifdc
Tame Tebw FrAg-na non Pa,eht, 2000
Anti serum diperoleh dari penyuntikan kelinci, diabsorbsi dengan antigen dan galur E. colt K88 dun K99 yang homolog ditumbuhkan pads media nutrien agar kemudian diinkubasikan pads sulm 18°C selama tip hart. Media agar nutnen dalam botol roux dimokulsi dengan galur E. colt yang homolog dun diinkubasAan pads suhu 18°C selama tiga hari. Setelah diinkubasi sel bakteri dibilas dengan larutan garam NaCl fisiologis 0,85% yang mengandung formalin 0,1% disimpan dalam lemari es satu malam. Suspensi sel tersebut dengan kecepatan 3 .500 rpm pada suhu 4°C selama 30 menit. Endapan sel ditambah 10 ml anti serum yang sudah dibuat sebelumnya, kemudian dikocok dengan alat pengocok beberapa seat, dimlaibasikan pada sulm 37-C selama satu jam, dilanjutkan pada suhu 4°C selama satu malam. Keesokan harinya disenuifugasi seperti sebelumnya. Supernatan yang jernih (anti serum) dipisahkan secara aseptik dun disimpan dalam botol, stern. Serum diuji dengan serotipe E. colt yang homolog dun yang heterolog yang ditumbuhkan pada media agar nutrien pada sulm inkubasi 18°C dun 370C selama satu hart. Apabila serum masih mengaglutmasi suspensi sel yang ditumbuhkan pads sulm 18°C, proses absorbsinya diulang, sampai bask terjadi aglutinasi dengan sel tersebut, tetapi menunjukkan reaksi aglutinasi dengan sel yang dunkubasilcan pads sulm 37°C. Anti serum monospesif K99 disiapkan seperti yang telah dipubh'kas lum oleh Djaenuri dun Kurniasih (1996).
Reagen koaoutinasi
Pembuatan reagen ini dipakai Widen Staphylococcus murus Cowan 1, galur tersebut diperoleh dari IMVS yang. disimpan dibmt Juliarr koleksi Balm Penelitian Veteriner Bogor dalam bentuk kering beku. Setelah diaktifiran dalam media cairtrypticase soy broth (TSB), dunkubasikan pads sulm 37°C selama satu malam, kemudian diinokulasikan pada media agartrypticase soy (TSA)yang disiapkan dalam botol roux, diinkubasikan pada sulm 370C selama satu malam. Pembuatan sel Staphylococcus untuk reagen koaglufnasi mcngftfi cara prosedur berdasarkan Honda et al (1983) dengan modiSkasi yang disesuaikan dengan kondisi laboratorium (Supar, 1986). Setelah diinkubasi satu malam, kedalam biakan bakteri dalam botol roux tersebut ditambahkan larutan PBS sebanyak 25 ml, didiamkan selama 5-7 mcnit, kemudan sel-sel Widen dipanen. Suspensi sel disentrifugasi pads keoepatan 3.000 rpm pads sulm 4°C selama 10-15 rrenit. Endapan suspensi dicuci dengan lam= PBS sebanyak 3 kali dengan cars disentrifugasi seperti sebelumnya. Endapan disuspensi dengan PBS yang mengandung formalin 0,5% didiamkan pada sulm kamar selama tip jam sambil setiap kali dikocok deagan hati-hati. Sel dicuci tiga kali dengan jalan
Tee Teibua FWNSdonol =aPaulib 2000
Suspensi sel dipanaskan dalam penangas au pada suhu 80°C selama satujam kedian ddidinginkan dan disentrifugasi pada kecepatan 3.000 rpm. Endapan sel dilarutkan dalam PBS sehingga konsentrasi sel terakhir 10%. Satu tetes larutan sodium asida 10'/o ditumbuhkan kedalam setup 2 ml suspensi sel Staphylococcus dan disimpan pada suhu 4°C.
Tahap berikutnya suspensi sel Staphylococcus dicampur dengan anti serum mono spm& yang telah disiapkan sebelumnya. Sebanyak 0,9 ml suspensi sel Staphylococcus (Protein A) 10% ditambah 0,1 ml anti serum monospesifik K88 yang dibasilkan dart proses absorbsi, kocok perlahan-lahan dan dibaarkan pada suhu kamar 28°C selama tiga jam, setup setelah jam dikoook perlahan-lahan Reagen Koaglutinasi ini sebelum dipakai terlebih dahulu diuji terhadap suspensi pili dan galur E. colt yang sudah diketahm serotipenya. Reagen koaglutinasi ini sudah siap dip" dapat disimpan dileari es, tahan sampai beberapa bulan, sedangkan anti serum monospesifik dapat disimpan pada suhu -20°C. Uji sensitivitasnya tiap ragen koaglutinasi diuji terhadap pili E. colt K88 dan K99 galur yang homolog dan heterolog yang ditumbuhkan pada suhu 18°C dan 37°C.
Dari uji tersebut E. coli K88 yang heterolog dan homolog yang ditum*uhkan pada suhu 370C memberikan reaksi koaglutinasi, sedangkan yang di tumbuhkan suhu 18°C tidak terjadi reaksi koaglutinasi. Untuk isolat yang bersifat negatif K88 tidak terjadi reaksi aglutnasi, pada suhu inkubasi 37°C maupun suhu 18°C. Keadaan serupa pada reagen koaglutinasi K99 (Sugar, 1986).
CARA DETEKSI UJI AGLUTINASI
lsolat E. colt K88 yang diuji ditanam pads media nutrien agar miring dan isolat E. colt K99 yang diuji harus ditanam pads media agar minca miring + iso vitalek. Masmg-masmg isolat setelah ditumbuhkan, dimkubasi pada suhu 37-C selama satu malam. Tiap kultur diperiksa secara aglutinasi Satu sel E. colt yang diambil dari media nutrien agar atau media agar minca + iso vitalex. Yang diemulsikan dengan larutan garam NACI fisiologis 0,85% pada gelas kaca, dic ampur dengan satu ose reagen koaglutinasi kemudian digoyang-goyang selama beberapa detik (30-60 detik). Bila terjadi reaksi aglutinasi atau teradi gumpalan-gumpalan halus yang semakin lama semaldn kasar ini menunjukkan reaksi positif K88 atau K99, bila tidak terjadi gumpalan maka isolat yang diuji negarif K88 atau K99. Kriteria pembacaan reaksi adalah sebagai berikut: Negatif (-) = tidak terjadi gumpalan, Positif ringan (+) = terjadi gumpalan halus; Positif(++) = reaksi aglutinasi terlihat agak kasar, Positifkuat (+++) = reaksi aglutinasi terlihat kasar dangelas.
E COLT K88, K99 DARI ANAK BABI DIARE
E. coli K88 dan K99 dapat diisolasi dan diidentifikasi dari sampel ulas rektum atau feces anak babi diam dari beberapa peternakan babi di Jawa Barat dan Sumatera Utara (label 1). E. coli K88 tersebut diisolasi dari sampel feces anak babi 6 1
Tenu Teknu Fungnonal not Peneb8 2000
penderita diare profus umur 10 - 15 hari. Semua isolat E. coif K88 bersifat hemolitik
pada agar dash. Akan tetapi tidak semua E. coif hemolitik menunjukkan reaksi
aglitinasi positifdengan antigen atau reagen aglutunasi K88. Dengan demikian teknik aglutinasi cepat dengan reagen koaglutinasi lebih mudah dan lebih cepat dipakai untuk konfinnasi diagnose kolibasillosis pada anak babi yang disebabkan olehE. coliK88.
Antigen K99 hanya dapat dideteksi pada kuman E. coli yang ditumbuhkan
pada minca +iso vitalex. Kebanyakan anak babi penderita cure profus umur 1-5 hari
memberikan presentase positif E.coli K99. Setelah usia 10 hari E. coli K88 lebih dominan. Dan temuan tersebut diasumsi kolibasillosis pada anak babi kelihatannya sangat sulit tanpa memiliki reagen koaglutinasi K88 dan K99, sebab dari pemilihan kedua bakteri tersebut sulit dibedakan.
Deteksi antigen K99 dan E. coif isolat anak babi diam dapat dilakukan
dengan cara aglutunam cepat, hasilnya dapat dilihat pada Tabe12.
Tabel 1 . IsolatE. coli K88 dari sampel ulas rektum anak babi diare
Sumberdata: SUPAR (1986); SUPAR et al, (1988), SUPAR, (1994).
Tabel 2. IsolatE. coli K99 dari sampel ulas rektum anak babi diare
Sumberdata : SUPAR et al (1988), SUPAR (1993), SUPAR (1994). Peternakan (kode) Banyak
1111-8-a
I
Sampel positifE.._ __ ." ~ Isolat E. coif K88 j6j.T di eroleh Jakarta Barat 1988 B 4 4 12 Jakarta 1986 9) 35 10 39 16 2 8 16 1 4 Jakarta 1988 BT 10 9 43 Sumater Utara 1994 JV)- _ - 17 1 5 34 9 36 40 4 17 14 1 5 Jumlah 186 41 169Petemakan (kode) Banyak Sampel positifE IsolatE. coli K99
Jawa Barat 1993 58 4 15 -Jakarta 1988 G 50 22 87 ',T 14 7 27 Sumatera Utara 1994 SK 51 16 50 27 3 12 40 1 4 31 6 23 DG 14 3 12 285 62 230
KESIMPULAN
Tekmk aglutmast cepat untuk deteksi E. coli merupakan cara yang mudah dan cepat dapat dipakai sebagai peneguhan kolibasillosis, sehmgga penyebab dim pads anak babi dapat segera diketahm dengan demikian upaya pengendalian diare dapat segera dilakukan.
Sampel yang positif
E. colt
K88 atau K99 dapat diisolasi dari anak babi dengan gejala klinik dimE. coli
K88 dari anak babi dim bersifat hemolitik pada media agar darah, kolont halus tidak bersifat mucoid, sedangkan E. colt K99 bersifat non hemolitik pada media agar darah, kolont bersifat mucoid.UCAPAN TERIIWA KASIR
Penults mengucapkan terima kasih kepada Bapak Dr. Supar, MS. Yang telah memberikan bimbingan saran serta dukungan dalam penulisan makalah ini.
DAFTAR PUSTAKA
Temr
Term-
Fungsiondnon Peneliti 2000DJAENURI DAN N. KURNIASIH. 1996. Pemanfaatan hewan kelinci untuk pembuatan antiserum monospesifik K99 untuk diagnosis kolibasillosis pada anak sapi. Prosiding Lokakarya Fungsional Non Peneliti: 179-183. GUINEE, P.A.M., VELKAMP and W.H. JANSEN. 1976. Improved Minca Medium
for the Detection of K99 antigen in calf enterotoxigenic strain of Escherichia toll. Infect. Immun 15: 676-678.
HARTANINGSIH and HASSAN. 1985. Colibacillosis in Young Pig. In :Infection diarrhoea in the young Strategies for Control in Humans and Animals" Ed Tzipori, S. 1985. Pmcedings of an International Seminar on Diarrhoeae Disease in South East Asian and Westen Pacific Region, Geelong, Australia, 10-15 February 1985: 129-130.
HONDA, T.K. SAMAKOSES, C. SORNCNAI, J. TAKEDA and T. MIWATANI. 1983. Detection by Staphylococcal coag lutination test of heatLabile Enterotoxin Producing Enterotoxigenic Escherihia colt. J. Clinic. Microbiol. 17: 592-595.
SETIAWAN, E.D., S. POERNOMO and G. MOEKTI. 1982. Kolibacillosis pada anak sapi di Jawa tengah. Penyalat Hewan XIV, (24): 47-53.
SOJKA, W.J. 1965. Escherichia colt in Domestic Animal and Poultry. Commonwealth Agcultural Bureau of Animal Health Weybrige, Review Series No.7: 205-212.
SUPAR 1986. Studi tentang Escherichia colt enteroto$stgenik pada anak sapi dan anak babi: Isolast dan Identifikasi Escherichia coli K99 dan K88. Thesis Master Sams. Institut Pertaman Bogor.
SUPAR 1987a. Diagnosis Kolibacillosis pada anak sapi. Penggunaan anak mencit untuk identifikasi enterotoksin tahan papas. Penyakit Hewan, 19 (34): 54-57.
SUPAR, 1987b. Studi perbandingan uji ELISA dap biakan sel jaringan Y1 pada enterotoksin yang tidak tahan panasd kuman Escherichia cob K88 berasal dari anak babi penderita diare. Penyakft Hewan, 19 (34): 58-64. SUPAR 1993 . Prospek pengendalian kolibasillosis neonatal; dengan vaksin
Escherlchia coli multivalen pads peternakan intensif di Tangerang Jawa Barat. Penyakft Hewan. XXV (46): 114-119.
SUPAR 1994. Distribusi infeksi Escherichia colt enterogenik pada anak babi di Sumatera Utara dap prospek pengendaliannya dengan vaksin. Prosiding Nasional teknologi Veteriner untuk Meningkatkan kesehatan Hewan dap Pengamanan Bahan Pangan Asal tsrnak. 173-179.
SUPAR and R.G. HIRST. 1985. Detection of Entempathogenic Escherichia colt in calves and pigs. Proceeding of the Forth National Congress of Indonesia Society for microbiology and the first meeting of Asean Microbiologist, 2-4 December 1985. Jakarta Indonesia
SUPAR and R.G. HIRST. 1990. Development ofa whole cell vaccine from Escherihia coli beaing K88, K99, F41 and 987P fimbrial anti: Vaccine field trial to control piglet neonatal colibmllosis. Penyakit Hewan. 22 (40): 69-75.
SUPAR, RG. HIRST and B.E. PATTEN. 1988. K ins and O-serogroup of
Escher1chia colt in calves and piglets with diarrhea. Proceeding of the sixth Congress of Federation Asian Veterinary Association (FAVA). Bali Indonesia:479-485.
SUPAR dap IBROHIM. 1981. Kultur media dap cara pen*uatannya. Balm Penehtian Veteriner (Petunjuk Kerja Laboratormm Media)
TZIPORI, S. 1985. A. comparative studi on important pathogens causing diarrhoea in calves and piglets. In infectious diarrhoea in the young strategies for control in humans and animal Ed. Tzipori, s. 1985. Proceedings of an International Seminar on Diarrhoeal Disease in South East Asia and the Western Pacific Region, Geelong, Australia, 10-15 February 1985: 371-379.
