laporan IDENTIFIKASI BAKTERI ENTEROBACTERIACEAE.doc

I. JUDUL :

IDENTIFIKASI BAKTERI ENTEROBACTERIACEAE

II. TUJUAN :

1. Memahami prosedur pemeriksaan bakteri Enterobacteriaceae

2. Mampu mengisolasi dan mengidentifikasi bakteri-bakteri kelompok Bakteriaceae

III. DASAR TEORI :

Mikrobiologi adalah satu ilmu yang mempelajari kehidupan dan mikroba organisme hidup yang berukuran mikro atau sangat renik. Mikroorganisme ini sangaterat kaitannya denga kehidupan, baik yang bermanfaat atau merugikan makhluk hidup yang lainnya. Ada diantara mereka yang hidup dalam media agar yang dapat menyebabkan penyakit ataupun menguntungkan misalnya dalam proses pembutan anggur, keju, yogurt, produksi penisilin dan proses pembuangan limbah (Tortora, 1992 : 22).

Untuk menelaah bakteri di laboratorium kita harus dapat menumbuhkan bakteri dalam biakan murni.Untuk melakukan hal itu, haruslah mengerti jenis-jenis nutrient yang disyaratkan oleh bakteri dan juga macam lingkngan fisik yang menyediakan kondisi optimum bagi pertumbuhannya. Kultur bakteri untuk keperluan yang bermanfaat, pada umunya dilakukan dengan biakan murni, biakan murni hanya mengandung satu jenis, untuk mengisolasi biakan murni, umumnya digunakan 2 prosedur yaitucawan dengan goresan dan metode agar tuang Biakan adalah medium yang mengandung organism hidup. Medium itu mengandung zat-zat makanan untuk bakteri. Berbagai resep ramuan untuk membuat media telah dibuat untuk memungkinkan untuk tumbuhan jenis-jenis tertentu. Medium pilihan dan diferensial bermanfaat untuk memisahka berbagai jenis. (Dwijoseputro, 1998)

Syarat yang harus dipenuhi untuk media biakan.

a. Mengandung nurtisi yang di butuhkan oleh mikroorganisme yang berkembang. b. Memiliki kelembaban optimum bagi pertumbha mikroorganisme.

c. Mengandung oksigen (kultur bakteri aerob) dan pH sesuai. d. Harus bebas dari mikroba lain dan steril.

Ada tiga jenis media pengembangbiakan berdasarkan konsentrasinya antara lain: a. Media padat, yaitu media berbentuk padat yang mengandung agar 1-1,5%

misalnya nutrient agar.

b. Media cair yaitu media yang berbentuk cair yang tidak mengandung agar, misalnya nutrient broth.

c. Media semi padat, yaitu media yang berbentuk padat pada suhu dingin, dan berbentuk cair bila suhu panas, misalnya media SIM (media yang digunakan untuk uji produksi sulfur, indiol, motilitas.

Mikroorganisme seperi bakteri yang terdapat di ikan atau lingkungan budidaya, umumnya terdapat dalam populasi campuran. Untuk keperluan identifikasi diperlukan suatu biakan murni sehingga teknik isolasi mutlak diperlukan. Mikroorganisme yang telah diisolasi ini belum dapat ditentukan sifat atau jenis bakterinya. Pengamatan mengenai bentuk morfologi, sifat gram, dan pola penataan sel dapat diketahui dengan cara pewarnaan gram. Akan tetapi, untuk mengetahui jenis bakteri tidak cukup hanya dengan metode pewarnaan gram. Seperti halnya mikroorganisme lainnya bakteri mempertahankan kehidupannya melalui penyesuaian diri terhadap lingkungan demi kelanjutan generasinya. Untuk itu, bakteri mampu merombak dan menggunakan bahan kimia (dalam bentuk larutan) yang ada di linkungannya sebagai sumber energi dan zat pembangunan. Setiap jenis spesies bakteri mempunyai karakterisasi sifat biokimia dan fisiologi yang khas. Sifat-sifat ini dapat dijadikan acuan dalam proses identifikasi. Oleh karena itu dalam praktikum kali ini dilakukan uji enzimatik untuk mengetahui karakteristik sifat dari bakteri. (Tortora, 1992 : 22).

Untuk melihat reaksi bakteri terhadap media yang digunakan , dapat diadakan beberapa uji yaitu uji biokimia. Uji biokimia adalah pengujian larutan atau zat-zat kimia dari bahan-bahan dan proses-proses yang terjadi dalam tubuh makhluk hidup, sebagai upaya untuk memahami proses kehidupan dari sisi kimia (Lehninger, 1995).

Biokimia bertujuan untuk memahami bagaimana interaksi biomolekul satu dengan lainnya yang membawa sifat-sifat kehidupan ini. Belum pernah dalam pengamatan logika molekul sel hidup, kita menemukan suatu pelanggaran terhadap hukum-hukum yang telah dikenal, seiring dengan itu pula, kita belum pernah memerlukan pendefinisian hukum baru. Mesin organik lunak sel hidup berfungsi di dalam kerangka hukum-hukum yang sama mengatur mesin buatan manusia. Akan tetapi, reaksi-reaksi kimia dan proses pengaturan sel telah maju demikian pesat, melampaui kemampuan kerja mesin buatan manusia (Lehninger, 1995).

Ciri biokimia merupakan kriteria yang amat penting di dalam identifikasi spesimen bakteri yang tak dikenal karena secara morfologis biakan ataupun sel bakteri yang berbeda dapat tampak serupa, tanpa hasil pengamatan fisiologis yang memadai mengenai organik yang diperiksa maka penentuan spesiesnya tidak mungkin dilakukan. Karakteristik dan klasifikasi sebagai mikroba seperti bakteri berdasarkan pada reaksi enzimatik ataupun biokimia. Mikroba dapat tumbuh pada beberapa tipe

media memproduksi metabolit tentunya yang dideteksi dengan interaksi mikroba dengan reagen test yang mana menghasilkan perubahan warna reagen (Murray, 2005).

Uji fisiologi bisanya identik dengan uji biokimia. Uji biokimia yang biasanya dipakai dalam kegiatan identifikasi bakteri atau mikroorganisme yang antara lain uji katalase, koagulase, dan lain-lain. Pengujian biokimia merupakan salah satu hal yang sangat penting dalam dunia mikrobiologi (Lim, 1998).

Uji-uji biokimia yang biasanya dipakai dalam kegiatan identifikasi bakteri atau mikroorganisme yaitu antara lain adalah uji MR-VP, uji gula-gula, uji SIM, Uji TSIA, Uji Indol, dan Uji Simmons Citrate (Dwidjoseputro, 1954).

Berikut beberapa uji biokimia yang digunakan untuk identifikasi bakteri, antara lain:

1. Reaksi Fermentasi Karbohidrat (Gula-gula)

Fermentasi merupakan salah satu aktivitas biokimia yang dilakukan oleh mikroba. Fermentasi adalah proses pengunahan senyawa makromolekul organik menjadi senyawa yang lebih sederhana oleh aktivitas mikroba pada kondisi anaerob. Fermentasi dapat menghasilkan berbagai senyawa akhir, contohnya fermentasi karbohidrat yang dapat menghasilkan berbagai senyawa asam seperti asam laktat dan propionet, ester-ester, keton dan gas (Pelczar, 2008).

Sebagian besar mikroorganisme memperoleh energi dari substrat berupa karbohidrat yang selanjutnya di fermentasi menghasilkan asam-asam organik (seperti asam laktat, format, asetat), dengan disertai atau tidak disertai pembentukan gas. Organisme-organisme yang berbeda akan menggunakan karbohidrat/gula-gula yang berbeda tergantung dari komponen enzim yang dimilikinya. Perbenihan gula-gula digunakan untuk melihat adanya pembentukan asam yaitu dengan adanya perubahan warna indikator (merah fenol atau biru bromtimol) yang terdapat dalam perbenihan menjadi kuning yang sebelum ditanami berwarna merah (indikator merah fenol) atau berwarna biru (indikator biru bromtimol) serta untuk pembentukan gas, yaitu dengan terlihatnyaudara di dalam tabung peragian/fermentasi (tabung durham). Jenis karbohidrat yang digunakan pada uji fermentasi karbohidrat antara lain: Sukrosa, Laktosa, Maltosa, Manitol. Glukosa dapat langsung masuk dalam jalur fermentasi tahap pertama. Sedangkan, sukrosa, laktosa mantol, dan maltosa akan di hidrolisis terlebih dahulu menjadi monosakarida penyusunnya. Laktosa dihidrolisis menjadi galaktosa dan

glukosa. Monosakarida jenis manosa dan galaktosa terlebih dahulu akan diubah menjadi glukosa melalui reaksi epimerisasi. Sedangkan fruktosa akan diubah terlebih dahulu menjadi fruktosa 6-fosfat dan kemudian fruktosa 6-fosfat diubah menjadi glukosa 6-fosfat. Glukosa 6-fosfat dan glukosa hasil epimerisasi galaktosa dan manosa akan masuk dalam tahap awal proses fermentasi untuk menghasilkan asam piruvat, asam asetat dan CO2 dan kemudian pada tahap kedua fermentasi asam piruvat dan asam asetat di reduksi kembali oleh atom hidrogen yang dilepaskan dalam tahap pertama, membentuk asam laktat dan etanol (Volk dan Wheeler, 1993).

2. Uji Imvic (Indol, Methyl Red, Voges-Proskauer, Simmon’s Citrate) Identifikasi basil enterik sangat penting dalam mengendalikan infeksi usus dengan mencegah kontaminasi pasokan makanan dan air. Kelompok bakteri yang dapat ditemukan di saluran usus manusia dan mamalia yang lebih rendah diklasifikasikan sebagai anggota family Enterobacteriaeae. Yang termasuk dalam keluarga ini adalah:

a. Pathogen seperti anggota genera Salmonella dan Shigella b. Sesekali pathogen seperti anggota genera Proteus dan Klabsie

c. Yang normal flora usus seperti Escherichia anggota marga dan Enterobacter, yang merupakan penduduk saprophytic dari saluran usus.

Diferensiasi kelompok utama Enterobacteriaceae dapat dicapai atas dasar sifat biokimia dan reaksi enzimatik di hadapan substrat tertentu. Seri tes IMViC, indol, metil-merah, Voges-Preskauer, dan pemanfaatan sitrat dapat digunakan untuk identifikasi ini.

2.1. Indol

Tryptophan merupakan asam amino esensial yang dapat mengalami oksidasi dengan cara kegiatan enzimatik beberapa bakteri. Konversi triptofan menjadi produk metabolik di mediasi oleh enzim Tryptophanase. Media ini biasanya digunakan dalam indetifikasi yang cepat. Perbenihan indol digunakan untuk melihat kemampuan bakteri mendegradasi asam amino triptofan secara enzimatik. Hasil uji indol yang diperoleh negatif karena tidak terbentuk lapisan (cincin) berwarna merah muda pada permukaan biakan, artinya bakteri ini tidak membentuk indol dari

tryptopan sebagai sumber karbon, yang dapat diketahui dengan menambahkan larutan kovaks. Asam amino triptofan merupakan komponen asam amino yang lazim terdapat pada protein, sehingga asam amino ini dengan mudah dapat digunakan oleh mikroorganisme akibat penguraian protein (Volk dan Wheeler, 1993).

2.2. MR-VP

Uji MR Perbenihan ini digunakan untuk mendeteksi bakteri yang memiliki kemampuan untuk mengoksidasi glukosa menghasilkan produk asam berkonsentrasi tinggi yang stabil sehingga menyebabkan pH media turun hingga dibawah 4,4 yang ditandai dengan hasil positif, terjadi perubahan warna menjadi merah setelah ditambahkan Methyl Red. Artinya, bakteri ini mengahasilkan asam campuran (metilen glikon) dari proses fermentasi glukosa yang terkandung dalam medium MR-VP (Lehninger, 1995).

2.3. Uji VP

Dengan hasil negatif, karena tidak terbentuk warna merah pada medium setelah ditambahkan α-napthol dan KOH, artinya hasil akhir fermentasi bakteri inibukan asetil metil karbinol (asetolin) (Volk dan Wheeler, 1993).

2.4. Simmon’s Citrate

Perbenihan ini digunakan untuk melihat kemampuan organisme enterik berdasarkan kemampuan memfermentasi sitrat sebagai sumber karbon. Perbenihan Simmon’s Citrate ini mengandung indikator biru bromtimol yang akan berubah menjadi biru pada reaksi positif dan tetap hijau jika reaksi negatif (Volk dan Wheeler, 1993).

2.5. Uji katalase

Uji katalase merupakan suatu pengujian terhadap bakteri tertentu untuk mengetahui apakah bakteri tersebut merupakan bakteri aerob, anaerob fakultatif, atau anaerob obligat dan digunakan untuk mengetahui kemampuan mikroorganisme untuk menguraikan hidrogen peroksida dengan menghasilkan

enzim katalase. Bakteri yang memerlukan oksigen manghasilkan hidrogen peroksida (H2O2) yang sebenarnya beracun bagi bakteri sendiri. Namun mereka dapat tetap hidup dengan adanya anti metabolit tersebut karena mereka menghasilkan enzim katalase yang dapat mengubah hidrogen peroksida menjadi air dan oksigen. Enzim merupakan katalisator sejati, dimana molekul ini meningkatkan dengan nyata kecepatan reaksi kimia spesifik yang tanpa enzim akan berlangsung sangat lambat. Enzim tidak dapat mengubah titik keseimbangan reaksi yang dikatalisnya, enzim juga tidak akan habis dipakai atau diubah secara permanen oleh reaksi-reaksi ini. Enzim merupakan biokatalis yang berfungsi untuk membantu proses metabolisme. Enzim memiliki kemampuan untuk mengkatalisis suatu reaksi. Suatu enzim adalah suatu katalis biologis. Hampir tiap rekasi biokimia dikatalis oleh enzim. Enzim merupakan katalis yang lebih efisien daripada kebanyakan katalis laboratorium atau industri. Enzim juga memungkinkan suatu selektivitas pereaksi-pereaksi dan suatu pengendalian laju reaksi yang tidak dimungkinkan oleh kelas katalis lain. Kespesifikan enzim disebabkan oleh bentuknya yang unik dan oleh gugus-gugus polar (atau nonpolar) yang terdapat dalam struktur enzim tersebut. Beberapa enzim bekerja bersama suatu kofaktor non protein, yang dapat berupa senyawa organik maupun anorganik. Hidrolisis Gelatin terdapat enzim-enzim yang menguraikan golongan potein disebut protenase/protease, kedua nama ini dianggap sinonim. Contoh pada hidrolisis gelatin dimana protein diperoleh dari hidrolisis kalogen, yaitu zat pada jaringan penghubung dan tendon dari hewan. Gelatin akan terurai oleh mikrobia yang mensintesis enzim proteolisis. Larutan gelatin bersifat cair pada suhu ruang atau suhu kamar dan padat apabila berada di dalam refrigerator. Dan apabila gelatin sudah dihidrolisis oleh mikroba, maka akan tetap bersifat cair (Hadioetomo, 1993).

3. Morfologi Bakteri E. coli dan S. aureus

Berdasarkan perbedaan morfologi bakteri E. Coli dan Staphylococcus aureus adalah sebagai berikut:

Dari anggota family Enterobacteriaceae. Ukuran sel dengan panjang 2,0–6,0 μm dan lebar 1,1–1,5 μm. Bentuk sel dari bentuk seperti coocal hingga membentuk sepanjang ukuran flamentous. Tidak ditemukan spora.

E. Coli batang gram negatif. Selnya bisa terdapat tunggal, berpasangan, dan dalam rantai pendek, biasanya tidak berkapsul. Bakteri ini aerobik dan dapat juga aerobik fakultatif. E. Coli merupakan penghuni normal usus, seringkali menyebabkan infeksi.

Kapsula atau mikrokapsula terbuat dari asam–asam polisakarida. Mukoid kadang–kadang memproduksi pembuangan ekstraselular yang tidak lain adalah sebuah polisakarida dari speksitifitas antigen K tententu atau terdapat pada asam polisakarida yang dibentuk oleh banyak E. Coli seperti pada Enterobacteriaceae. Selanjutnya, digambarkan sebagai antigen M dan dikomposisikan oleh asam kolanik. Penyakit yang sering ditimbulkan oleh E. Coli adalah Diare.

Morfologi Staphylococcus aureus

Bentuknya bulat atau lonjong (0,8 sampai 0,9), jenis yang tidak bergerak, tidak berspora dan gram positif. Tersusun dalam kelompok seperti buah anggur. Pembentukan kelompok ini terjadi karena pembelahan sel terjadi dalam tiga bidang dan sel anaknya cenderung dekat dengan sel induknya. Sifat biakan bersifat aerob dan tumbuh baik pada pembenihan yang sederhana pada temperatur optimum 37o_{C dan pH 7,4.}

Staphylococcus “Staph” adalah kuman yang ditemukan pada kulit dan hidung kita. Spesies Staphylococcus ini adalah gram positif yang fakultatif anaerob. Staphylococcus pathogen mempunyai sifat sebagai berikut:

– Dapat menghemolisa eritrosit

– Menghasilkan koagulasi dapat membentuk pigmen (kuning keemasan) – Dapat memecah manitol menjadi asam

Sebagian besar sebagai flora normal kulit yang tidak berbahaya. Sebagian besar Staphylococcus aureus (SA) dapat dirawat dengan antibiotik seperti methicillin (salah satu tipe penicillin). Tetapi, SA menjadi meningkat pertahanannya dengan antibiotik yang biasa digunakan. Infeksi S. aureus diasosiasikan dengan beberapa kondisi patologi, diantaranya bisul, jerawat,

pneumonia, meningitis, dan arthritits.

Identifikasi biakan mikroorganisme seringkali memerlukan pemindahan ke biakan segar tanpa terjadi pencemaran. Pemindahan mikroorganisme ini dilakukan dengan teknik aseptik untuk mempertahankan kemurnian biakan selama pemindahan berulangkali. Mikroorganisme dapat ditumbuhkan dalam biakan cair atau padat. Kekeruhan dalam kaldu menunjukkan terjadinya pertumbuhan mikroorganisme. Bila mikroorganisme menumpuk pada dasar tabung maka akan membentuk sedimen, sedangkan pada permukaan kaldu pertumbuhannya terlihat sebagai pelikel (Lay, 1998).

Dalam teknik biakan murni tidak saja diperlukan bagaimana memperoleh suatu biakan yang murni, tetapi juga bagaimana memelihara serta mencegah pencemaran dari luar. Media untuk membiakkan bakteri haruslah steril sebelum digunakan. Pencemaran terutama berasal dari udara yang mengandung banyak mikroorganisme. Pemindahan biakan mikroba yang dibiakkan harus sangat hati-hati dan mematuhi prosedur laboratorium agar tidak terjadi kontaminasi. Oleh karena itu, diperlukan teknik-teknik dalam pembiakan mikroorganisme yang disebut dengan teknik inokulasi biakan (Dwijoseputro, 1998).

Pembiakan mikrobia di laboratorium memerlukan media yang berisi zat hara serta lingkungan pertumbuhan yang sesuai bagi mikroba. Menurut Lay(Annonymous, 2016), media adalah suatu bahan yang digunakan untuk menumbuhkan mikroba yang terdiri atas campuran nutrisi atau zatzat makanan. Selain untuk menumbuhkan mikroba, media dapat juga digunakan untuk isolasi, memperbanyak, pengujian sifat-sifat fisiologis dan perhitungan jumlah mikroba.

Sulfida indole motility (SIM) adalah media agar semisolid digunakan untuk menentukan hidrogen sulfida (H 2 S) produksi, pembentukan indol, dan motilitas. Media SIM (Sulfide Indole Motility) adalah media differensial. SIM media digunakan

untuk membedakan anggota keluarga Enterobacteriaceae. Kekaburan yang menyebar dari garis menusuk menunjukkan tes positif untuk motilitas. Tabung harus dibandingkan dengan tabung tanpa inokulasi untuk membedakan antara kekaburan samar dan motilitas. Adanya warna merah setelah penambahan reagen Kovács menunjukkan produksi indole. Terbentuknya endapan hitam menunjukkan produksi H 2 S. (Anoname,2012).

Media Gula-Gula termasuk media Identifikasi, media identifikasi adalah perbenihan yang digunakan untuk menentukan jenis bakteri. Biasanya digunakan beberapa media bersama-sama. Disebut media gula-gula karena terbuat dari beberapa gula seperti, glukosa, laktosa, mannosa, maltosa, sakarosa. Media gula-gula adalah air pepton yang ditambah gula tertentu. Tujuannya adalah untuk mengetahui bakteri

memfermentasi karbohidrat. Pada uji gula-gula hanya

terjadi perubahan warna pada media gula-gula yang

berubah menjadi warna kuning, artinya bakteri ini membentuk asam dari fermentasi glukosa. Pada media gula-gula juga terbentuk gelembung pada tabung durham yang diletakan terbalik didalam tabung media, artinya hasil fermentasi berbentuk gas.Untuk medium ini dipakai air pepton, jenis gula tertentu 1%, dan indikator fenol red (indikator yang digunakan tidak harus fenol red, indikator lain yang bisa digunakan seperti BTB,warna yang dihasilkan tergantung dari indikator yang digunakan. Jika menggunakan fenol redmaka media akan berwarna merah, jika menggunakan BTB maka media akan berwarna biru.)Indikator berguna untuk melihat ada atau tidaknya pembentukan asam. Sebelum ditanami oleh bakteri medium tersebut berwarna merah (jika menggunakan indikator fenol red). Apabila sudah ditanami atau terbentuk asam maka akan berwarna kuning. Hal ini terbukti dari seluruh hasil yang diperoleh praktikan, media tersebut masih steril karena berwarna merah.Selain itu juga,

dipergunakan tabung Durham untuk mengetahui ada

tidaknya pembentukan gas sebagai hasil penguraian gula dalam medium. Tabung Dur ham diletakan terbalik di dalam tabung gula sehingga gas yang terbentuk akan tertampung di dalam tabungtersebut. Sebelum dipakai, media gula-gula ini harus selalu diperiksa apakah masih steril atau tidak. Bila telah keruh atau kuning berarti media tidak dapat dipergunakan lagi. Sifat penguraian terhadap gula dari setiap mikroba adalah berlainan, dengan demikian hasil penguraian (reaksi)ini dapat dipakai

untuk determinasi suatu jenis bakteri sehingga dapat ditentukan spesiesnya. Media ini digunakan untuk pemeriksaan bakteri E. Coli.

Metil Red adalah indikator asam-basa yang berubah menjadi merah dalammedium yang sedikit asam. Jadi, jika metil merah ditambahkan pada mediumbiakan yang mengandung glukosa yang di dalamnya organisme telah tumbuhselama 18 sampai 24 jam, warna merah menunjukkan bahwa asam organik telahterbentuk sebagai akibat fermentasi glukosa. Escherichia coli membentuk banyakasam dan adalah positif terhadap metil merah. Metil merah adalah suatu indicatoryang akan menunjukan warna merah bila pH ada di bawah 4. Hasil test positifditandai dengan terbentuknya warna merah, sedangkan warna kuning menunjukanhasil negative. Pada uji ini sebelumnya ditambahkan reagen MR (0,4% dalam alcohol 96%) kedalamnya untuk dapat mengetahui reaksi warna (Sahdan, 2010).Untuk melihat hasil positif maka ke dalam medium yang telah ditanami ditambahkan KOH kemudian dipanaskan sebentar. Dalam hal ini akan terbentuk diacethil. Diacetyl ini dengan sisa-sisa guanidine akan membentuk warna merah kecoklatan yang berupa cincin dipermukaan tabung sebagai VP (+), bila tidak terjadi apa-apa ditulis VP (-). Dengan manggunakan medium citrate menurut Simmon, merupakan medium padat yang terdiri dari mono ammonium fosfat, Nacitrate, NaCl, air , agar-agar, dan indicator Bromtymol blue. Menurut Hartini, pada uji ini medium yang tadinya berwarna hijau kebiruan, bila bereaksi positif maka akan berubah menjadi berwarna biru terang. Bila rekasi negative, maka akan tetap berwarna hijau kebiruaan(Aditia, 2014).

TSIA merupakan media yang dapat mengidentifikasi bakteri sesuai dengan karakter spesifik yang ditunjukan oleh bakteri. Media TSIA mengandung 0,1% glukosa, 1% sukrosa, 1% laktosa, ferosulfat (untuk mendeteksi produksi H2S), ekstrak jaringan (substrat pertumbuhan protein), dan indikator pH (fenol merah). Zat tersebut dimasukkan kedalam tabung reaksi sehingga menghasilkan agar miring dengan bagian pangkal yang dalam dan diinokulasi dengan menusukkan pertumbuhan bakteri ke dalam bagian pangkal. Jika memfermentasikan glukosa bagian miring dan pangkal akan berubah warna kuning akibat sejumlah kecil asam yang dihasilkan. Apabila produk fermentasi kemudian dioksidasi menjadi CO2 dan H2O dan dilepaskan dari agar miring serta dekarbosilasi oksidatif protein masih berlanjut

dengan pembentukan amino ,bagian miring berubah menjadi alkalin (merah). Reaksi oleh Klebsiella sp. pada TSIA yaitu asam/asam bewarna kuning pada bagian pangkal dan miring, dapat terdeteksi gas, tidak dihasilkan H2S.

IV. WAKTU DAN TEMPAT :

- Hari/Tanggal : Senin, 11 September 2017

- Waktu : 13.50-16.40 WITA

- Hari/Tanggal : Selasa, 12 September 2017

- Waktu : 08.50-11.40 WITA

- Hari/Tanggal : Senin, 18 September 2017

- Waktu : 13.50-16.40 WITA

- Hari/Tanggal : Senin, 19 September 2017

- Waktu : 08.50-11.40

- Tempat Praktikum : Praktikum bakteriologi dilakukan di Laboratorium Bakteriologi Jurusan Analis Kesehatan, Politeknik Kesehatan Denpasar.

V. ALAT DAN BAHAN:

a) Pembuatan Media

ALAT BAHAN MEDIA

1. Tabung Reaksi 2. Gelas beker 3. Plate 4. Gelas Ukur 5. Spatula 6. Hotplate 7. Magnetik stirrer 8. Neraca analitik 9. Api Bunsen 10. Pipet tetes 1. Akuadest 2. Alkohol 3. Aluminium foil 4. Kapas 5. Tissue 6. BTB 7. Metil Red 8. APW 9. Korek api 1. MCA 2. EMB 3. TSIA

4. Glukosa & Laktosa 5. Maltosa, Manitol, dan

Sakarosa 6. Indool/SIM 7. MRVP 8. Sitrat 9. Urease

11. Pipet ukur 5 ml, 10 ml 12. Ball pipet 13. Rak tabung 14. Inkubator 15. Tabung durham

b) Identifikasi bakteri Enterobacteriaceae

ALAT BAHAN MEDIA

1. Ose 2. Bunsen 3. BSC 4. Rak tabung 5. Inkubator 1. Akuades 2. Alcohol 3. Tissue 4. Feses 5. Korek Api 1. MCA 2. EMB 3. NA c) Uji biokimia

ALAT BAHAN/REAGEN MEDIA

1. Tabung reaksi 2. Ose 3. Api Bunsen 4. Rak tabung 5. Inkubator 1. Alcohol 2. Kertas buram 3. Karet gelang 4. Tissue 5. Pereaksi kovac

6. Indicator metal merah

1. Media gula-gula (Glukosa, Laktosa, Maltosa, Manitol, dan Sakarosa)

2. TSIA 3. MR-VP 4. SIM/Indool

5. Sitrat 6. Urease

VI. CARA KERJA :

a) Cara Kerja Pembuatan Media

1.) Maltosa, Manitol, Sakarosa, Glukosa, dan Laktosa - Dipersiapkan alat dan bahan yang akan digunakan. - Didesinfeksi area kerja menggunakan alcohol 70%.

- Ditimbang bahan maltosa, manitol, sakarosa, glukosa, dan laktosa menggunakan neraca analitik sebanyak 0,8 gram.

Rumus perhitungannya : 80 gram : 100 ml = 0,8 gram

- Setelah ditimbang, bahan dilarutkan dalam 80 ml APW. Lalu dihomogenkan menggunakan hotplate serta magnetic stirrer.

- Kemudian ditambahkan BTB sebanyak 2 tetes.

- Larutan dimasukkan ke dalam 8 tabung reaksi (yang telah berisi tabung durham) sebanyak 10 ml per masing-masing tabung dan ditutupi dengan kapas. Lalu diberi label pada tabung. Kemudian dimasukkan kedalam kulkas. - Dilakukan kembali desinfeksi area kerja menggunakan alcohol 70%.

2.) TSIA

- Dipersiapkan alat dan bahan yang akan digunakan.

- Dilakukan desinfeksi area kerja menggunakan alcohol 70%

- Ditimbang TSIA sebanyak 3,9 gram menggunakan neraca analitik, dengan rumus perhitungan = 65 gram : 1000 liter = 0,065 x 60 = 3,9 gram

NB: 60 (berapa banyak sampel yang dibuat)

- Sampel yang sudah ditimbang, dilarutkan menggunakan akuadest dan dihomogenkan dengan hotplate serta magnetic stirrer.

- Kemudian, sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang sudah berisi tabung durham sebanyak 5 ml dan diberi label serta ditutupi menggunakan kapas pada mulut tabung.

- Pada area kerja dilakukan desinfeksi kembali. 3.) Indool / SIM

- Dipersiapkan alat dan bahan yang akan digunakan.

- Dilakukan desinfeksi area kerja yang akan digunakan menggunakan alcohol 70%.

- Ditimbang bahan SIM sebanyak 1,65 gram menggunakan neraca analitik, dengan rumus perhitungan = 30 gram : 1000 ml = 0,03 gram x 55 = 1,65 gram - Dilarutkan bahan menggunakan akuades dan dihomogenkan menggunakan

hotplate serta magnetic stirrer.

- Dimasukkan kedalam autoclave pada suhu 121o_C.

- Kemudian dimasukkan kedalam tabung reaksi sebanyak 5 ml dan beri label. Dan diletakkan didalam kulkas hingga solid.

- Dilakukan kembali desinfeksi area kerja menggunakan alcohol 70%. 4.) MR-VP

- Dipersiapkan alat dan bahan yang akan digunakan.

- Didesinfeksi area kerja yang akan digunakan menggunakan alcohol 70%. - Ditimbang bahan MR-VP sebanyak 1,87 gram menggunakan neraca analitik

dengan rumus perhitungan = 17 gram : 1000 ml =0,017 x 110= 1,87 gram. - Kemudian bahan dilarutkan menggunakan akuadest sebanyak 80 ml. Dan

dihomogenkan dengan hotplate dan magnetik stirrer.

- Dimasukkan larutan MR-VP kedalam 8 tabung reaksi sebanyak 10 ml per masing-masing tabung. Dan diberi label.

- Lalu di autoclave dengan suhu 121o_C.

5.) SITRAT

- Dipersiapkan alat dan bahan yang akan digunakan.

- Didesinfeksi area kerja yang akan digunakan menggunakan alcohol 70%. - Ditimbang bahan sebanyak …menggunakan neraca analitik dengan

menggunakan rumus perhitungan =

- Bahan dilarutkan dengan akuadest sebanyak 80 ml dan dihomogenkan menggunakan hotplate dan magnetic stirrer.

- Kemudian larutan dimasukkan kedalam tabung reaksi sebanyak 10 ml per masing-masing tabung dan diberi label.

- Sampel dimasukkan kedalam autoclave dengan suhu 121o_{C, kemudian} didinginkan sampai padat lalu dimasukkan kedalam kulkas.

- Dilakukan desinfeksi kembali area kerja menggunakan alcohol 70%. 6.) UREASE

- Dipersiapkan alat dan bahan yang akan digunakan.

- Didesinfeksi area kerja yang akan digunakan menggunakan alcohol 70%. - Ditimbang bahan sebanyak….menggunakan neraca analitik dengan rumus

perhitungan :

- Bahan dilarutkan dengan akuadest sebanyak 80 ml dan dihomogenkan menggunakan hotplate serta magnetic stirrer.

- Larutan dimasukkan kedalam masing-masing tabung reaksi sebanyak 10 ml dan diberi label.

- Sampel dimasukkan kedalam autoclave dengan suhu 121o_{C, kemudian} didinginkan hingga padat dan dimasukkan kedalam kulkas.

- Dilakukan kembali desinfeksi area kerja dengan menggunakan alcohol 70%. b) Cara Kerja Identifikasi bakteri Enterobacteriaceae

1. Dipersiapkan alat dan bahan yang akan digunakan. 2. Didesinfeksi area kerja menggunakan alcohol 70%.

3. Pada media MCA/EMB/NA diberi label tanggal pembuatan. 4. Dihidupkan api Bunsen menggunakan korek api.

5. Sampel feses dihomogenkan menggunakan akuadest. Setelah itu, ose difiksasi diatas api Bunsen hingga berwarna merah menjalar.

6. Difiksasi bibir media MCA/EMB/NA diatas api Bunsen.

7. Diambil sampel feses menggunakan ose, lalu dilakukan strike pada media. Untuk kuadran 3 ke 4, ose dilakukan fiksasi. Ini bertujuan untuk peremajaan bakteri. 8. Setelah dilakukan strike, ose difiksasi kembali hingga berwarna merah menjalar.

Dan difiksasi kembali bibir media MCA/EMB/NA diatas api Bunsen. 9. Media dibungkus menggunakan kertas buram dan diisi label diatas kertas. 10. Dilakukan fiksasi kembali pada area kerja.

11. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 37o_{C selama 24 jam. Dan diamati hasilnya.} c) Cara Kerja Uji Biokimia

A. UJI GULA-GULA

1. Dipersiapkan alat dan bahan yang akan digunakan. 2. Didesinfeksi area kerja menggunakan alcohol 70%.

3. Diinokulasikan koloni dari biakan kuman ke masing-masing media gula-gula. 4. Diinkubasi pada suhu 37o_{C selama 24 jam.}

5. Diamati reaksi yang terjadi

6. Didesinfeksi kembali area kerja menggunakan alcohol 70%. B. UJI TSIA

1. Dipersiapkan alat dan bahan yang akan digunakan. 2. Didesinfeksi area kerja menggunakan alcohol 70%.

3. Diinokulasikan koloni dari biakan kuman ke TSIA dengan cara penusukan dengan ose lurus mulai dari pangkal kemiringan sampai ke dasar tabung, saat menarik ose kembali, permukaan miring media digores.

4. Diinkubasi kultur pada suhu 37o_{C selama 24-48 jam.} 5. Diamati perubahan warna yang terjadi.

6. Diinterpretasi hasil :

- Hanya meragi glukosa (basa/asam)

Lereng bersifat basa (merah) sedangkan tusukan/dasar bersifat asam (kuning). - Meragi glukosa dan laktosa (asam/asam)

Konsentrasi laktosa dalam medium TSIA 10 kali lebih besar dibandingkan glukosa. Dengan demikian setelah inkubasi 24 jam, laktosa akan tetap terdapat dalam konsentrasi yang cukup sehingga suasana asam dapat dipertahankan. - Tidak meragi glukosa atau laktosa (basa/basa), (basa/tidak ada perubahan)

Tidak terjadi fermentasi karbohidrat, bakteri menggunakan pepton menyebabkan kondisi basa karena pembentukan ammonia.

7. Dilakukan kembali area kerja menggunakan alcohol 70%. C. UJI IMVIC

- Uji produksi Indool/SIM

1. Dipersiapkan alat dan bahan yang akan digunakan.

2. Dilakukan desinfeksi area kerja menggunakan alcohol 70%.

3. Koloni dari biakan kuman diinokulasikan ke media SIM, inkubasi pada suhu 37o_{C selama 24-48 jam.}

4. Reagen kovac ditambahkan di atas permukaan media SIM, diamati reaksi yang terjadi.

5. Didesinfeksi area kerja menggunakan alcohol 70%. - Uji Metil Merah /MR

1. Dipersiapkan alat dan bahan yang akan digunakan.

3. Diinokulasikan koloni dari biakan kuman ke media MR-VP, inkubasi pada suhu 37o_{C selama 24-48 jam.}

4. Ditambahkan indikator metil merah pada biakan. 5. Diamati reaksi yang terjadi.

6. Dilakukan kembali desinfeksi area kerja menggunakan alcohol 70%. D. UJI SITRAT

1. Dipersiapkan alat dan bahan yang akan digunakan. 2. Didesinfeksi area kerja menggunakan alcohol 70%. 3. Diinokulasikan koloni dari biakan kuman ke simon sitrat 4. Diinkubasi pada suhu 37o_{C selama 24-48 jam.}

5. Diamati perubahan warna media.

6. Dilakukan kembali desinfeksi area kerja menggunakan alcohol 70%. E. UJI UREASE

1. Dipersiapkan alat dan bahan yang akan digunakan.

2. Dilakukan desinfeksi area kerja yang akan digunakan menggunakan alcohol 70%. 3. Diinokulasikan koloni dari biakan kuman ke agar urea.

4. Diinkubasi pada suhu 37o_{C selama 24-48 jam.} 5. Diamati reaksi yang terjadi.

6. Didesinfeksi area kerja menggunakan alcohol 70%.

1. Hasil dari penanaman koloni tunggal di media TSIA, tidak terjadi fermentasi karbohidat.

1. Media SIM yang akan diteteskan reagen kovac untuk uji adanya indol, motility, dan sulfur

2. Pada media urease diperoleh hasil negatif (-) yang menandakan enzim hidrolitik yang memecah senyawa amida seperti urea tidak menghasilkan ammonia yang bersifat basa

3. Pada media citrate diperoleh hasil negatif (-) yang menandakan kondisi basa tidak menyebabkan indicator bromtimol biru bekerja

4. Pada media MR-VP diperoleh hasil negatif (-). Media MR-VP ini akan dibagi kedalam 2 tabung reaksi untuk melakukan pemeriksaan MR dan VP

5. Media MR-VP di bagi ke dalam 2 tabung reaksi yang masing-masing berisi sebanyak 4 mL dan 6 mL untuk pemeriksaan MR (6 mL)

Dan VP (4 mL).

- Pada tabung MR (6 mL) diteteskan 8 tetes metil red (beric A)

- Pada tabung VP (4 mL) diteteskan 6 tetes

6. Pada media MR (6 mL) diperoleh hasil positif (+) dimana adanya perubahan warna menjadi merah yang menandakan bakteri mempertahankan produk akhir asam.

7. Pada media VP (4 mL) diperoleh hasil negatif (-) dimana tidak terjadi perubahan warna yang menandakan bakteri tidak mempertahankan produk akhir asam.

8. Pada media sakarosa diperoleh hasil negatif (-) dimana tidak terjadi perubahan warna yang pada awalnya berwarna biru dan tidak terbentuknya gas, yang menandakan bakteri tidak dapat memfermentasi sakarosa

9. Pada media laktosa diperoleh hasil positif (+) dimana terjadi perubahan warna dari biru menjadi kuning dan terbentuknya gas, yang menandakan bakteri dapat memfermentasi laktosa

10. Pada media glukosa diperoleh hasil positif (+) dimana terjadi perubahan warna dari biru menjadi kuning dan terbentuknya gas, yang menandakan bakteri dapat memfermentasi glukosa

11. Pada media manitol diperoleh hasil positif (+) dimana terjadi perubahan warna dari biru menjadi kuning dan terbentuknya gas, yang menandakan bakteri dapat memfermentasi mannitol

12. Penambahan reagen kovac untuk melakukan pemeriksaan media SIM mengenai adanya Indol, motility, dan sulfur pada media SIM

13. Pada media SIM dialakukan uji indol yang telah di tambahkan reagen kovac diperoleh hasil :

- dimana terbentuknya cincin merah, yang menandakan terjadinya reaksi indol pada media. (+)

- terdapatnya awan pada permukaan media menandakan adanya motility atau pergerakan pada media SIM. (+) - Tidak terdapat endapan hitam pada

media yang menandakan bakteri tidak menghasilkan sulfur. (-)

VIII. PEMBAHASAN :

Bakteri Escherichia coli (E. coli) merupakan suatu bakteri Gram (-) berbentuk batang, bersifat anaerobik fakultatif, dan mempunyai flagella peritrikat. (Fardiaz,1992). E. coli dapat hidup secara normal di saluran pencernaan. E. coli menjadi patogen jika jumlahnya meningkat dalam saluran pencernaan atau berada di luar usus. Oleh karena itu, pada pratikum digunakan feses sebagai sampel untuk indentifikasi bakteri E.coli yang hidup pada tubuh kemudian di tanam dalam sebuah media khusus yang berbeda dimana menghasilkan perubahan sesuai dengan kekhasan medianya masing-masing. Medium adalah suatu bahan nutrisi tempat menubuhkan bakteri di laboratorium (Tortora, 2007). Media adalah suatu substrat untuk menumbuhkan bakteri yang menjadi padat dan tetap tembus pandang pada suhu

inkubasi (Pelczar et al, 1986). Dengan menggunakan bermacam – macam media dapat dilakukan isolasi, perbanyakan, pengaujan sifat fisiologis dan perhitungan sejumlah mikroba.

Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan, media untuk menumbuhkan bakteri yaitu MCA dan EMB. Kemudian dilakukan isolasi sampel feses ke media EMB ( Eosin Methylen Blue Agar ) dan MCA ( Mac Conkey Agar ) dengan teknik streak plate. cara melakukan Teknik Piringan Goresan (Streak plate method) yaitu menginokulasi biakan dengan jarum ose pada permukaan atas agar yang penuh dengan biakan campuran (specimen feses). Ada beberapa metode penggoresan yang berbeda, namun kesemua metode bertujuan untuk meletakkan sebagian besar organisme pada beberapa goresan pertama. Apabila sebaran dilakukan dengan menggerakkan jarum ose bergantian dari satu bagian ke bagian lain cawan petri, bakteri yang tertinggal pada jarum ose semakin berkurang. Jika dilakukan secara sempurna, goresan akhir akan meninggalkan bakteri individual cukup terpisah satu sama lain, sehingga setelah mengalami pertumbuhan, koloni yang berasal dari bakteri individual akan benar-benar terpisah satu sama lain. Kemudian koloni tunggal dapat ditinggalkan kemedium steril, dan akan tumbuhlah biakan murni (Hadioetomo, 1993). MCA ( Mac Conkey Agar ) adalah media selektif dan defferensial yang digunakan untuk isolasi dan differensiasi non pemilih gram negatif batang, khususnya anggota keluarga Enterobacteriaceae dan genus Pseudomonas. Setelah pembuatan media selesai, selanjutnya dilakukan isolasi sampel feses ke media dengan cara streak, tetapi sebelum itu, sampel di encerkan dengan akuadest terlebih dahulu. Pengenceran adalah melarutkan atau melepasan mikroba dari substratnya ke dalam air sehingga lebih mudah penanganannya. Tujuan pengenceran yaitu untuk mengurangi kepadatan kepadatan bakteri yang ditanam (Fais, 2009). Pada pratikum biakan pada agar MacConkey menghasilkan koloni berwarna merah. Beberapa koloni bakteri golongan Coliform yang dapat memfermentasikan laktosa yang terdapat pada media MacConkey akan membentuk koloni berwarna, seperti koloni E.coli dan Klebsiella sp. Sedangkan Koloni yang tidak memfermentasikan laktosa seperti Proteus sp akan membentuk koloni tidak berwarna. Untuk koloni Citrobacter sp yang lambat dalam melakukan fermentasi laktosa, lama-kelamaan koloni akan membentuk warna.(Arnia and Warganegara 2013).

Media EMB (Eosin Methylen Blue Agar) mempunyai keistimewaan mengandung laktosa dan berfungsi untuk memilih mikroba yang memfermentasikan

laktosa seperti staphylococcus aureus, P. aerugenosa dan salmonella. Hasil positif adanya E. coli dapat dilihat pada media Eosin Methyline blue (EMB) karena media ini merupakan media selektif diferensial untuk mengisolasi bakteri E. coli. Pada pH yang cukup rendah fermentor laktosa seperti E.coli menghasilkan koloni ungu dengan kemilau hijau metalik, sedangkan kurang keasaman dapat menghasilkan warna coklat-merah muda koloni. Sedangkan pada fermentor nonlaktosa muncul seperti transparan atau pink. Adanya eosin dan methylen blue membantu mempertajam perbedaan tersebut. Namun demikian, jika media ini digunakan pada tahap awal karena kuman lainnya juga tumbuh terutama P. aerugenosa dan salmonella sp. Dan dapat menimbulkan keraguan. Emba yang menggunakan eosin dan methylen blue sebagai indicator memberikan perbedaan yang nyata antara koloni yang meragikan laktosa dan tidak meragikan laktosa. ( Hastowo, 1992). Media EMB mengandung enzimatik dari gelatin yang merupakan sumber nitrogen. Laktosa pada EMB membuat bakteri gram negatif tumbuh terdiferensiasi berdasarkan sifatnya sehingga memproses laktosa. Eosin dan methylene blue dari media EMB merupakan pewarna yang bergabung untuk membentuk kompleks pada pH asam dan menghambat bakteri gram positif (eosin pada tingkat lebih rendah), sementara eosin berubah warna ke ungu gelap, ketika media sekitar koloni menjadi asam (Himedia 2011). Hasil pratikum pertumbuhan bakteri pada cawan petri menghasikan koloni ungu dengan kemilauan hijau metalik sehingga menunjukkan hasil positif pada media yang diduga koloni dari bakteri E.coli dengan batang Gram negatif dan koloni berwarna merah muda dan transparan diduga adalah bakteri Enterobacteria aerogenes yang memiliki sifat gram negatif bentuk batang.

Setelah itu bakteri di remajakan ke media TSIA. Proses mengisolasi harus dilakukan dengan cara yang aseptis karena untuk menghindari adanya kontaminasi antara mikroorganisme lainnya. Mikroorganisme dapat diisolasi dan diinokulasi dalam biakan murni dengan cara memindahkannya lalu menanamnya kembali pada medium baru. TSI Agar merupakan media untuk melihat kemampuan suatu mikroorganisme dalam memfermentasikan gula. TSIA digunakan untuk pengujian biokimia untuk membedakan beberapa jenis bakteri yang termasuk kelompok Enterobacteriaceae yang bersifat gram negatif dan memfermentasikan glukosa kemudian membentuk asam, sehingga dapat dibedakan dengan bakteri gram negatif lain. Perbedaan ini didasarkan pada pola fermentasi karbohidrat dan produksi H2S pada tabung reaksi. Media ini memiliki 3 gula dalam kandungannya, yaitu glukosa,

laktosa, dan sukrosa, dengan konsentrasi 1% sukrosa, 1% laktosa, dan 0,1% glukosa. Pada uji TSIA, dibagian butt (bawah) bewarna kuning demikian pula pada bagian slant (miring) juga bewarna kuning, hal ini menunjukkan suasana yang asam pada butt dan slant. Hasil dari uji TSIA pada E. coli menghasilkan warna kuning. Hal ini dikarenakan E. coli pada media TSIA dapat memfermentasi glukosa, laktosa dan sukrosa. Daerah medium pada sampel positif tidak memperlihatkan adanya endapan hitam (negatif H2S). Hal tersebut terjadi karena E. coli tidak mampu mendesulfurasi asam amino dan methion yang menghasilkan H2S (Lebofee .2011).

Hasil positif yang ditunjukkan pada media EMB kemudian diuji ke dalam uji biokimia. Uji biokimia terdiri dari uji indol, uji merah metil, uji Voges Praskauer, dan uji sitrat (Arifin 2013). Pentingnya uji biokimia ini dapat digunakan untuk mengidentifikasi mikroorganisme secara fisiologis berdasarkan reaksi biokimia. Jenis uji biokimia akan dipengaruhi oleh faktor atau sifat mikroorganisme, jenis media atau faktor lingkungan (Harti, 2015). Uji biokimia ini dilakukan untuk menguatkan dugaan bahwa bakteri yang di isolasi merupakan bakteri E. coli. Selain di uji dengan uji biokimia, bakteri yang bersifat Gram negatif ini juga perlu di uji dengan uji gula-gula dengan tujuan untuk mengetahui kemampuan fermentasi bakteri terhadap karbohidrat. Pada Media Sulfur Indol Motility (SIM) diperoleh hasil positif pada indol dan motilitas sedangkan pada sulfur negatif karena tidak terjadi perubahan warna menjadi hitam. Motilitas positif ditunjukkan karena ditemukan adanya gelembung disekitar daerah inokulasi dan juga terbentuknya awan pada permukaan media SIM, yang berarti bahwa E. coli memiliki flagella dan dapat hidup pada kondisi anaerob. Berdasarkan hasil uji indol menunjukkan hasil positif karena setelah ditetesi reagen kovac’s yang mengandung P-dimetilaminobenzaldehid, alkohol dan HCl pekat maka terbentuk cincin merah cherry. Hal ini merupakan hasil dari pemecahan asam amino triptofan oleh bakteri E. coli (Lewerissa dan Kaihena, 2014). Sedangkan, jika hasil reaksi negatif ditandai dengan terbentuknya cincin kuning. Pentingnya uji indol ini adalah karena hanya beberapa jenis bakteri saja yang dapat membentuk indol dan uji ini dapat digunakan untuk mengidentifikasi bakteri (Agustina., dkk, 2013).

Uji Merah Metil (Methyl Red) digunakan untuk mendeteksi bakteri dengan asam campuran. Hasil pengamatan untuk uji MR pada isolat bakteri E. coli adalah positif yang ditunjukkan dengan larutan berwarna merah. Hal ini dikarenakan beberapa bakteri dapat memfermentasikan glukosa dan menjadikan berbagai produk bersifat asam sehingga dapat menurunkan pH media menjadi 5,0 atau lebih rendah.

Penambahan indikator pH merah metil ke dalam kultur bakteri setelah inkubasi menunjukkan adanya perubahan pH menjadi asam. Merah metil berwarna merah pada lingkungan dengan pH 4,4 dan berwarna kuning dalam lingkungan dengan pH 6,2 (Widyawati 2012).

Uji Voges-Proskauer yang dilakukan dalam pengamatan menunjukkan hasil negatif karena tidak adanya perubahan warna terhadap larutan VP. Uji VP digunakan untuk mengidentifikasi bakteri melewati fermentasi karbohidrat oleh bakteri menjadi 2,3 butanadiol yang dijadikan sebagai produk utama sehingga terjadi penumpukan dalam media. Bila KOH ditambahkan pada media akan membentuk senyawa (asetoin) acetylmethylcarbinol namun proses tersebut tergantung pada pencernaan glukosa terjadi, bila glukosa pecah maka akan bereaksi dengan alpha-naftol. Perubahan warna memperjelas proses dari pembentukan asetoin menjadi warna merah cherry, sedangkan hasil yang tidak terjadi pembentukan asetoin menunjukan warna kuning coklat (Sridhar 2006). Asetoin merupakan perantara dalam produksi butilen glikol. Alpha-naftol berfungsi untuk katalis dan penguat warna (Kataria et al. 2013).

Uji sitrat digunakan untuk melihat kemampuan bakteri menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon. Jika bakteri mampu menggunakan sitrat sebagai sumber karbonnya maka akan menaikkan pH dan mengubah warna medium biakan dari hijau menjadi biru. Pada pratikum ini hasilnya negatif dengan warna media yang tetap hijau karena E. coli tidak dapat menggunakan sitrat sebagai sumber karbon (Fatimawati, 2014).

Uji Urease bertujuan untuk mendeteksi penguraian urea menjadi amonia. Caranya secara aseptik diinokulasikan biakan bakteri dari media padat ke media urea agar, kemudian inkubasi 37ºC selama 24 jam. Urea dihidrolisis menjadi amonia oleh organisme positif urease akan mengatasi buffer dalam jangka menengah dan mengubahnya dari oranye menjadi merah muda. Hasil pengamatan untuk uji uraease pada E. coli menunjukan hasil negatif, hal ini dikarenakan organisme negatif urease baik tidak menghasilkan perubahan warna dalam media atau mengubahnya kuning dari produk asam (Leboffe, 2011).

Uji gula-gula ini merupakan salah satu uji biokimia untuk mengisolasi bakteri E. coli dengan cara mengetahui kemampuan bakteri tersebut memfermentasi karbohidrat. Media ini digunakan untuk mengetahui fermentasi gula-gula menjadi asam dengan atau tanpa gas. Caranya biakan bakteri dari media padat diinokulasikan secara aseptik ke larutan glukosa, tabung Durham diletakkan terbalik dalam

masing-masing tabung sebagai indikator adanya produksi gas kemudian inkubasi 37ºC selama 24 jam. Hasil positif ditandai dengan perubahan media menjadi kuning, sedangkan jika gas positif akan tampak gelembung udara pada tabung durham. Pengujian uji gula-gula yang terdiri dari media glukosa, laktosa, sakarosa, maltosa, dan manitol. Uji gula-gula menunjukkan reaksi positif dengan terjadinya perubahan warna menjadi kuning dan menghasilkan gas. Ini menunjukkan bahwa bakteri ini mampu memfermentasi karbohidrat (Cappucino dkk.2002). Pengujian dengan media sakarosa tidak mengalami perubahan warna menjadi kuning berarti bakteri tidak dapat memfermentasi sakarosa. Hajil uji pada media mannitol menunjukkan hasil positif yaitu dengan perubahan warna menjadi kuning. Perubahan warna menandakan bahwa bakteri memfermentasi mannitol. Hasil uji terhadap media maltosa juga mengalami perubahan warna menjadi kuning yang menandakan bakteri dapat memfermentasi maltosa. Hasil uji laktosa juga didapatkan hasil positif. Hal ini terjadi karena media laktosa mengandung gula, air pepton dan fenol red, sehingga E. coli dapat mengurai media laktosa karena memiilki enzim beta-galaktosidase. Media glukosa didapatkan positif yang ditandai dengan adanya perubahan warna pada media tersebut. Hal ini menunjukkan bahwa E. coli dapat mengurai glukosa dan memiliki enzim beta galaktisidase. Pada media glukosa juga terbentuk gelembung pada tabung durham yang diletakan terbalik didalam tabung media dan menunjukkan hasil fermentasi berbentuk gas (Oktarina, 2010).

IX. KESIMPULAN :

Berdasarkan praktikum Identifikasi Bakteri Enterobacteriaceae yang menggunakan sampel feses manusia untuk pemeriksaan yang diperoleh dari situs microrao dapat diidentifikasikan bahwa jenis bakteri ini adalah bakteri E.coli: 98.07 %,. Pada uji gula-gula bakteri tidak memfermentasi sakarosa. Pada media urea diperoleh hasil negative, yang tidak menghasilkan ammonia yang bersifat basa. Pada uji MR dengan hasil positive, adanya perubahan warna menjadi merah yang menandakan bakteri mempertahankan produk akhir asam. Pada Uji VP negative, tidak terjadi perubahan warna , karena tidak terbentuk warna merah pada medium setelah ditambahkan α-napthol dan KOH.

1. Annonymous, 2016, Panduan Praktikum Mikrobiologi, tersedia: 2. https://www.usd.ac.id/fakultas/farmasi/f1l3/PanduMikroBio.pdf 3. Annonimous, Sekilas Media Gula-Gula, tersedia:

4. http://www.academia.edu/9923615/SEKILAS_MEDIA_GULA-GULA 5. Aditia Lasinrang, 2014, Laporan Lengkap Praktikum Mikrobiologi(Uji

Biokimia IMVIC), tersedia:

6. http://www.academia.edu/16007244/Laporan_Praktikum_Mikrobiologi_Uj i_Biokimia_IMVIC_

7. Dewi Ayu,Bab II tinjauan pustaka, tersedia:

https://www.google.co.id/http/eprints.undip.ac.id/DEWIAYU_G2A009195_B AB2KTI.pdf

8. Arnia, and Efrida Warganegara. 2013. “Identifikasi Kontaminasi Bakteri Coliform Pada Daging Sapi Segar Yang Dijual Di Pasar Sekitar Kota Bandar Lampung.” Medical Journal of Lampung University, 1–8. 9. Di, Keumamah, Pasar Tradisional, and Aceh Besar. 2017. “Escherichia

Coli, Staphylococcus Aureus, Keumamah” 1 (3): 574–83.

10. Huda, Chairul. 2012. “Penapisan Aktivitas Antibakteri Dari Bakteri Yang Berasosiasi Dengan Karang Lunak Sarcophyton S P” 4: 69–76.

11. Lingkungan, Kesehatan, Dan Pengendalian, and Penyakit Jakarta. 2016. “ANALISIS BAKTERI Escherichia Coli PADA MAKANAN SIAP SAJI DI KANTIN RUMAH SAKIT X DAN KANTIN RUMAH” 12 (2): 21– 34.

12. Iswara, Arya. 2015. “POLA SENSITIVITAS Eschericia Coli TERHADAP ANTIBIOTIK METRONIDAZOLE,” 273–77.

13. (Besar, 2016)Besar, A. (2016). Issn. 2527-6395, 1, 222–228.

14. Control, Q. (2011). EMB Agar. HiMedia Laboratories, 1–2. Retrieved from http://himedialabs.com/TD/M317.pdf

coli O157 : H7 pada Feses Sapi di, 8(1), 30–35.

16. Pelczar. 1986 .Dasar-DasarMikrobiologi. Jakarta : UI Press

17. Tortora. 2004. Microbiology an Introduction. San Fransisco: Benjamin Cumming

18. Talaro K.P.1999. Foundation Mikrobiologi third edition.MC Graw Hill 19. Dwidjoseputro.1990 .dasar-dasar microbiologi. Djambatan: Malang 20. Murray. 2005. Buku Ajar Mikrobiologi. Penerbit Buku Kedokteran EGC:

Jakarta.

21. Pelczar. 2008. Dasar-dasar Mikrobiologi. Djambatan, Malang.

22. Volk and Wheleer. 1993. Analisis Praktikum Mikrobiologi Umum untuk Perguruan Tinggi. UGM Press, Yogyakarta.

23. Hadioetomo. 1993. Mikrobiologi Kedokteran. Salemba Medika, Jakarta. 24.

http://nunil08.student.ipb.ac.id/2010/06/19/uji-biokimia-metabolisme-bakteri/ (Diakses pada: 23 April 2014, pukul: 21.00 WITA)

25. Lehninger. 1995. Microbiology: a Laboratory Manual.Adison-Wesley. Publishing company: California.

LAMPIRAN FOTO

1. Penimbangan Urea Agar sebanyak 1,05 gram

2. Media Urea Agar

3. Penimbangan citrate agar sebanyak 1,15 gram

4. Media citrate agar

6. Media urea agar yang sudah dilarutkan

7. Pembuatan media citrate agar

8. Media citrate agar yang sudah dilarutkan

9. Proses menghomogenkan media urea agar dengan menggunakan magnetic stirrer

10. Proses menghomogenkan media citrate agar dengan menggunakan magnetic stirrer

11. Proses penuangan urea agar sebanyak 5 mL ke dalam tabung reaksi menggunakan pipet ukur.

12. Proses penuangan citrate agar sebanyak 5 mL ke dalam tabung reaksi menggunakan pipet ukur.

13. Didiamkan media urea agar di dalam suhu ruang hingga memadat dengan posisi dimiringkan.

14. Didiamkan media urea agar di dalam suhu ruang hingga memadat dengan posisi dimiringkan.

15. Media urea agar dan citrate agar yang sudah dibungkus dan kemudian media disimpan di dalam pendingin.

2. Hasil dari penanaman koloni tunggal di media TSIA

1. Hasil penanaman spesimen feses pada media EMB

2. Hasil penanaman spesimen feses pada media MCA

1. Proses fiksasi ose di atas api bunsen

2. Pengambilan koloni tunggal di media NA

3. Proses penanaman bakteri di media gula-gula

4. Proses penanaman bakteri di media urease

5. Proses penanaman bakteri di media citrate

6. Proses penanaman bakteri di media indol

7. Proses penanaman bakteri di media MR-VP

LEMBAR PENGESAHAN

Denpasar, 26 September 2017 Mahasiswa ( Kelompok 8 ) Mengetahui

Dosen Pembimbing 1 Dosen Pembimbing 2

Nyoman Mastra, SKM., S.Pd., M.Si I Nyoman Jirna, SKM., M.Si

Dosen Pembimbing 3 Dosen Pembimbing 4

Burhannuddin, S.Si., M.Biomed Mardiyah Hayati, Amd.AK

Dosen Pembimbing 5

LAPORAN BAKTERI

“IDENTIFIKASI BAKTERI ENTEROBACTERIACEAE”

OLEH: KELOMPOK 8 NAMA ANGGOTA :

1. Ni Komang Dwi Paryanti 010

2. Dwi Kartika Sari 032

3. Kadek Putri Dwi Cahyanti 038

4. Ni Made Dwi Adnyani 041

6. Komang Feri Kharisma 048

7. Ade Nandani Widyastuti 055

JURUSAN ANALIS KESEHATAN POLITEKNIK KESEHATAN DENPASAR