ANALISIS VARIASI GENETIK BEBERAPA POPULASI Globba leucantha Miq. DI SUMATERA BARAT DENGAN
RANDOM AMPLIFIED POLYMORPHIC DNA (RAPD)
Putri Pratiwi1), Syamsuardi2), Mansyurdin2), Tesri Maedeliza2), Winda Varesa1)
1)Program Pascasarjana Biologi Universitas Andalas 2) Jurusan Biologi, FMIPA, Universitas Andalas
*korespondensi : [email protected]
ABSTRAK
Penelitian mengenai analisis variasi genetik beberapa populasi Globba leucantha Miq. di Sumatera Barat dengan Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) telah dilakukan dari bulan Mei sampai Desember 2011. Penelitian ini bertujuan untuk menentukan diversitas genetik dalam populasi, aliran gen antar populasi dan korelasi jarak geografis dan ketinggian tempat dengan jarak genetik. Metode penelitian yang digunakan adalah metode survey untuk pengkoleksian sampel dari lapangan dan tahapan analisis DNA dilakukan dengan menggunakan teknik Random Amplified Polymorpich DNA (RAPD). Isolasi DNA dilakukan dengan metode CTAB yang dimodifikasi. Analisis diversitas genetik dilakukan pada 4 populasi di daerah Sumatera Barat dilakukan dengan menggunakan program POPGENE 1.32. Diversitas genetik yang rendah H: 0,116 terdeteksi di dalam populasi G.leucantha. Total dari diversitas genetik (HT: 0,3016) (70%) berada diantara populasi
(DST: 0,2137) dan sisanya berada dalam populasi (HS: 0,0879).Tingginya nilai GST: 0,7087
diantara populasi juga mengindikasikan tingkat aliran gen yang rendah yaitu 0,2056 (NM<1). Korelasi yang siginifikan antara jarak geografis dengan jarak genetik menunjukkan
bahwa isolasi geografis telah memainkan peran penting dalam pembangunan struktur genetik dari spesies ini.
Kata Kunci : aliran gen, Globba leucantha, isolasi geografis, outcrossing, RAPD dan variasi genetik
1. PENDAHULUAN
Globba leucantha merupakan salah satu jenis tumbuhan yang menarik perhatian para peneliti, diantara penelitiannya sebagai berikut : menurut Takano (2000), G. leucantha merupakan salah satu jenis dari Globba, yang berasal dari wilayah Sumatera Barat. Bentuk bunganya berupa paniculata, dengan warna bunga berwarna putih, memiliki beberapa varietas yaitu G. leucantha var. bicolor. dan var. falividula. Menurut Syamsuardi, Mansyurdin dan Susanti (2010), tanaman globba salah satu genus dalam tribe Globbeae dari famili zingeberaceae yang belum dikenal secara luas. Tumbuhan ini memiliki karakter morfologi yang berbeda dari marga lainnya dalam Zingiberaceae yaitu memiliki organ tambahan pada anthernya.
Diketahui genus globba ini memiliki sistem penyerbukan silang atau outcrossing, dengan nilai polen/ovule tertinggi terdapat pada G. leucantha. Menurut Syamsuardi, Mansyurdin dan Susanti (2010), jumlah polen per bunga pada jenis Globba leucantha paling tinggi dengan perbandingan polen/ovule 1843 dan memiliki jenis penyerbukan silang (outcrossing). Menurut Syamsuardi (2004), sistem reproduksi suatu jenis tumbuhan merupakan faktor yang secara langsung mempengaruhi jumlah dan distribusi variasi genetik dalam dan antar populasi. Diduga jenis tumbuhan yang memiliki jenis penyerbukan outcrossing memiliki diversitas genetik yang tinggi.
G. leuchanta dikenal sebagai jenis yang memiliki potensial evolusi dan proses spesiasi dari family zingiberaceae. Menurut Williams et.al. (2004), posisi Globba leucantha yang memiliki tiga variasi pada penelitiannya menunjukkan posisi evolusi dalam section Ceranthera yang sangat penting dan berperan dalam spesiasi.
Memahami aspek aliran gen dan struktur genetik dalam dan di antara populasi G. leucantha dapat memberikan pemahaman penting tentang pemahaman potensi evolusi spesies ini. Menurut Syamsuardi dan Okada (2002), jika ada tingkat tertentu diferensiasi genetik antara populasi dan subsisten struktur genetik dalam spesies, adalah mungkin untuk mengatakan bahwa peristiwa tersebut di masa lalu mungkin telah mendorong terbentuknya taksa baru.
Marker DNA seperti RAPD, RFLP, SSR dan AFLP telah banyak digunakan sebagai penciri genotipe tanaman. Williams, Kubelik, Livak, Rafalski, dan Tingey (1990), telah mengembangkan metode RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) untuk menghasilkan marker polimorfik yang tepat dan dapat digunakan untuk menentukan variasi dan kekerabatan genetik pada tumbuhan.
Penelitian ini bertujuan untuk menentukan diversitas genetik menentukan tingkat aliran gen (gene flow) dan menentukan diferensiasi genetik antar populasi tumbuhan G. leucantha Miq. Selain itu, penelitian ini merupakan tahap awal pemahaman tentang proses spesiasi tumbuhan tropis.
2. BAHAN DAN METODA
Globba leucantha merupakan tumbuhan herba perennial, berumpun, tinggi 52-59 cm; rizom dibawah permukaan tanah. Merupakan tumbuhan outcrossing dengan penyebaran yang cukup luas. Pengoleksian sampel dilakukan di daerah Sumatera Barat dari bulan Mei – Oktober 2011 selanjutnya penelitian dilakukan di Laboratorium Balai Besar Bioteknologi dan Genetika, Bogor dari bulan Oktober – Desember 2011.
Tempat pengambilan sampel dilakukan dibeberapa lokasi di wilayah Sumatera Barat, empat lokasi yang ditemukan sampel yaitu : Padang, Hutan Pendidikan dan Penelitian Biologi (HPPB) Universitas Andalas, 200-460 mdpl; Pasaman, Desa Geringging Malampah, 200-500 mdpl; dan Tanah datar, Batusangkar 900-1000 mdpl; dan empat lokasi yang tidak ditemukan sampel yaitu : Cagar Alam Lembah Anai, 400-800 mdpl; Tanah datar, Tanjung Bonai, Bukit Batu jolang, 900-1500 mdpl. Padang Pariaman, Asam Pulau, 60-100 mdpl dan Solok, Laiang, 600-700 mdpl.
Penelitian ini menggunakan metode survey untuk pengkoleksian sampel dari lapangan dan tahapan analisis DNA dilakukan dengan menggunakan teknik Random Amplified Polymorpism DNA (RAPD) dengan menggunakan 11 primer, untuk melihat dan mengetahui diferensiasi secara molekuler tumbuhan G. leucantha Miq. Cara kerja dan analisis data yang digunakan diuraikan pada tiap tahapan penelitian.
Primer-primer yang akan diujicobakan pada sampel DNA: OPD08 (5’-GGGTAACGCC-3’); OPG18 (5’-GGCTCATGTG-3’); OPJ 04 (5’-CCGAACACGG-3’); OPS19 GAGTCAGCAG-3’); OPA 06 GGTCCCTGAC-3’); OPF 07
(5’-CCGATATCCC-3’); OPG13 (5’-CTCTCCGCCA-3’); OPW05 (5’-GGCGGATAAG-3’); OPW16 CAGCCTACCA-3’); OPY08 AGGCAGAGCA-3’) dan OPZ03 (5’-CAGCACCGCA-3’).
Prosedur kerja pada penelitian ini dimulai dengan isolasi DNA yang berdasarkan metode isolasi berbasis CTAB menurut prosedur Doyle Doyle (1987). Dilanjutkan dengan uji kualitas dan kuantitas DNA yang dilakukan dengan cara elektroforesis dan amplifikasi DNA dengan teknik PCR, kegiatan amplifikasi ini menggunakan RTG-PCR Kit. Untuk mendapatkan tingkat polimorfisme yang tinggi dari sample yang diuji, dilakukan screening pada 11 primer.
Parameter-parameter seperti persentase lokus polimorfik (P), diversitas genetik Nei (H), indeks diversitas fenotipik Shannon (I), heterozigositas dalam subpopulasi (HS) dan
heterozigositas total pada populasi (HT), koefisien diferensiasi genetik (GST) serta gene flow
(NM) dianalisis dengan menggunakan program analisis POPGENE 1.32 (Yeh et al., 1997).
Nilai gene flow (NM) dihitung menggunakan rumus NM = 0.5 (1-Gst / Gst). Nilai jarak genetik
(genetic distance) dihitung dengan NTSYSpc 2.02 (Rohlf, 1997). Program PAST Ver. 2.10 (Hammer, 2011) digunakan untuk menentukan korelasi jarak genetik dengan jarak geografis dan ketinggian tempat serta Mantel test.
3. HASIL DAN DISKUSI
Hasil screening terhadap 11 primer menunjukkan bahwa hanya 4 primer yang memberikan hasil yang polimorfik. Primer-primer lain yang diujikan adalah OPA-06, OPF-07, OPG-13, OPW-16 dan OPY-08 (tidak menghasilkan amplikon), OPW-05 (sampel tidak teramplifikasi semua), OPZ-03 (pita-pita hasil ampifikasinya monomorfis). Dari hasil uji coba didapatkan masing-masing primer (OPD-08, OPG-18, OPJ-04 dan OPS-19) menunjukkan adanya pita-pita dengan ukuran yang bervariasi dan pita polimorfik. Profil pita-pita yang dihasilkan dari keempat primer yang telah diuji, dapat digunakan untuk tujuan analisis variasi genetik G. leucantha karena pita-pita yang dihasilkan cukup jelas.
Tabel 2.Primer-primer yang digunakan dalam RAPD dan profil pita-pita yang dihasilkan dari 30 sampel G. leucantha
No Primer Urutan basa (5’→ 3’) pita totalJumlah monomorfikJumlah pita Jumlah pitapolimorfik Presentasipita polimorfik
1. OPD 08 5’-GGGTAACGCC-3’ 8 1 7 87,5% 2. OPG 18 5’-GGCTCATGTG-3’ 9 1 8 88,8% 3. OPJ 04 5’-CCGAACACGG-3’ 13 0 13 100% 4. OPS 19 5’-GAGTCAGCAG-3’ 6 1 5 83,3% Total 36 4 32 359,6 Rata-rata 9 1 8 89,9%
Tabel 3. Primer-primer yang digunakan dalam RAPD dan ukuran pita yang dihasilkan
No Primer Urutan basa (5’→ 3’) Ukuran pita (bp)
1 OPD 08 5’-GGGTAACGCC-3’ 1400,1200,1100,900,550,450,350,200 2 OPG 18 5’-GGCTCATGTG-3’ 1500,1400,780,750,600,500,450,400,250
3 OPJ 04 5’-CCGAACACGG-3’ 1300,1100,1000,850,780,650,600,550,500,450,400,350,300
4 OPS 19 5’-GAGTCAGCAG-3’ 900,750,600,500,450,400
Fragmen yang terbentuk dari data RAPD dengan empat buah primer yang didapatkan adalah 36 pita dengan kisaran ukuran pita antara 200 bp sampai dengan 1450 bp (Tabel 3). Dari total 36 pita tersebutdiantaranya 32 pita (88%) adalah polimorfik dan 4 pita (12%) adalah monomorfik.
Tingginya polimorfisme pita pada penelitian ini menunjukkan tingginya keragaman genetik pada tumbuhan G. leucantha yang diamati. Penelitian oleh Islam, Meister, Schubert, Kloppstech dan Esch (2007), diversitas genetik dari family zingebaraceae Curcuma zedoria juga menemukan hal yang sama dengan metoda RAPD, dari total 189 pita hasil amplifikasi dengan 13 primer, diantaranya 151 pita (79,9%) adalah polimorfik dan 38 pita (20,1%) adalah monomorfik.
Setelah diamati profil pita-pita DNA dengan menggunakan 4 primer pada masing individu, terlihat adanya pita-pita unik yang membentuk suatu pola pada masing-masing daerah, yaitu di Limau manis, Harau, Pasaman dan Batusangkar. Pita unik hanya terdapat pada suatu daerah saja, dan berpotensi untuk terjadinya spesiasi. Terdapat lima pita
unik yang sebagian besarnya terdapat di daerah tertentu (Gambar 1), antara lain adalah alel berukuran 1400 bp OPD08-1(ditandai dengan warna merah), alel berukuran 780 bp (OPG 18-3, ditandai dengan warna kuning), alel berukuran 750 bp (OPG 18-4, ditandai dengan warna hijau), alel berukuran 350 bp (OPJ 04-12, ditandai dengan warna biru) dan alel berukuran 750 bp (OPS 19-2, ditandai dengan warna ungu).
Gambar 1. Pita-pita unik yang terdapat pada populasi G. leucantha di empat populasi Hasil analisis berdasarkan metode Nei (1979) (Tabel 4) menunjukkan adanya diversitas genetik di dalam populasi Limau manis, Harau, Malampah dan Batusangkar. Tabel 4. Hasil analisis diversitas genetik Globba leucantha (Program POPGENE 1.32, Yeh
et al, 1997) pada masing-masing populasi Limau manis, Harau, Malampah dan Batusangkar.
Populasi Jumlah sampel
Na Ne H I
LimauManis 13 2 1.262±0.356 0.157±0.187 0.244±0.265
Harau 13 1 1.179±0.322 0.105±0.175 0.161±0.253
Malampah 3 1 1.133±0.233 0.088±0.147 0.138±0.228
Rerata 9 1.33 1.192±0.304 0.011±0.170 0.138±0.250
Keterangan : Na : rata jumlah alel yang diamati; Ne : rata jumlah alel efektif, H : Rata-rata Heterozigositas/diversitas genetik Nei; I : Rata-Rata-rata Indeks Shannon (Lewontin, 1972)
Nilai diversitas genetik tertinggi diperoleh pada populasi Limau manis dengan nilai rata-rata heterozigositas (H) sebesar 0.1572 dan rata-rata nilai Indeks Shannon (I) sebesar
0.2442, kemudian dalam populasi Harau dengan nilai H sebesar 0.1059 dan nilai I sebesar 0.1618. Sedangkan dalam populasi Malampah didapatkan nilai H terendah yaitu sebesar 0.0885 dan I sebesar 0.1381. Pada populasi di Batusangkar didapat nilai H dan I sebesar 0,00, hal ini dikarenakan jumlah sampel yang ditemukan hanya satu individu.
Berdasarkan perhitungan analisis diversitas genetik (Tabel 5), nilai heterozigositas total pada populasi (HT) sebesar 0.3016 dapat dilihat bahwa variasi genetik G. leucantha
berada antar populasi Limau manis, Harau, Malampah dan Batusangkar. Nilai HT dari
seluruh variasi genetik berada diantara populasi, dapat dilihat dari perbandingan nilai DST
dan nilai HT nya, dengan 70,8% variasi genetik terdapat antar populasi dan 29,2% terdapat
didalam populasi. Adapun nilai heterozigositas di dalam subpopulasi (HS = 0.0879) ternyata
lebih kecil dibandingkan dengan nilai heterozigositas antar populasi (DST = 0.2137).
Tingginya nilai DST (0.2137) dibandingkan dengan nilai Hs (0,0879) menunjukkan
bahwa variasi genetik G. leucantha antar populasinya lebih tinggi dibandingkan variasi genetik didalam populasinya. Sedangkan menurut Nybom dan Bartish (2000), spesies outcrossing memiliki nilai diversitas genetik yang lebih rendah diantara populasi. Perbedaan ini mungkin berkaitan dengan jarak geografis yang sangat jauh antar populasi G. leucantha, isolasi geografis diduga salah satu pembatas antar populasi.
Tabel 5. Hasil analisis diversitas genetik 30 individu Globba leucantha dan nilai gene flow (Program POPGENE 1.32, Yeh et al., 1997)
Jumlah
Sampel HT HS DST GST NM
30 0,3016 0,0879 0,2137 0,7087 0,2056
Keterangan : HT : Nilai heterozigositas total populasi (HS+DST); HS : Nilai heterozigositas
dalam populasi; DST : Nilai heterozigositas antar populasi; GST : Genetik diferensiasi antar
populasi; NM : Aliran gen (gene flow)
Tingginya nilai GST di antara populasi juga mengindikasikan tingkat aliran gen yang
rendah. (Frankham, Ballou dan Briscoe, 2002). Dibuktikan dengan nilai aliran gen yang juga rendah pada populasi G. leucantha yaitu 0,2056 (Nm<1). Isolasi reproduksi dan isolasi geografis tampaknya memainkan peranan yang penting dalam struktur populasi G. leucantha.
Berdasarkan hasil perhitungan jarak genetik antar 30 individu G. leucantha dilakukan analisis pengelompokan (cluster analysis) yang hasilnya berupa fenogram pada gambar 2.
Gambar 2. Fenogram analisis cluster genetic distance (UPGMA) data RAPD pada individu-individu G. leucantha dari 4 populasi (Limau manis, Harau, Malampah dan Batusangkar)
Fenogram pada Gambar 2 memperlihatkan sebagian kelompok individu mengelompok berdasarkan asal dari populasinya dan sebagiannya acak bergabung dengan kelompok populasi lain, yaitu individu M1, M2 dan M3 (Malampah) yang bergabung dengan kelompok individu Limau manis, yaitu M1 bergabung dengan LM14, M2 dan M3 mengelompok sendiri tapi masih dalam satu kelompok dengan individu Limau manis. Terjadinya perbedaan pengelompokan berdasarkan jarak genetiknya disebabkan adanya diferensiasi genetik antar populasi G. leucantha yang mengindikasikan adanya struktur genetik sebagai awal proses dimulainya spesiasi.
Berdasarkan hasil analisis menunjukkan korelasi yang signifikan (Gambar 3) antara jarak genetik dengan jarak geografis di antara populasi (r = 0,1203, P<0,05 ) yang mengindikasikan bahwa isolasi geografis memainkan peranan yang penting dalam penentuan perbedaan genetik antar populasi G. leucantha. Hasil penelitian Syamsuardi (2003), memperlihatkan bahwa perbedaan struktur genetik karena adanya jarak juga terjadi pada tumbuhan Ranunculus japonicus di Jepang. Penelitian oleh Zhou et.al.(2007), pada tumbuhan G. lancangensis juga menunjukkan adanya korelasi positif yang signifikan antara jarak genetik dan geografis. Nilai r tertinggi 0,099 di kelas 1,0-2,0 m jarak. Korelasi positif yang signifikan lain (Mantel t test r = 0,059, P <0,01, terjadi pada 8-12 m kelas. Pola ini bisa menjadi refleksi dari gerakan migrasi gen melalui serbuk sari oleh penyerbuk.
Sedangkan untuk korelasi antara jumlah allel dengan ketinggian tempat tidak terdapat hubungan yang signifikan, karena didapatkan nilai r= -0,14227; r2 = 0,02024 dan
nilai p = 0,45329. Dimana nilai p>0,05 menunjukkan tidak terdapat hubungan yang siginifikan.
Populasi Globba leucantha di Limau manis memiliki diversitas genetik yang lebih tinggi (Na = 2, Ne = 1.2627, H = 0.1572, I = 0.2442) dibandingkan dengan populasi Harau (Na = 1, Ne = 1.1794, H = 0.1059, I = 0.1618) dan Malampah (Na = 1, Ne = 1.192, H = 0.0117, I = 0.138). Diferensiasi genetik antar populasi cukup tinggi (GST = 0.7087) dengan
nilai aliran gen (NM) sebesar 0,2056.Terdapat korelasi yang signifikan antara jarak genetik
dengan jarak geografis pada G. leucantha dimana r = 0,1203, p = 0.0234 (p<0,05) sedangkan jumlah alel dengan ketinggian tempat (altitude) tidak terdapat korelasi yang signifikan dimana r = -0,14227dan p = 0,45329 (p>0,05).
5. Ucapan Terimakasih
Penulis mengucapkan terimakasih kepada Prof. Dr. Syamsuardi, MSc., tim Zingiberaceae Herbarium Universitas Andalas atas kerjasamanya. Penulis juga mengucapkan terimakasih pada Prof. Dr. Mansyurdin dan Dr. Tesri Maedeliza atas masukannya dalam penelitian ini. Kepada Hibah Penelitian Tim Pascasarjana, Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi Departemen Pendidikan Nasional dengan Surat Perjanjian Pelaksanaan Pekerjaan Penelitian No: 001/H.16/PL/HB-MT/III/2011
DAFTAR PUSTAKA
Doyle, J.J. and J.L. Doyle. 1987. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochem. Bull, 19: 11-15
Frankham, R, J. D. Ballou and D. A. Briscoe. 2002. Introduction to conservation genetics.Cambridge University Press.UK
Hammer, yuind, 2011. Paleontological statistic version 2.10.natural history museum. University of Oslo
Islam, M.A., A., Meister, V., Scuberrt, K., Kloppstech, and E., Esch, 2007. Genetic Diversity and Cytogenetic Analyses in Curcuma zedoaria (Christm.)Resoed from Bangladesh.Genetic Resources and Crop Evolution (2007) 54 : 149-156
Nei M, W. Li. 1979. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases. Proc. Natl. Acad. USA., 76: 5269-5273.
Nybom, H., and V.I., Bartish, 2000. Effects of life history traits and sampling strategies on genetic diversity estimates obtained with RAPD markers in plants. Perspectives in Plant Ecology, Evolution and Systematic. Vol. 3(2) : 93-114.
Rohlf (1997) NTSYS-pc.Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System. Version 1.8. Exeter Software (NY, USA)
Syamsuardi dan Okada, Hiroshi.,2002. Genetic diversity and genetic structure of populations of Ranunculus japonicus Thunb.,(Ranunculaceae). Plant Species Biology (2002) 17, 59-69
Syamsuardi. 2003. Pollination and breeding system of Ranunculus japonicus Thunb. In Japan. Biota 8 (1) : 27-32
Syamsuardi. 2004. Mating system variation in Ranunculus japonicus Thunb. (Ranunculaceae): Evidence from electrophoretic data.Makalah Semirata Bidang MIPA BKS-PTN Wilayah Indonesia Barat di Pontianak tanggal 27-30 Juli
Syamsuardi, Mansyurdin, dan Susanti, 2010. Variasi morfologi polen genus Globba (Zingiberaceae) Di Sumatera Barat.Jurnal Hayati, 2010 : 1-5
Takano, A. 2000. Studies on The Diversification of Globba (Zingiberaceae) in The Wet Tropics. Disertasi S3. Osaka City University. Osaka. Japan
Williams, J. G., A. R., Kubelik, K.J., Livak, J. A., Rafalski and S. V. Tingey, 1990. DNA polymorphisms amplified by arbitrary promers are useful as genetic markers. Nucl. Acid Res., 18: 6531-6535
Williams, J.K., Kress, J.W., and Manos, S.P., 2004. The Phylogeny, Evolution, and Classifiationofthe Genus Globbaand Tribe Globbae(Zingiberaceae): Appendagesdo Matter. American Journal of Botany 91(1): 100–114. 2004
Yeh FC, Yang R-C, Boyle T et al. (1997) POPGENE, the user-friendlyshareware for population genetic analysis.Molecular Biology andBiotechnology Centre, University of Alberta, Canada. http://www.ualberta.ca/∼fyeh/
Zhou, H., J.,Chen and F., Chen, 2007. Ant-mediated seed dispersal contributes to the local spatial pattern and genetic structure of Globba lancangensis (Zingiberaceae). Journal of Heredity, hal 1-8
